Techniques et pratiques de culture cellulaire pour éviter la contamination par des champignons et des bactéries dans le laboratoire de culture cellulaire de recherche

La culture cellulaire est une compétence délicate nécessaire à la culture de divers types de cellules et de tissus dans un environnement de laboratoire contrôlé. La principale préoccupation lors de l’exécution de travaux de culture cellulaire est la contamination. Cette contamination peut prendre la forme de bactéries, de moisissures ou de mycoplasmes.

Les techniques et les pratiques décrites dans cette vidéo garantiront que vos cellules restent viables, saines et exemptes de contamination. Ces pratiques doivent être strictement respectées et tout le personnel de laboratoire doit recevoir une formation au moins une fois par an. Avant de commencer à travailler, portez une blouse de laboratoire propre destinée à être utilisée dans la salle de culture cellulaire seulement.

Portez des gants neufs qui n’ont touché aucune autre surface. Assurez-vous que les gants sont bien ajustés. Les gants sans poudre de nitrile sont les meilleurs.

La blouse de laboratoire et les gants n’ont pas besoin d’être stériles. Pour vous préparer au travail, vaporisez des gants, des manches de blouse de laboratoire et l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique avec de l’éthanol à 70%. Vaporisez la surface de travail, les côtés, l’arrière, tous les éléments de l’armoire et du panneau de verre avant, à la fois de l’intérieur et de l’extérieur.

Essuyez la surface de travail et le panneau de verre à l’aide d’une serviette en papier non pelucheuse. Prenez le temps d’organiser l’espace de travail à l’intérieur de l’armoire. Gardez les bains d’eau à l’intérieur de la salle de culture cellulaire et utilisez-les uniquement à des fins de culture cellulaire, comme le chauffage des milieux ou la décongélation des cellules.

Les bains-marie doivent être vidangés et lavés une fois par semaine. Limitez la quantité d’articles apportés dans l’armoire et n’interrompez pas le flux d’air à l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique en bloquant les grilles avant ou arrière. Vaporisez tous les articles placés à l’intérieur de l’armoire avec de l’éthanol à 70% et essuyez-les.

Commencez par vaporiser le haut de la bouteille de média et descendez. Avec une serviette en papier propre, commencez par le haut de la bouteille de média pour l’essuyer, en progressant progressivement vers le bas. Ne remontez pas vers le bouchon.

La façon dont ces armoires fonctionnent est qu’elles tirent l’air de la pièce et de l’armoire elle-même à travers les grilles avant et arrière. L’air va vers l’arrière de l’armoire et jusqu’au sommet. Là, l’air contaminé passe à travers un tas de filtres, et une partie de l’air propre filtré est poussée vers le bas sur la zone de travail dans l’armoire.

Si l’armoire est assez grande pour accueillir des pipettes sérologiques, elles peuvent être placées à l’intérieur, sinon, elles peuvent être stockées dans un récipient monté à l’extérieur de l’armoire. Il est recommandé de vérifier de chaque côté de la pipette encastrée la présence de trous, de déchirures ou de perforations dans l’emballage avant utilisation. N’arrachez pas l’emballage.

Au lieu de cela, pelez doucement les extrémités de l’emballage. Insérez la pipette sérologique dans un auxiliaire de pipette et retirez l’emballage en un seul mouvement de fluide. Ne survolez pas les bouteilles ou les flacons ouverts.

Il n’est pas recommandé d’atteindre une bouteille ou une fiole ouverte ou de travailler au-dessus de flacons ouverts. Le flux d’air à l’intérieur des armoires pousse vers le bas sur tout ce qui se trouve à l’intérieur. Tendre la main permettra à votre manche ou à votre gant d’être au-dessus d’articles qui pourraient potentiellement pousser toute contamination présente sur votre manche, par exemple, dans votre culture cellulaire.

Dans la mesure du possible, ne versez pas de liquides. Au lieu de cela, ajoutez-les à l’aide d’une pipette sérologique. Bien mélanger le contenu et parapher la bouteille.

Notez ce que le média est complété. Si vous travaillez avec des cultures adhérentes et que vous avez besoin d’un flacon en plastique, vaporisez tout l’emballage et mettez-le à l’intérieur. Chaque fois que vos gants ont séché, vaporisez-les à nouveau avec de l’éthanol.

Lorsque vous travaillez avec une lignée cellulaire adhérente, utilisez des pipettes en verre autoclavées ou des pipettes en plastique stériles jetables pour aspirer les fluides ou les solutions de lavage. Retirez délicatement le capuchon métallique du récipient de stockage. Isoler une pipette en verre en secouant doucement le récipient en biais.

Lorsque vous entrez dans le récipient, évitez de toucher d’autres pipettes. Manipulez la pipette choisie à partir d’une seule extrémité. Remplacez rapidement les bouchons des bouteilles et des flacons dès que possible.

Placez des bouchons sur la surface de travail à l’envers afin que la jante ne touche pas la surface de travail. Ne saisissez pas le capuchon par le haut ou le bas. Au lieu de cela, touchez les capuchons sur les côtés.

Lorsque vous aspirez des liquides, utilisez un ballon à piège à vide situé à l’extérieur de l’armoire dans un récipient secondaire sur le sol. Les déchets seront créés en travaillant à l’intérieur de l’armoire. Parce que déplacer les mains dans et hors de l’armoire interrompra trop souvent le flux d’air, il est bon de laisser temporairement les déchets à l’intérieur de l’armoire.

Placez-le sur le côté pour qu’il n’interrompe pas votre travail. Vaporisez généreusement des gants avec de l’éthanol à 70 % chaque fois qu’ils deviennent secs. Frottez vos mains ensemble pour qu’elles ne soient pas mouillées.

Un petit mot sur les pipettes sérologiques. S’ils touchent accidentellement quelque chose d’autre dans le capot, n’hésitez pas à les jeter. Il est préférable de recommencer à zéro avec une pipette sérologique propre au lieu d’en utiliser une qui pourrait être contaminée.

Avant de placer des cellules dans l’incubateur, vérifiez à quoi elles ressemblent au microscope. Les cellules individuelles doivent être observées. Cela indique que les cellules ont été complètement remises en suspension.

Ne parlez pas, n’éternuez pas, ne toussez pas et ne respirez pas fortement dans les incubateurs. Ouvrez et fermez rapidement les portes de l’incubateur. Les laisser ouverts plus longtemps que nécessaire peut permettre aux contaminants présents dans l’air de pénétrer dans les incubateurs.

Assurez-vous que les bouchons de toutes les bouteilles sont bien fermés avant de les retirer de l’armoire. Les médias sont sensibles à la lumière. Il doit être conservé dans l’obscurité à quatre degrés Celsius lorsqu’il n’est pas utilisé.

Vaporisez à nouveau l’intérieur de l’armoire avec de l’éthanol à 70% une fois les travaux de culture cellulaire terminés et essuyez la surface avec une serviette en papier. Videz le sac à déchets pour risques biologiques. Répétez ce processus et remplacez les gants lorsque vous passez à une autre lignée cellulaire.

Lorsque vous travaillez avec des cultures en suspension cultivées dans des flacons en verre, assurez-vous que les gants sont mouillés. Touchez la feuille d’aluminium avec vos gants humides, puis vaporisez uniquement le fond de la fiole avant de la placer à l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique. Lorsque vous prélevez un échantillon pour le comptage cellulaire, ne retirez qu’un seul tube de 1,5 ml de son contenant.

Ne touchez aucun des autres tubes. Placez le capuchon à l’envers sur la surface de travail. Ne touchez pas la jante intérieure.

Manipulez-le avec soin sur les côtés et remplacez-le une fois que vous avez terminé. Lors de la manipulation des cellules de suspension et des flacons en verre, retirez soigneusement le morceau de feuille d’aluminium plié qui recouvre tout le col du flacon. Tirez doucement sur les quatre coins et placez la feuille à l’envers sur la surface de travail.

Manipuler la fiole en verre par le bas seulement. Ne le touchez pas du cou une fois que la feuille est enlevée. Utilisez une pipette sérologique de 1 ml pour prélever un échantillon pour le comptage cellulaire.

Ne laissez pas le média couler sur le côté des flacons. Si c’est le cas, vaporisez de l’éthanol à 70% sur une serviette en papier et nettoyez-la immédiatement. Assurez-vous que les bouchons ou le papier d’aluminium sont serrés avant de retirer les bouteilles ou les flacons des armoires de sécurité biologique.

Utilisez des incubateurs distincts pour différents types de cellules. Cela permettra d’éviter la contamination croisée de différents types de cellules. Il est recommandé de placer le ballon piège à vide pour la collecte des déchets liquides à l’extérieur de l’armoire sur le sol dans un récipient secondaire étiqueté déchets.

Le tuyau est connecté à un filtre qui est remplacé sur une base mensuelle. Le tuyau pénètre par le côté de l’armoire. Enlevez les déchets biologiques une fois les travaux terminés.

Gardez un protocole de lavage de verre sur le mur près de l’évier. Tout d’abord, faites tremper les cellules jetées avec 10% d’eau de Javel pendant environ cinq minutes. Ensuite, jetez le mélange d’eau de Javel et rincez soigneusement la fiole avec de l’eau.

Ajouter du savon avec de l’eau, frottez-le très bien avec une brosse, rincez avec plus d’eau. Et puis la dernière étape consiste à rincer la verrerie avec l’eau DI sur le robinet à droite. Lavez les flacons en verre dès que possible, frottez bien la verrerie.

Les cellules Sf9 quitteront ce bord de cellules mortes s’il n’est pas nettoyé correctement. Utilisez ces flacons uniquement pour la culture cellulaire, la verrerie de culture cellulaire autoclave au lieu de l’envoyer à une installation de lavage de verre. Utilisez le cycle de vide sur l’autoclave pendant 40 minutes de temps stérilisé et 40 minutes de temps sec.

Gardez-le séparé de la verrerie dans la zone principale du laboratoire. Organisez la salle de culture cellulaire de manière à ce que toutes les fournitures soient situées dans une seule zone, minimisant ainsi la nécessité pour les membres du laboratoire de quitter la salle de culture cellulaire à la recherche de fournitures. Étiqueter toutes les bouteilles en plastique utilisées pour prélever des cellules et réutilisées en culture cellulaire par la suite, pour une utilisation de culture cellulaire seulement.

Utilisez les flacons de culture cellulaire désignés pour un type de cellule spécifique. Conservez ces flacons dans la salle de culture cellulaire pour un accès facile. Pour les cultures cultivées en suspension, la moisissure sera reconnue comme des boules flottantes dans les médias.

Quant à la contamination bactérienne, elle rendra le média blanc et trouble. De même, pour les cellules adhérentes, la contamination par les moisissures peut être facilement reconnue comme des taches floues. La contamination bactérienne deviendra normalement claire, blanche et trouble.

De nombreuses espèces de mycoplasmes peuvent être identifiées de manière fiable à l’aide d’un test basé sur la PCR. La bande de gauche montre les normes de poids moléculaire pour l’ADN. Les quatre bandes de droite sont des témoins positifs.

Aucune bande n’apparaît sous les types de cellules testées car le mycoplasme n’a pas été détecté. Les milieux de culture cellulaire changeront de couleur du rouge au jaune si des indicateurs de pH sont présents. La couleur jaune indique que le pH est bas et que le média doit être remplacé.

Si d’autres excroissances ou formes de cellules sont observées au microscope optique lors du comptage cellulaire, cela peut indiquer une contamination. Notez qu’un nettoyage complet de l’hémocytomètre doit être effectué avant le comptage des cellules, car ce type de débris peut être présent uniquement sur l’hémocytomètre et non dans la culture cellulaire elle-même. Bien que la contamination soit l’une des principales préoccupations lors de l’exécution de travaux de culture cellulaire, ces risques peuvent être atténués en suivant les pratiques et les techniques décrites dans cette vidéo.

Si un test mensuel de mycoplasmes est effectué chaque mois, que le personnel de laboratoire est formé chaque année et que ces pratiques sont strictement respectées, vos cellules resteront saines et exemptes de contamination. Cela aidera également à réduire les coûts associés à l’achat de milieux de culture cellulaire coûteux, à l’achat de nouvelles cellules et réduira les temps d’arrêt de décontamination des incubateurs. Rappelez-vous, la clé d’une culture cellulaire réussie est une action précoce afin de prévenir la contamination en premier lieu.