Name: Techniques et pratiques de culture cellulaire pour éviter la contamination par des champignons et des bactéries dans le laboratoire de culture cellulaire de recherche (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T13:40:00.000+00:00
Duration: 13 min 39 s
Description: Apprenez les techniques de culture cellulaire pour prévenir la contamination par champignons, bactéries et mycoplasmes en laboratoire. Ces pratiques garantissent la viabilité et la santé des cellules.

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Ce travail a été rendu possible grâce au financement du Howard Hughes Medical Institute (HHMI). Nous tenons à remercier notre chef de laboratoire, Jue Chen, pour la lecture du manuscrit et pour son soutien continu, Donna Tallent pour ses modifications et commentaires utiles, et Jeff Hennefeld du département des technologies de l’information de l’Université Rockefeller pour son aide avec la composante vidéo de ce manuscrit.

1. Préparatifs 
<ol><li>Généralités<ol><li>Portez une blouse de laboratoire propre conçue pour être portée uniquement dans la salle de culture cellulaire et dans aucune autre partie du laboratoire. REMARQUE: La blouse de laboratoire n’a pas besoin d’être stérile.</li>
		<li>Portez des gants neufs qui n’ont touché aucune autre surface. Assurez-vous que les gants sont bien ajustés. Les gants en nitrile sans poudre sont les meilleurs. REMARQUE: Les gants n’ont pas besoin d’être stériles.</li>
		<li>Pour vous préparer au travail, vaporisez les gants, les manches de la blouse de laboratoire et l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique avec 70% d’EtOH. Essuyez la surface de travail et le panneau de verre à l’aide d’une serviette en papier non pelucheuse. REMARQUE: L’utilisation de 70% d’EtOH tue les bactéries avec la plus grande efficacité16. La serviette en papier n’a pas besoin d’être stérile.</li>
		<li>Conservez les bains d’eau à l’intérieur de la salle de culture cellulaire et ne les utilisez que pour réchauffer les milieux de culture ou décongeler les cellules. Vidangez et lavez les bains-marie une fois par semaine, en suivant les instructions de nettoyage du fabricant.</li>
	</ol></li>
	<li>À l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique<ol><li>Limitez le nombre d’articles apportés dans l’armoire. N’interrompez pas le flux d’air à l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique en bloquant les grilles avant ou arrière. REMARQUE : Voir la figure 1 pour une explication de la façon dont l’air circule à l’intérieur d’une armoire.</li>
		<li>Vaporisez tous les articles placés à l’intérieur de l’armoire avec 70% d’EtOH et essuyez-les. Commencez par vaporiser le haut de la bouteille de média et travaillez vers le bas. De même, avec une serviette en papier propre, essuyez-la en la séchant progressivement jusqu’au fond. Ne remontez pas vers le bouchon.</li>
		<li>Si l’armoire est assez grande pour accueillir des pipettes sérologiques, elles peuvent être placées à l’intérieur, sinon elles peuvent être stockées dans un récipient monté à l’extérieur de l’armoire. Vérifiez de chaque côté de la pipette enveloppée s’il n’y a pas de trous, de déchirures ou de perforations dans l’emballage avant utilisation. N’arrachez pas l’emballage. Au lieu de cela, décollez doucement les extrémités de l’emballage, insérez la pipette sérologique dans un support de pipette et retirez l’emballage en un seul mouvement fluide.</li>
		<li>Ne survolez pas les bouteilles ou les flacons ouverts; tendre la main au-dessus de bouteilles ou de flacons ouverts, ou ouvrir des articles par-dessus des articles déjà ouverts dans l’enceinte de sécurité biologique. REMARQUE: Le flux d’air à l’intérieur de l’armoire pousse vers le bas sur la surface de travail, de sorte que toute contamination présente sur le manchon, par exemple, peut pénétrer dans les cultures cellulaires.</li>
		<li>Ne versez pas de liquides. Au lieu de cela, ajoutez-les à l’aide d’une pipette sérologique. Après avoir complété le média, mélangez soigneusement le contenu et parapez la bouteille. Assurez-vous également d’inclure une étiquette pour ce que le média a été complété.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Travailler avec des lignées cellulaires adhérentes
<ol><li>Si une fiole en plastique est nécessaire, vaporisez le sac entier et placez-le à l’intérieur de l’armoire.</li>
	<li>Utilisez des pipettes en verre autoclavées ou des pipettes en plastique stériles jetables pour aspirer le média ou les solutions de lavage. Retirez délicatement le capuchon métallique du récipient de stockage. Isoler une pipette en verre en secouant doucement le récipient en biais. Lorsque vous entrez dans le récipient, évitez de toucher d’autres pipettes. REMARQUE: Manipulez la pipette choisie à partir d’une seule extrémité.</li>
	<li>Replacez rapidement les bouchons des bouteilles dès que possible. Placez les capuchons sur la surface de travail à l’envers afin que la jante ne touche pas la surface de travail. Ne saisissez pas le capuchon par le haut ou le bas; Au lieu de cela, touchez les capuchons sur les côtés.</li>
	<li>Lorsque vous aspirez des liquides, utilisez un ballon à piège à vide situé à l’extérieur de l’armoire dans un récipient secondaire sur le sol. REMARQUE: Ne jetez pas de déchets liquides dans des sacs à déchets biologiques car les sacs fuient. Les déchets seront créés en travaillant à l’intérieur de l’armoire. Déplacer les mains dans et hors de l’armoire trop souvent interrompra le flux d’air. Laissez temporairement les déchets à l’intérieur de l’armoire. Placez-le sur le côté pour qu’il n’interrompe pas le travail.</li>
	<li>Vaporisez généreusement les gants avec 70% d’EtOH chaque fois qu’ils deviennent secs. Frottez les mains ensemble pour que les gants ne soient pas mouillés.</li>
	<li>Si une pipette sérologique touche par erreur quelque chose dans l’armoire, n’hésitez pas à la jeter. Recommencez avec une pipette sérologique propre au lieu d’en utiliser une qui pourrait être contaminée.</li>
</ol>4. Vérification et stockage des cellules 
<ol><li>Avant de placer des cellules dans l’incubateur, vérifiez à quoi elles ressemblent au microscope. Si les cellules ont été complètement suspendues, des cellules individuelles doivent être observées.</li>
	<li>Ne parlez pas, n’éternuez pas, ne toussez pas et ne respirez pas fortement dans les incubateurs. Ouvrez et fermez rapidement les portes de l’incubateur. Laisser les portes ouvertes plus longtemps que nécessaire peut permettre aux contaminants présents dans l’air de pénétrer dans les incubateurs. REMARQUE: Le port d’un masque lorsque vous travaillez dans la salle de culture cellulaire peut aider, car des mycoplasmes peuvent être présents dans la bouche humaine. Évitez d’utiliser des téléphones cellulaires dans la salle de culture cellulaire, car il n’est pas recommandé de parler.</li>
	<li>Assurez-vous que les bouchons de toutes les bouteilles sont bien fermés avant de retirer les bouteilles de l’armoire.</li>
	<li>Conserver les milieux de culture cellulaire dans l’obscurité à 4 °C lorsqu’ils ne sont pas utilisés, car ils sont sensibles à la lumière.</li>
	<li>Vaporisez à nouveau l’intérieur de l’armoire avec 70% d’EtOH une fois le travail de culture cellulaire terminé et essuyez la surface avec une serviette en papier. Videz les sacs à déchets biologiques dangereux. Répétez ce processus et remplacez les gants lorsque vous passez à une autre lignée cellulaire.</li>
</ol>5. Travailler avec des lignées cellulaires en suspension
<ol><li>Pour les cellules en suspension cultivées dans des flacons en verre, assurez-vous que les gants sont soigneusement pulvérisés avec 70% d’EtOH, puis touchez la feuille d’aluminium avec les gants humides et vaporisez uniquement le fond de la fiole avant de la placer à l’intérieur de l’armoire.</li>
	<li>Lorsque vous prélevez un échantillon pour le comptage cellulaire, ne retirez qu’un seul tube de 1,5 mL de son contenant. Ne touchez pas d’autres tubes. Placez le capuchon à l’envers sur la surface de travail. Ne touchez pas la jante intérieure. Manipulez-le avec soin sur les côtés et remplacez-le une fois terminé.</li>
	<li>Retirez délicatement le morceau de papier d’aluminium plié à double plié qui recouvre tout le col de la fiole. Manipulez le flacon en verre par le bas seulement – ne le touchez pas du cou – une fois que la feuille est enlevée. Utilisez une pipette sérologique de 1 mL pour prélever un échantillon pour le comptage cellulaire.</li>
	<li>Ne laissez pas le média s’égoutter sur le côté des flacons; si c’est le cas, vaporisez une serviette en papier avec 70% d’EtOH et nettoyez-la immédiatement.</li>
	<li>Assurez-vous que les bouchons et le papier d’aluminium sont serrés avant de retirer les bouteilles ou les flacons des enceintes de sécurité biologique.</li>
</ol>6. Incubation cellulaire 
<ol><li>Utilisez des incubateurs distincts pour différents types de cellules afin d’éviter la contamination croisée des différents types de cellules.</li>
</ol>7. Collecte des déchets liquides
<ol><li>Recueillir les déchets liquides dans un ballon piège à vide situé à l’extérieur de l’armoire sur le sol dans un récipient secondaire étiqueté « Déchets ». REMARQUE: Le tuyau est connecté à un filtre à haute efficacité absorbant les particules (HEPA), qui est remplacé sur une base mensuelle.</li>
</ol>8. Nettoyage
<ol><li>Retirez le sac à déchets contre les risques biologiques et lavez les flacons en verre dès que possible. Gardez un protocole de lavage des vitres près de l’évier. Voir le dossier supplémentaire 1 pour le protocole de lavage.</li>
	<li>Autoclavez la verrerie de culture cellulaire au lieu de l’envoyer à une installation de lavage de verre. Gardez-le séparé de la verrerie dans la zone principale du laboratoire. REMARQUE: Les cellules SF-9 laissent un bord de cellules mortes sur le côté des flacons si le verre n’est pas bien nettoyé. Voir le fichier supplémentaire 1 pour le protocole d’autoclave.</li>
</ol>9. Organisation 
<ol><li>Organisez la salle de culture cellulaire de manière à ce que toutes les fournitures soient situées dans une seule zone, minimisant ainsi la nécessité pour les membres du laboratoire de quitter la salle à la recherche de fournitures.</li>
	<li>Étiquetez toutes les bouteilles en plastique utilisées pour prélever des cellules et réutilisées en culture cellulaire par la suite comme « Pour culture cellulaire uniquement ». Utilisez les flacons de culture cellulaire désignés pour un type de cellule spécifique. Conservez les flacons dans la salle de culture cellulaire pour un accès facile.</li>
</ol>10. Identification de la contamination par les bactéries, les champignons et les mycoplasmes 
REMARQUE: Ne pas suivre le flux de travail ci-dessus peut entraîner une contamination bactérienne, fongique et mycoplasmique.
<ol><li>Toujours avant de commencer à travailler, observez les flacons pour une turbidité importante, une croissance supplémentaire sous forme de boules floues et des accumulations denses de cellules sur le côté, qui sont tous des indicateurs de contamination. REMARQUE: Un œil expérimenté peut faire la différence entre la turbidité causée par la contamination microbienne et les cellules réelles. Alors que les cellules font apparaître le milieu normalement clair trouble, la contamination bactérienne provoque une turbidité importante avec une couleur blanche.<ol><li>Identifiez visuellement la contamination par les moisissures en notant l’apparition de boules rondes et floues flottant dans le milieu (voir la figure 2).</li>
		<li>Identifiez visuellement la contamination bactérienne si le milieu est trouble, blanc ou turbulent (voir la figure 2).</li>
		<li>Identifier la contamination par les mycoplasmes en effectuant un test mensuel des mycoplasmes. Un test basé sur la PCR demande aux utilisateurs de prélever un échantillon de cellules de 1,5 mL, d’effectuer un comptage cellulaire en utilisant 10 μL, de diluer à 0,08 x 106 cellules / mL, de faire tourner les cellules, de lyser les cellules à l’aide du tampon contenu dans le kit et de tourner vers le bas une dernière fois. Le surnageant est incubé avec des amorces qui amplifient une gamme d’espèces de mycoplasmes. Exécutez un gel d’ADN pour visualiser les bandes. L’absence de bandes signifie que le mycoplasme n’est pas identifié. REMARQUE: Ce contaminant majeur peut être présent dans la bouche humaine. Il est recommandé de tester la contamination des cellules par les mycoplasmes après les avoir décongelées et avant de les utiliser à des fins expérimentales. Ensuite, surveillez les cellules pour la contamination par les mycoplasmes une fois par mois. De nombreuses entreprises proposent des kits de test mycoplasmiques. Choisissez-en un qui convient.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

L’auteur n’a pas d’intérêts contradictoires.

Bien que la contamination soit l’une des principales préoccupations lors de l’exécution de travaux de culture cellulaire, les pratiques et les techniques décrites dans ce manuscrit aideront à atténuer les risques. Les étapes critiques comprennent le port d’une blouse de laboratoire propre, qui n’est utilisée que dans la salle de culture cellulaire, l’utilisation de gants propres et sans poudre qui sont souvent pulvérisés avec 70% d’EtOH et qui sont changés lors du passage d’une lignée cellulaire à l’autre, encourager cha...

La culture cellulaire a de nombreuses utilisations dans le laboratoire de recherche. Depuis les origines de la culture cellulaire au début du 20e siècle, les lignées cellulaires ont contribué à faire progresser la science. Les lignées cellulaires présentent plusieurs avantages; Diverses lignées cellulaires peuvent aider les chercheurs à étudier la biologie cellulaire, à produire des baculovirus pour des études plus approfondies ou à produire de grandes quantités d’une protéine d’intérêt, pour n’en nommer quequelques-unes 1. Parmi les autres utilisations, mentionnons l’étude de la croissance tissulaire, l’aide à l’avancement de la mise au point de vaccins, la recherche en toxicologie, l’étude du rôle des gènes dans les organismes sains et les modèles malades, et la production de lignées cellulaires hybrides 2,3. Les lignées cellulaires peuvent également permettre la production de médicaments3. Des techniques d’asepsie appropriées sont nécessaires lorsque vous travaillez avec des lignées cellulaires; Les pratiques et techniques décrites dans ce manuscrit sont applicables aux laboratoires de recherche où des travaux de culture cellulaire sont effectués. Les autres laboratoires ne sont pas abordés.
La contamination est souvent la principale préoccupation lors de l’exécution de travaux de culture cellulaire. Dans le contexte du présent document, la contamination fait généralement référence aux champignons et aux bactéries. L’objectif global de la méthode décrite dans ce document est de décrire en détail les meilleures pratiques pour éviter la contamination. Tous les membres du laboratoire doivent adhérer à ces pratiques lorsqu’ils travaillent dans la salle de culture cellulaire d’un laboratoire de recherche. Les laboratoires devraient s’assurer que tous les travailleurs participent activement à l’utilisation de ces pratiques exemplaires pour prévenir la contamination. La connaissance des bonnes pratiques et techniques aidera à garantir que les cultures cellulaires restent viables, saines et exemptes de contamination. Le développement de cette technique est basé sur la recherche de la littérature, sept ans d’expérience de travail avec des cultures cellulaires et la nécessité d’une méthode à laquelle les novices et les travailleurs expérimentés en culture cellulaire peuvent se référer chaque année.
Il est nécessaire de mettre au point une technique claire et normalisée que tous les laboratoires de culture cellulaire de recherche devraient suivre. Une grande partie de la littérature sur la contamination par culture cellulaire traite de la détection des mycoplasmes, des techniques aseptiques, des sources de contamination, de l’élimination des contaminants et de la prévention par l’utilisation d’antibiotiques et des tests réguliers 4,5,6,7,8. Bien que cette information soit utile, il n’y a pas de vidéos présentes dans la littérature qui démontrent les techniques de culture cellulaire appropriées que l’on devrait suivre. L’avantage des pratiques présentées par rapport aux techniques alternatives est de mettre l’accent sur la prévention de la contamination avant qu’elle ne se produise, plutôt que de détecter et de corriger les erreurs plus tard. De plus, une démonstration approfondie des techniques d’asepsie, une discussion sur la prévention de la croissance des champignons et des bactéries et des informations sur la circulation de l’air des armoires de biosécurité sont précieuses pour les travailleurs novices et expérimentés en culture cellulaire.
Les bactéries et les champignons sont les deux types de contaminants les plus courants. Dans la catégorie des bactéries, les mycoplasmes sont une préoccupation majeure en raison de leur petite taille et de leur capacité à proliférer tout en restant inaperçus. Ce sont des organismes auto-réplicatifs sans paroi cellulaire rigide qui dépendent des cellules eucaryotes pour se développer. Ils ont des capacités métaboliques réduites et peuvent se multiplier considérablement tout en restant non reconnus dans l’inspection visuelle de routine des cultures cellulaires et l’analyse microscopique régulière, bien que la microscopie électronique à transmission puisse détecter les mycoplasmes 9,10. De plus, ils peuvent passer à travers des filtres microbiologiques10. Le milieu de culture cellulaire fournit des nutriments aux mycoplasmes, bien que malheureusement la supplémentation en antibiotiques n’affecte pas les mycoplasmes10. Il convient de noter que, en général, il n’est pas nécessaire de compléter les milieux avec des antibiotiques; Des techniques appropriées devraient suffire à tenir la contamination à distance. L’infection par les mycoplasmes n’entraîne pas la mort cellulaire immédiate, mais elle préoccupe les chercheurs car elle affecte la reproductibilité et la qualité des données.
Tout le personnel de laboratoire doit adhérer strictement aux bonnes pratiques de culture cellulaire. Les cultures doivent être testées pour les mycoplasmes après leur nouvel achat, pendant leur culture, avant la cryoconservation et lorsqu’elles sont décongelées à partir d’azote liquide 2,10. Différents tests sont disponibles sur le marché en utilisant la réaction en chaîne de la polymérase (PCR), le dosage immuno-enzymatique (ELISA) ou l’immunomarquage. 3 La littérature indique que « les isolats humains représentent un pourcentage élevé des contaminants mycoplasmiques trouvés dans les cultures cellulaires »5. Bien que plus de 200 espèces de mycoplasmes aient été décrites, environ six d’entre elles représentent la plupart des infections. Ces six espèces sont M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale et Acholeplasma laidlawii10. Comme pour les autres types de contamination, l’air et les aérosols les introduisent dans les cultures cellulaires5. Cela se retrouve dans d’autres articles puisque « l’opérateur humain est potentiellement le plus grand danger en laboratoire »7. Bien que cela se fasse par erreur humaine, le risque peut être éliminé si une procédure standard est suivie. L’excrétion du personnel ne se limite pas à la contamination par les mycoplasmes; Les cultures cellulaires dans un laboratoire sont généralement infectées par les mêmes espèces de mycoplasmes, ce qui indique que la contamination se propage d’un flacon à l’autre en raison de techniques de culture cellulaire inappropriées10.
La prévention de la contamination croisée est également une autre raison pour laquelle les techniques de culture cellulaire appropriées doivent être suivies. Il est à noter qu’au moins 15 % à 18 % des lignées cellulaires dans le monde peuvent être contaminées ou mal identifiées11,12. En plus de tester les lignées cellulaires pour la contamination par les mycoplasmes, elles devraient également être testées pour la contamination croisée10. Pour les lignées cellulaires humaines, l’authentification des lignées cellulaires par une technique peu coûteuse basée sur l’ADN appelée profilage à courte répétition en tandem (STR) est la norme de référence internationale actuelle, car c’est un moyen facile de confirmer l’identité de la lignée cellulaire 2,10,13,14. STR peut identifier les lignées cellulaires mal étiquetées ou contaminées par des croix, mais il ne peut pas détecter l’origine tissulaire incorrecte10,13,14. La validité des données de recherche peut être compromise si les lignées cellulaires sont mal étiquetées, mal identifiées ou contaminées13. Comme pour d’autres types de contamination, la contamination croisée peut se produire en raison d’une mauvaise technique provoquant la propagation des aérosols, d’un contact erroné conduisant au mauvais type de cellule entrant dans un flacon ou de l’utilisation du même flacon de média et des mêmes réactifs avec des lignées cellulaires différentes10. Aucun partage de bouteilles multimédias ne devrait avoir lieu; Le partage d’une bouteille de média entre deux lignées cellulaires différentes peut permettre à ces populations cellulaires d’être mélangées, ce qui conduit le type cellulaire à croissance plus rapide à prendre complètement le contrôle du flacon. Ce remplacement n’est pas perceptible et entraîne des erreurs d’étiquetage et d’identification2. Une lignée cellulaire peut également être confondue avec une autre si les cultures sont confondues lors de la manipulation ou de l’étiquetage10. Une attention particulière doit être accordée à garder les réactifs, les milieux et les flacons séparés les uns des autres. Chaque membre du laboratoire devrait avoir ses propres flacons médias; Aucun partage ne doit avoir lieu entre les membres du laboratoire. Les lignées cellulaires elles-mêmes doivent être achetées auprès d’une banque de cellules et d’un fournisseur qualifiés. Les laboratoires ne devraient pas partager de cellules. Des études montrent que, bien que les tests STR et mycoplasmes soient régulièrement utilisés, de nombreux articles de recherche dans la littérature ont déjà utilisé des lignées cellulaires mal identifiées ou contaminées15. Passer au crible la recherche pour trouver ces articles problématiques et informer rétroactivement les lecteurs à ce sujet est fastidieux. La prévention est le meilleur moyen de s’assurer que ce problème ne se produise pas en premier lieu.
La simple action de pulvériser des articles avec 70% d’EtOH peut tuer les organismes; 70% EtOH agit en dénaturant les protéines et en dissolvant les lipides dans les organismes les plus fréquemment contaminants, y compris les bactéries et les champignons16. Des études ont montré que 70% est la concentration la plus efficace; Les protéines de surface ne coagulent pas rapidement avec 70% d’EtOH afin qu’elles puissent pénétrer dans la cellule, tandis que l’eau qu’elle contient est nécessaire au processus de dénaturation des protéines. En raison de la différence de concentration d’eau et d’alcool de chaque côté de la paroi cellulaire, 70% d’EtOH pénètre dans la cellule pour dénaturer les protéines enzymatiques et structurelles. Si la croissance de moisissures est observée dans les flacons, l’ensemble de l’incubateur doit être décontaminé en le pulvérisant d’abord avec 70% d’EtOH et en l’essuyant, suivi d’une incubation nocturne de 16 heures à 60 °C17. Cela tue la plupart des moisissures et des bactéries.
Le principal avantage des pratiques de prévention par rapport aux techniques alternatives d’élimination de la contamination après qu’elle se soit produite est qu’en prévenant la contamination dès le début, les travailleurs de laboratoire peuvent être sûrs que leurs cultures cellulaires sont saines et qu’il n’y aura pas de coûts élevés associés à la décontamination des incubateurs ou à la mise au rebut des cultures cellulaires. L’élimination des contaminants mycoplasmiques après, par exemple, n’est pas efficace7. Prendre le temps dès le début de s’assurer que le personnel de laboratoire est correctement formé, que la salle de culture cellulaire est autonome et qu’une procédure standard est utilisée permettra d’économiser du temps et de l’argent.

<table><tbody><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14-190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F-12 Media</td><td>ATCC</td><td>30-2006</td><td></td></tr><tr><td>Fiole à chicanes en verre</td><td>Pyrex&nbsp ;</td><td>09-552-40</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes en verre</td><td>Fisher&nbsp ;</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Aide à la pipette</td><td>Drummond</td><td>13-681-15A&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique</td><td>Corning</td><td>07-200-573</td><td></td></tr><tr><td>Fiole T75</td><td>Corning</td><td>07-202-004</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td></td></tr><tr><td>*Les articles peuvent varier car cette vidéo traite des techniques</td><td></td><td></td><td></td> générales de culture cellulaire</tr></tbody></table>

techniques et pratiques de culture cellulaire pour éviter la contamination par des champignons et des bactéries dans le laboratoire de culture cellulaire de recherche

Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory

La culture cellulaire est une compétence délicate nécessaire à la culture de cellules humaines, animales et d’insectes, ou d’autres tissus, dans un environnement contrôlé. L’objectif du protocole est de mettre l’accent sur les techniques correctes utilisées dans un laboratoire de recherche pour prévenir la contamination par des champignons et des bactéries. Un accent particulier est mis sur l’évitement de la contamination par les mycoplasmes, une préoccupation majeure dans la salle de culture cellulaire en raison de sa petite taille et de sa résistance à la plupart des antibiotiques utilisés pour la culture cellulaire. Ces mêmes techniques assurent une croissance continue et maintiennent des cellules saines. Pour les utilisateurs de cultures cellulaires débutants et expérimentés, il est important d’adhérer systématiquement à ces meilleures pratiques pour atténuer le risque de contamination. Une fois par année, les laboratoires devraient examiner les pratiques exemplaires en matière de culture cellulaire et faire un suivi avec une discussion ou une formation supplémentaire au besoin. Prendre des mesures précoces pour prévenir la contamination en premier lieu permettra d’économiser du temps et de l’argent, par rapport au nettoyage après la contamination. Les meilleures pratiques universelles maintiennent les cultures cellulaires en bonne santé, réduisant ainsi le besoin de décongeler constamment de nouvelles cellules, d’acheter des milieux de culture cellulaire coûteux et de réduire la quantité de décontamination et de temps d’arrêt de l’incubateur.

Si les techniques et les pratiques de culture cellulaire décrites dans le présent document ne sont pas suivies, la contamination par des champignons et des bactéries peut se produire dans le laboratoire de culture cellulaire de recherche. La figure 2 montre les flacons contaminés à la fois dans les cultures en suspension et adhérentes.
Lorsqu’il ne suit pas les techniques d’asepsie, la contamination par les moisissures peut survenir 2 à 3 jours plus tard. Les boul...

Ce protocole présente les techniques et pratiques essentielles de culture cellulaire à utiliser dans le laboratoire de culture cellulaire de recherche pour éviter la contamination par des champignons et des bactéries. Dans la catégorie des bactéries, un accent particulier sera mis sur la prévention de la contamination par les mycoplasmes.

Techniques et pratiques de culture cellulaire pour éviter la contamination par des champignons et des bactéries dans le laboratoire de culture cellulaire de recherche

Cell culture is a delicate skill necessary for growing human, animal, and insect cells, or other tissues, in a controlled environment. The goal of the ...

La culture cellulaire est une compétence délicate nécessaire à la culture de divers types de cellules et de tissus dans un environnement de laboratoire contrôlé. La principale préoccupation lors de l’exécution de travaux de culture cellulaire est la contamination. Cette contamination peut prendre la forme de bactéries, de moisissures ou de mycoplasmes.Les techniques et les pratiques décrites dans cette vidéo garantiront que vos cellules restent viables, saines et exemptes de contamination. Ces pratiques doivent être strictement respectées et tout le personnel de laboratoire doit recevoir une formation au moins une fois par an. Avant de commencer à travailler, portez une blouse de laboratoire propre destinée à être utilisée dans la salle de culture cellulaire seulement.Portez des gants neufs qui n’ont touché aucune autre surface. Assurez-vous que les gants sont bien ajustés. Les gants sans poudre de nitrile sont les meilleurs.La blouse de laboratoire et les gants n’ont pas besoin d’être stériles. Pour vous préparer au travail, vaporisez des gants, des manches de blouse de laboratoire et l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique avec de l’éthanol à 70%. Vaporisez la surface de travail, les côtés, l’arrière, tous les éléments de l’armoire et du panneau de verre avant, à la fois de l’intérieur et de l’extérieur.Essuyez la surface de travail et le panneau de verre à l’aide d’une serviette en papier non pelucheuse. Prenez le temps d’organiser l’espace de travail à l’intérieur de l’armoire. Gardez les bains d’eau à l’intérieur de la salle de culture cellulaire et utilisez-les uniquement à des fins de culture cellulaire, comme le chauffage des milieux ou la décongélation des cellules.Les bains-marie doivent être vidangés et lavés une fois par semaine. Limitez la quantité d’articles apportés dans l’armoire et n’interrompez pas le flux d’air à l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique en bloquant les grilles avant ou arrière. Vaporisez tous les articles placés à l’intérieur de l’armoire avec de l’éthanol à 70% et essuyez-les.Commencez par vaporiser le haut de la bouteille de média et descendez. Avec une serviette en papier propre, commencez par le haut de la bouteille de média pour l’essuyer, en progressant progressivement vers le bas. Ne remontez pas vers le bouchon.La façon dont ces armoires fonctionnent est qu’elles tirent l’air de la pièce et de l’armoire elle-même à travers les grilles avant et arrière. L’air va vers l’arrière de l’armoire et jusqu’au sommet. Là, l’air contaminé passe à travers un tas de filtres, et une partie de l’air propre filtré est poussée vers le bas sur la zone de travail dans l’armoire.Si l’armoire est assez grande pour accueillir des pipettes sérologiques, elles peuvent être placées à l’intérieur, sinon, elles peuvent être stockées dans un récipient monté à l’extérieur de l’armoire. Il est recommandé de vérifier de chaque côté de la pipette encastrée la présence de trous, de déchirures ou de perforations dans l’emballage avant utilisation. N’arrachez pas l’emballage.Au lieu de cela, pelez doucement les extrémités de l’emballage. Insérez la pipette sérologique dans un auxiliaire de pipette et retirez l’emballage en un seul mouvement de fluide. Ne survolez pas les bouteilles ou les flacons ouverts.Il n’est pas recommandé d’atteindre une bouteille ou une fiole ouverte ou de travailler au-dessus de flacons ouverts. Le flux d’air à l’intérieur des armoires pousse vers le bas sur tout ce qui se trouve à l’intérieur. Tendre la main permettra à votre manche ou à votre gant d’être au-dessus d’articles qui pourraient potentiellement pousser toute contamination présente sur votre manche, par exemple, dans votre culture cellulaire.Dans la mesure du possible, ne versez pas de liquides. Au lieu de cela, ajoutez-les à l’aide d’une pipette sérologique. Bien mélanger le contenu et parapher la bouteille.Notez ce que le média est complété. Si vous travaillez avec des cultures adhérentes et que vous avez besoin d’un flacon en plastique, vaporisez tout l’emballage et mettez-le à l’intérieur. Chaque fois que vos gants ont séché, vaporisez-les à nouveau avec de l’éthanol.Lorsque vous travaillez avec une lignée cellulaire adhérente, utilisez des pipettes en verre autoclavées ou des pipettes en plastique stériles jetables pour aspirer les fluides ou les solutions de lavage. Retirez délicatement le capuchon métallique du récipient de stockage. Isoler une pipette en verre en secouant doucement le récipient en biais.Lorsque vous entrez dans le récipient, évitez de toucher d’autres pipettes. Manipulez la pipette choisie à partir d’une seule extrémité. Remplacez rapidement les bouchons des bouteilles et des flacons dès que possible.Placez des bouchons sur la surface de travail à l’envers afin que la jante ne touche pas la surface de travail. Ne saisissez pas le capuchon par le haut ou le bas. Au lieu de cela, touchez les capuchons sur les côtés.Lorsque vous aspirez des liquides, utilisez un ballon à piège à vide situé à l’extérieur de l’armoire dans un récipient secondaire sur le sol. Les déchets seront créés en travaillant à l’intérieur de l’armoire. Parce que déplacer les mains dans et hors de l’armoire interrompra trop souvent le flux d’air, il est bon de laisser temporairement les déchets à l’intérieur de l’armoire.Placez-le sur le côté pour qu’il n’interrompe pas votre travail. Vaporisez généreusement des gants avec de l’éthanol à 70 % chaque fois qu’ils deviennent secs. Frottez vos mains ensemble pour qu’elles ne soient pas mouillées.Un petit mot sur les pipettes sérologiques. S’ils touchent accidentellement quelque chose d’autre dans le capot, n’hésitez pas à les jeter. Il est préférable de recommencer à zéro avec une pipette sérologique propre au lieu d’en utiliser une qui pourrait être contaminée.Avant de placer des cellules dans l’incubateur, vérifiez à quoi elles ressemblent au microscope. Les cellules individuelles doivent être observées. Cela indique que les cellules ont été complètement remises en suspension.Ne parlez pas, n’éternuez pas, ne toussez pas et ne respirez pas fortement dans les incubateurs. Ouvrez et fermez rapidement les portes de l’incubateur. Les laisser ouverts plus longtemps que nécessaire peut permettre aux contaminants présents dans l’air de pénétrer dans les incubateurs.Assurez-vous que les bouchons de toutes les bouteilles sont bien fermés avant de les retirer de l’armoire. Les médias sont sensibles à la lumière. Il doit être conservé dans l’obscurité à quatre degrés Celsius lorsqu’il n’est pas utilisé.Vaporisez à nouveau l’intérieur de l’armoire avec de l’éthanol à 70% une fois les travaux de culture cellulaire terminés et essuyez la surface avec une serviette en papier. Videz le sac à déchets pour risques biologiques. Répétez ce processus et remplacez les gants lorsque vous passez à une autre lignée cellulaire.Lorsque vous travaillez avec des cultures en suspension cultivées dans des flacons en verre, assurez-vous que les gants sont mouillés. Touchez la feuille d’aluminium avec vos gants humides, puis vaporisez uniquement le fond de la fiole avant de la placer à l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique. Lorsque vous prélevez un échantillon pour le comptage cellulaire, ne retirez qu’un seul tube de 1,5 ml de son contenant.Ne touchez aucun des autres tubes. Placez le capuchon à l’envers sur la surface de travail. Ne touchez pas la jante intérieure.Manipulez-le avec soin sur les côtés et remplacez-le une fois que vous avez terminé. Lors de la manipulation des cellules de suspension et des flacons en verre, retirez soigneusement le morceau de feuille d’aluminium plié qui recouvre tout le col du flacon. Tirez doucement sur les quatre coins et placez la feuille à l’envers sur la surface de travail.Manipuler la fiole en verre par le bas seulement. Ne le touchez pas du cou une fois que la feuille est enlevée. Utilisez une pipette sérologique de 1 ml pour prélever un échantillon pour le comptage cellulaire.Ne laissez pas le média couler sur le côté des flacons. Si c’est le cas, vaporisez de l’éthanol à 70% sur une serviette en papier et nettoyez-la immédiatement. Assurez-vous que les bouchons ou le papier d’aluminium sont serrés avant de retirer les bouteilles ou les flacons des armoires de sécurité biologique.Utilisez des incubateurs distincts pour différents types de cellules. Cela permettra d’éviter la contamination croisée de différents types de cellules. Il est recommandé de placer le ballon piège à vide pour la collecte des déchets liquides à l’extérieur de l’armoire sur le sol dans un récipient secondaire étiqueté déchets.Le tuyau est connecté à un filtre qui est remplacé sur une base mensuelle. Le tuyau pénètre par le côté de l’armoire. Enlevez les déchets biologiques une fois les travaux terminés.Gardez un protocole de lavage de verre sur le mur près de l’évier. Tout d’abord, faites tremper les cellules jetées avec 10% d’eau de Javel pendant environ cinq minutes. Ensuite, jetez le mélange d’eau de Javel et rincez soigneusement la fiole avec de l’eau.Ajouter du savon avec de l’eau, frottez-le très bien avec une brosse, rincez avec plus d’eau. Et puis la dernière étape consiste à rincer la verrerie avec l’eau DI sur le robinet à droite. Lavez les flacons en verre dès que possible, frottez bien la verrerie.Les cellules Sf9 quitteront ce bord de cellules mortes s’il n’est pas nettoyé correctement. Utilisez ces flacons uniquement pour la culture cellulaire, la verrerie de culture cellulaire autoclave au lieu de l’envoyer à une installation de lavage de verre. Utilisez le cycle de vide sur l’autoclave pendant 40 minutes de temps stérilisé et 40 minutes de temps sec.Gardez-le séparé de la verrerie dans la zone principale du laboratoire. Organisez la salle de culture cellulaire de manière à ce que toutes les fournitures soient situées dans une seule zone, minimisant ainsi la nécessité pour les membres du laboratoire de quitter la salle de culture cellulaire à la recherche de fournitures. Étiqueter toutes les bouteilles en plastique utilisées pour prélever des cellules et réutilisées en culture cellulaire par la suite, pour une utilisation de culture cellulaire seulement.Utilisez les flacons de culture cellulaire désignés pour un type de cellule spécifique. Conservez ces flacons dans la salle de culture cellulaire pour un accès facile. Pour les cultures cultivées en suspension, la moisissure sera reconnue comme des boules flottantes dans les médias.Quant à la contamination bactérienne, elle rendra le média blanc et trouble. De même, pour les cellules adhérentes, la contamination par les moisissures peut être facilement reconnue comme des taches floues. La contamination bactérienne deviendra normalement claire, blanche et trouble.De nombreuses espèces de mycoplasmes peuvent être identifiées de manière fiable à l’aide d’un test basé sur la PCR. La bande de gauche montre les normes de poids moléculaire pour l’ADN. Les quatre bandes de droite sont des témoins positifs.Aucune bande n’apparaît sous les types de cellules testées car le mycoplasme n’a pas été détecté. Les milieux de culture cellulaire changeront de couleur du rouge au jaune si des indicateurs de pH sont présents. La couleur jaune indique que le pH est bas et que le média doit être remplacé.Si d’autres excroissances ou formes de cellules sont observées au microscope optique lors du comptage cellulaire, cela peut indiquer une contamination. Notez qu’un nettoyage complet de l’hémocytomètre doit être effectué avant le comptage des cellules, car ce type de débris peut être présent uniquement sur l’hémocytomètre et non dans la culture cellulaire elle-même. Bien que la contamination soit l’une des principales préoccupations lors de l’exécution de travaux de culture cellulaire, ces risques peuvent être atténués en suivant les pratiques et les techniques décrites dans cette vidéo.Si un test mensuel de mycoplasmes est effectué chaque mois, que le personnel de laboratoire est formé chaque année et que ces pratiques sont strictement respectées, vos cellules resteront saines et exemptes de contamination. Cela aidera également à réduire les coûts associés à l’achat de milieux de culture cellulaire coûteux, à l’achat de nouvelles cellules et réduira les temps d’arrêt de décontamination des incubateurs. Rappelez-vous, la clé d’une culture cellulaire réussie est une action précoce afin de prévenir la contamination en premier lieu.

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Techniques et pratiques de culture cellulaire pour éviter la contamination par des champignons et des bactéries dans le laboratoire de culture cellulaire de recherche (Vidéo) | JoVE Journal

Techniques et pratiques de culture cellulaire pour éviter la contamination par des champignons et des bactéries dans le laboratoire de culture cellulaire de recherche

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