Name: Un modèle organoïde cérébral humain de transplantation de cellules neurales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Découvrez une méthode de transplantation de cellules neurales dans des organoïdes cérébraux humains pour évaluer l'engraftment à long terme. Cette technique permet de suivre l'intégration cellulaire et de tester différents traitements thérapeutiques.

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Les fonds pour ce travail ont été fournis par l’IRIC Fonds philanthropiques de la Fondation Marcelle et Jean Coutu et du Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS #295647). D.J.H.F.K. bénéficie d’un soutien salarial du FRQS sous la forme d’une bourse Chercheurs-boursiers Junior 1 (#283502). M.I.I.R. a été soutenu par une bourse doctorale de l’IRIC de l’Institut de recherche en immunologie et en cancérologie, une bourse de passage accélérée de la maîtrise au doctorat de l’Université de Montréal et une bourse de mérite aux cycles supérieurs.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Compte tenu de l’intérêt considérable pour les approches thérapeutiques cellulaires pour le traitement des lésions du SNC et des troubles neurodégénératifs 1,2,3,4,5,6,7,8, les modèles de la fonction cellulaire dans un contexte de transplantation gagnent en importance. Cet article présente une méthode de transplantation de NPC humains marqués dans des organoïdes cérébraux humains, ainsi que leur suivi des cellules vivantes et leur évaluation des points finaux par histologie et coloration immunofluorescente. Surtout, nous avons montré que les cellules transplantées étaient capables de migration, de différenciation et de persistance à long terme (4 mois) dans le cadre des organoïdes. Une telle persistance à long terme est une augmentation marquée par rapport à la maintenabilité des cultures de tranches de cerveau17. Ce système est donc approprié pour examiner de nombreux comportements que l’on devrait évaluer dans un cadre thérapeutique potentiel, tels que la survie, la prolifération et la différenciation. En effet, une étude orthogonale a récemment démontré que les NPC transplantés se comportaient de manière similaire dans les organoïdes cérébraux par rapport aux NPC transplantés dans les cerveaux de souris NSG20, confirmant ainsi l’utilité des organoïdes en tant que receveur de greffe. Comme il s’agit d’un système in vitro, il est également facile d’ajouter des cytokines ou des médicaments d’intérêt. Cela pourrait être utilisé pour mieux comprendre les effets d’environnements spécifiques tels que l’inflammation et les immunosuppresseurs sur les cellules transplantées afin d’imiter davantage ce qu’elles pourraient rencontrer dans un cadre thérapeutique. Le protocole d’immunofluorescence cyclique que nous avons démontré (basé sur des recherches antérieures21) étend encore la puissance de cette approche, permettant d’évaluer simultanément un large éventail de marqueurs spécifiques à la lignée et, potentiellement, à la maladie dans une seule section, et, ainsi, permettant un suivi précis des cellules transplantées et de leur impact sur le tissu. Bien sûr, d’autres méthodes d’évaluation des paramètres pourraient être utilisées à la place en fonction des objectifs de l’analyse. Par exemple, le nettoyage tissulaire avec reconstruction 3D pourrait être utilisé si la morphologie cellulaire est d’intérêt principal, ou la dissociation suivie de la cytométrie en flux pourrait être utilisée si la quantification de types cellulaires spécifiques est l’objectif final. Nous nous attendons à ce que cette méthode soit facilement extensible à d’autres types de cellules telles que les tumeurs du SNC, permettant potentiellement leur étude dans un contexte microenvironnemental pertinent. De même, les organoïdes utilisés comme receveurs pourraient être échangés contre des organoïdes modèles de maladies 25,26,27, ce qui pourrait permettre de modéliser des approches de transplantation pour ces conditions.
Comme pour tous les modèles, celui présenté ici a aussi ses propres limites. D’une part, les organoïdes dérivés d’iPSC sont immatures sur le plan du développement19 et présentent donc des différences importantes par rapport au cerveau vieillissant, dans lequel de nombreuses maladies neurodégénératives se manifestent. Les organoïdes cérébraux ne sont pas non plus uniformes dans leur développement19, ce qui empêche une injection cohérente dans la même niche physiologique exacte. De plus, bien qu’ils contiennent les types de cellules des régions cérébrales pertinentes18,19, ils manquent des composants endothéliaux, microgliaux et immunitaires, qui sont également importants dans le contexte in vivo 14. Cela limite l’étude de la façon dont l’hôte réagira à la greffe de cellules. Des techniques sont actuellement mises en ligne pour ajouter des cellules vasculaires28 et microgliales29, ainsi que pour augmenter la consistance et la régionalisation des organoïdes18, améliorant ainsi le pouvoir de modélisation du système de transplantation d’organoïdes. Ils nécessiteraient toutefois des tests et des optimisations supplémentaires au-delà de ce qui est présenté ici. Bien que ce protocole soit peu coûteux et ne nécessite pas d’équipement spécialisé, il reste un certain nombre de considérations techniques importantes, comme la profondeur d’injection, par exemple. Cela est dû au fait que les organoïdes ne sont pas perfusés et, par conséquent, ont souvent un centre nécrotique s’ils deviennent trop grands19 et que la lumière ne peut pas pénétrer à travers le noyau de l’organoïde pour le suivi des cellules vivantes. Ainsi, les cellules qui ont été injectées trop profondément et les colonies qui ont migré à l’intérieur peuvent passer inaperçues. Bien que cela puisse être amélioré par l’utilisation de fluorophores de plus grande longueur d’onde avec une meilleure pénétrance tissulaire30, selon la taille de l’organoïde et l’appareil de détection, cela restera probablement une considération. Enfin, comme les organoïdes cérébraux sont en cours de développement, le moment de la transplantation est un autre facteur clé, car l’environnement sera probablement différent en fonction du stade de développement de l’organoïde dans lequel il est injecté. Bien que cela puisse être contrôlé dans une certaine mesure en assurant un âge cohérent des organoïdes au moment de l’injection, c’est sans aucun doute un facteur qui doit être pris en compte.
Ce protocole est peu coûteux, simple, sans animaux et ne nécessite pas d’équipement spécialisé, ce qui rend la modélisation de la transplantation accessible à une plus grande variété de laboratoires. Avec le rythme rapide des progrès à la fois dans les thérapies à base de cellules neurales et les systèmes de modèles organoïdes, nous prévoyons que le protocole de transplantation d’organoïdes présenté ici sera un modèle utile pour une gamme de maladies et d’approches thérapeutiques.

Le cerveau humain est un organe complexe composé de plusieurs types de cellules des lignées neurales et gliales. Ensemble, ils forment un réseau sophistiqué qui donne naissance à la cognition. La transplantation de cellules dans ce système suscite un intérêt important pour traiter une grande variété de troubles neurologiques, notamment les traumatismes crâniens (TCC)1,2, les troubles neurodégénératifs 3,4,5,6,7 et les accidents vasculaires cérébraux 8 . L’une des principales limites à l’avancement de telles stratégies, cependant, est le manque relatif de modèles précliniques disponibles pour déterminer les résultats attendus de la transplantation. Les modèles les plus utilisés actuellement sont les méthodes de culture in vitro pour déterminer le potentiel cellulaire et la xénotransplantation chez la souris. Bien que les méthodes de culture cellulaire puissent évaluer le potentiel de différenciation et d’auto-renouvellement9, elles sont réalisées dans des conditions de croissance optimales qui n’imitent pas le microenvironnement que les cellules rencontreraient dans un contexte de transplantation. De plus, la façon dont les cellules sont cultivées peut influencer leur comportement10.
Le cerveau des souris contient toutes les cellules du microenvironnement et constitue donc un système modèle extrêmement puissant pour la transplantation11. Il existe cependant des différences importantes entre la souris et le cortex humain12,13, et tous les facteurs de croissance ne réagissent pas de manière croisée entre les espèces. Les modèles de primates sont une alternative plus proche qui imite mieux le système humain et ont également donné d’importants résultats précliniques14. Cependant, même ces parents plus étroitement apparentés conservent des différences importantes dans leur composition cellulaire15. Bien que ces deux systèmes modèles fournissent des informations précieuses sur le comportement des cellules pendant la greffe et intègrent les éléments chirurgicaux d’une éventuelle thérapie, ils restent imparfaits. Ils sont également coûteux et techniquement difficiles (c’est-à-dire qu’il faut effectuer une chirurgie cérébrale sur les animaux), limitant ainsi le débit possible. De plus, il existe une pléthore de problèmes éthiques associés à la transplantation de cellules cérébrales humaines chez des animaux16. Les cultures de tranches de cerveau permettent de couper un cerveau et de l’utiliser pour plusieurs traitements, éliminant ainsi certaines des limites des greffes d’animaux ; cependant, celles-ci ont une durée de vie limitée (semaines), sont toujours d’origine animale et (étant une tranche mince) n’ont pas un volume/une intégrité de surface suffisant pour imiter l’injection de cellules17. Ainsi, il reste un écart important entre la culture cellulaire/les modèles potentiels et la transplantation in vivo.
Les organoïdes cérébraux sont un modèle in vitro contenant les principaux types de cellules neurales présentes dans le cerveau et peuvent être générés en grand nombre à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (CSPi)18,19. De tels organoïdes fournissent ainsi un contexte cellulaire, qui pourrait permettre l’évaluation de la capacité fonctionnelle d’une cellule test d’intérêt dans le cadre de la transplantation. En effet, une étude récente a démontré que les cellules progénitrices neurales (NPC) transplantées dans des organoïdes cérébraux humains survivent, prolifèrent et se différencient de la même manière que les NPC transplantées dans le cerveau d’une sourisdiabétique obèse et immunodéficiente (NSG)20. Les organoïdes cérébraux représentent donc un système sans cruauté, à longue durée de vie (>6 mois) et rentable qui capture les types de cellules du cerveau humain. En tant que tels, ils pourraient représenter un receveur de greffe idéal pour le test précoce de la capacité de régénération des cellules neurales.
Cet article présente un protocole pour la transplantation et le suivi ultérieur de NPC humains marqués dans des organoïdes cérébraux humains (Figure 1). Cela commence par l’injection de NPC marqués à la GFP dans des organoïdes cérébraux matures (âgés de 2 à 4 mois)18. Les cellules transplantées sont ensuite suivies d’une microscopie à fluorescence sur cellules vivantes sur une période de 4 mois. Pendant ce temps, nous montrons à la fois la persistance des cellules au site d’injection mais aussi la migration vers les régions distales de l’organoïde. Au point final, nous démontrons la récupération d’antigènes, la coloration et l’imagerie de coupes histologiques dérivées de ces organoïdes, y compris un protocole pour la trempe des colorants existants à base d’AlexaFluor pour permettre des cycles de coloration et d’imagerie supplémentaires, sur la base de travaux antérieurs21. Ce protocole pourrait donc être utile pour mesurer la capacité de différenciation des cellules dans un contexte de greffe, la durabilité du greffon, l’expansion cellulaire in situ et la migration cellulaire à partir du site de greffe. Nous prévoyons que cela sera utile à la fois pour les applications de médecine régénérative/thérapie cellulaire, ainsi que pour la modélisation tumorale en greffant des cellules tumorales dans des organoïdes spécifiques à une région pertinente.

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td><td>mélange d’enzymes protéolytiques-collagénolytiques</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-GFP Anticorps</td><td>BioLegend</td><td>338008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-MAP2 (clone SMI 52)</td><td>BioLegend</td><td>801804</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-GFAP Anticorps (clone SMI 25)</td><td>BioLegend</td><td>837510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-Nestin (clone 10C2)</td><td>BioLegend</td><td>656804</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-tubuline &beta ; 3 (TUBB3) (clone TUJ1)</td><td>BioLegend</td><td>801209</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique monohydraté</td><td>Fisher Chemical</td><td>A104-500</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Lecteur multimode</td><td>Biotek-Alcool</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>éthylique dénaturé (anhydre)</td><td>ChapTec-DMEM</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>F12/ Glutamax</td><td>Thermo</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>Dymethil Sulfoxyde (DMSO), Stérile</td><td>BioShop</td><td>DMS666.100</td><td></td></tr><tr><td>FIJI 1.53c</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Solution de formol, tampon neutre, 10 %</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Gen5&nbsp ;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HistoCore Arcadia H</td><td>Leica</td> <td>Biosystems-Matrigel</td><td></td></tr> <tr><td>Growth Factor Reduced (GFR)</td><td>Lame</td><td></td> de microtome MX35 <td>sans rouge de phénol 356231 et sans LDEV</td></tr><tr><td></td><td>Epredia&nbsp ;</td><td></td><td></td>3053835</tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>655104</td><td></td></tr><tr><td>PBS (-Ca -Mg)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de puromycine</td><td>Thermo</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>inhibiteur de ROCK Y-27632</td><td>Abcam</td><td>ab120129</td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific&nbsp ; Moules de base en acier inoxydable</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-209</td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific&nbsp ; UNISETTE Cassette de traitement/intégration de biopsie</td><td>Fisher Scientific</td><td>36-101-9255</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Kit de différenciation des neurones du cerveau antérieur</td><td>StemCell Technologies</td><td>8600</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Progéniteur neural moyen</td><td>StemCell Technologies</td><td>5833</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff SMADi Kit d’induction neuronale StemCell</td><td>Technologies</td><td>8581</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Finesse ME Microtome</td><td>Thermo</td> <td>Scientific-Préparation</td><td></td></tr> <tr><td>des tissus</td><td>Fisher Scientific</td><td>T555</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 6&nbsp ; Processeur de tissus AI</td><td>Sakura</td> <td>Finetek-Toluène</td><td></td></tr> <tr><td>(histologique)</td><td>ChapTec-Trypan</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>bleu ; 0,4 % (poids/vol)</td><td>Thermo</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BioShop</td><td>TWN510.100</td><td></td></tr></tbody></table>

un modèle organoïde cérébral humain de transplantation de cellules neurales

A Human Cerebral Organoid Model of Neural Cell Transplantation

L’avancement des approches de transplantation cellulaire nécessite des systèmes modèles qui permettent une évaluation précise de la puissance fonctionnelle des cellules transplantées. Pour le système nerveux central, bien que la xénotransplantation reste à la pointe de la technologie, de tels modèles sont techniquement difficiles, limités en débit et coûteux. De plus, les signaux environnementaux présents ne réagissent pas parfaitement avec les cellules humaines. Cet article présente un modèle peu coûteux, accessible et compatible à haut débit pour la transplantation et le suivi de cellules neurales humaines dans des organoïdes cérébraux humains. Ces organoïdes peuvent être facilement générés à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme à l’aide de kits commerciaux et contiennent les principaux types de cellules du cerveau. 
Nous démontrons d’abord ce protocole de transplantation avec l’injection de cellules progénitrices neurales (NPC) humaines dérivées d’iPSC marquées à l’EGFP dans ces organoïdes. Nous discutons ensuite des considérations relatives au suivi de la croissance de ces cellules dans l’organoïde par microscopie à fluorescence de cellules vivantes et démontrons le suivi des NPC transplantés marqués à l’EGFP dans un organoïde sur une période de 4 mois. Enfin, nous présentons un protocole de sectionnement, de coloration immunofluorescente cyclique et d’imagerie des cellules transplantées dans leur contexte local. Le modèle de transplantation organoïde présenté ici permet le suivi à long terme (au moins 4 mois) des cellules humaines transplantées directement dans un microenvironnement humain avec un protocole peu coûteux et simple à réaliser. Il représente donc un modèle utile à la fois pour les thérapies cellulaires neurales (greffes) et, probablement, pour modéliser les tumeurs du système nerveux central (SNC) d’une manière plus précise sur le plan microenvironnemental.

Pour valider l’identité de l’organoïde cérébral, des coupes histologiques d’un organoïde cérébral mature (âgé de 2 mois) ont été colorées pour PAX6 (un marqueur des NPC dorsaux23) et SATB2 (un marqueur des neurones matures, postmitotiques de la couche supérieure24). Comme prévu, les cellules PAX6+ étaient présentes à l’intérieur de l’organoïde, et les cellules SATB2+ étaient présentes dans les couches supérieures (Figure 2). Ces résultats soutiennent que les organoïdes cérébraux utilisés étaient bien des cerveaux antérieurs dorsaux comme spécifié dans le kit de différenciation. Pour établir la dose-dépendance du système de transplantation d’organoïdes cérébraux, des organoïdes cérébraux âgés de 2 mois ont été injectés avec un nombre croissant de NPC dérivés d’iPSC EGFP+ . Une dépendance claire de la dose de fluorescence GFP sur le nombre de cellules d’entrée était présente, avec une détection cohérente des patchs cellulaires EGFP+ à 10 000 cellules et plus (Figure 3). La persistance et la migration des NPC transplantés ont ensuite été évaluées en suivant les organoïdes transplantés au fil du temps. Pour cela, 50 000 NPC EGFP+ dérivés d’iPSC ont été transplantés dans des organoïdes cérébraux âgés de 2 à 3 mois générés à partir de la même lignée d’iPSC. Les organoïdes injectés et les témoins ont été imagés pour la positivité de l’EGFP à des moments indiqués au cours des 3-4 mois suivants. Dans cette série de transplantations, nous avons observé la persistance du site d’injection tout au long de la période de suivi de 4 mois (Figure 4A). Des patchs de cellules EGFP+ supplémentaires sont apparus 9 jours après la transplantation et ont persisté jusqu’au point final de l’étude (3-4 mois selon l’organoïde), indiquant la migration des cellules et l’intégration à leurs nouveaux sites (Figure 4A). À un grossissement plus élevé, une morphologie neurale claire était observable avec de longues projections dans l’organoïde (Figure 4B), confirmant l’intégration des cellules injectées.
Pour déterminer l’état de différenciation des cellules injectées tard après l’injection, l’organoïde suivi de 4 mois et son témoin ont été fixés, enrobés de paraffine, coupés en tranches de 15 m d’épaisseur et montés sur des lames de verre. Les tranches ont ensuite été traitées et colorées soit en un seul cycle de coloration fluorescente (EGFP, TUJ1, NESTIN), soit pendant deux cycles de coloration consécutifs pour ajouter des marqueurs supplémentaires (MAP2, GFAP). La coloration initiale en un seul tour a confirmé la présence de cellules EGFP+ au site d’injection, y compris un mélange de cellules conservant le statut de NPC (NESTIN+TUJ1−) et de cellules qui s’étaient différenciées vers un destin neural (NESTIN−TUJ1+) (Figure 5). Pour les organoïdes témoins et injectés, très peu de NPC NESTIN+ ont été observés (la plupart, mais pas tous, étant des NPC transplantés EGFP+ au site d’injection), avec une majorité de neurones immatures-matures TUJ1+ (Figure 5). La coloration à deux rondes a donné plus de détails, révélant des neurones matures (NESTIN−TUJ1+MAP2+GFAP−) autour de la majeure partie de la région externe de l’organoïde, avec des zones de neurones immatures (NESTIN−TUJ1+MAP2−GFAP−) vers le milieu (Figure 6A,B). Des astrocytes (NESTIN−TUJ1−MAP2−GFAP+) étaient présents dans les organoïdes injectés et témoins et étaient intercalés sur les bords extérieurs (Figure 6A,B). La coupe pour laquelle la coloration à deux tours a été réalisée dans l’organoïde injecté a montré une petite colonie satellite de cellules EGFP+ loin du site d’injection qui avait adopté le phénotype des neurones matures (Figure 6B,C). Certains d’entre eux semblaient être à proximité d’astrocytes ; cependant, il n’y avait pas de cellules EGFP+ avec un chevauchement complet de la coloration GFAP, ce qui suggère qu’elles étaient adjacentes plutôt que de générer les astrocytes eux-mêmes (Figure 6B,C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig01.jpg"> Figure 1 : Modèle de transplantation de cellules marquées dans des organoïdes cérébraux. Vue d’ensemble schématique de la génération de cellules marquées par transduction lentivirale, de leur transplantation dans des organoïdes cérébraux et de leur suivi par imagerie de cellules vivantes et immunofluorescence. Abréviation : GFP = protéine fluorescente verte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig02.jpg"> Figure 2 : Immunofluorescence de coupes histologiques montrant l’architecture d’organoïdes précoces et tardifs. Un organoïde cérébral âgé de 2 mois a été fixé, enrobé de paraffine, tranché et coloré avec PAX6, SATB2 et DAPI. Une section non colorée a été utilisée pour régler le temps d’exposition et d’intégration afin d’éviter un signal faussement positif de l’autofluorescence. Les cellules PAX6+ étaient présentes à l’intérieur de l’organoïde, tandis que les cellules SATB2+ étaient présentes dans les couches supérieures. Des images de la pile Z ont été prises tous les 4,2 μm sur l’ensemble de la coupe tissulaire de 15 μm. Les sections optiques ont été combinées à l’aide de l’option d’empilement de mise au point dans le logiciel Gen5 avec les options par défaut. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations : PAX6 = protéine appariée de la boîte 6 ; SATB2 = protéine spéciale de liaison à la séquence riche en AT 2 ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig3v2.jpg"> Figure 3 : Greffe dose-dépendante de NPC dans des organoïdes cérébraux. Les organoïdes ont été transplantés avec 0 (contrôle négatif), 1 000, 5 000, 10 000 ou 50 000 NPC dérivés de GFP+ iPSC. 1 semaine après la transplantation, les organoïdes ont été imagés sur un Cytation 5 avec un cube filtrant GFP. Le contrôle négatif a été utilisé pour régler le temps d’exposition et d’intégration afin de minimiser l’autofluorescence. Les couleurs plus foncées indiquent une plus grande fluorescence EGFP par rapport au témoin négatif. Barres d’échelle = 100 μm. Ce sont des images 4x de l’ensemble des organoïdes. Après l’imagerie, une soustraction de l’arrière-plan de la boule roulante avec un rayon de pixel de 50 a été effectuée avant l’affichage pour corriger l’intensité de fond variable sur les organoïdes. Les sites d’injection identifiés comme les régions de greffe la plus élevée sont indiqués par une flèche rouge où la greffe était présente. Abréviations : NPC = cellules progénitrices neurales ; GFP = protéine fluorescente verte ; EGFP = GFP améliorée ; iPSC = cellule souche pluripotente induite. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig3v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig4v2.jpg"> Figure 4 : Suivi de la croissance, de la migration et de la persistance des cellules transplantées avec l’imagerie de cellules vivantes en fluorescence. (A) Les organoïdes témoins et transplantés (50 000 NPC dérivés d’iPSC GFP+) ont été suivis par imagerie de cellules vivantes en fluorescence sur une période de 2 à 4 mois à partir de deux ensembles de transplantation indépendants. Des organoïdes témoins négatifs ont été utilisés pour régler le temps d’exposition et d’intégration afin de minimiser l’autofluorescence à chaque point temporel. Les images EGFP ont été capturées à l’aide d’un cube filtrant GFP sur le Cytation 5 à des moments indiqués après la greffe. Les couleurs plus foncées indiquent une fluorescence EGFP plus élevée par rapport au témoin négatif pour ce point temporel. Une soustraction de l’arrière-plan de la boule roulante avec un rayon de pixel de 50 a été effectuée avant l’affichage pour corriger l’intensité de fond variable entre les organoïdes. Les organoïdes ont été placés à peu près dans la même orientation à chaque point temporel, et les images ont été tournées pour assurer la cohérence de l’affichage et montrer clairement la croissance des cellules transplantées. Les sites d’injection identifiés comme les régions de greffe la plus élevée au point temporel le plus précoce sont indiqués par une flèche rouge. Un exemple d’organoïde témoin négatif est illustré au bas de la figure. (B) Des exemples d’images 20x sont montrées à partir d’organoïdes greffés à la semaine 1 et à la semaine 15 après la transplantation. Le contraste local a été amélioré avant l’affichage à l’aide de FIJI pour assurer la visibilité des neurites. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations : NPC = cellules progénitrices neurales ; GFP = protéine fluorescente verte ; EGFP = GFP améliorée ; iPSC = cellule souche pluripotente induite. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig4v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig05.jpg"> Figure 5 : Immunofluorescence des coupes histologiques révélant la persistance des NPC transplantés au site d’injection ainsi que la migration et la différenciation neurale. Images de fluorescence monocanal provenant d’organoïdes (A) non injectés et (B) transplantés. L’image superposée à droite montre les trois canaux d’intérêt (NESTIN, TUJ1 et EGFP), mais n’inclut pas DAPI. Les minimums d’affichage ont été fixés pour exclure uniquement le signal des cellules négatives (déterminées pour l’EGFP à partir de la commande non injectée et pour d’autres canaux en fonction de combinaisons de marqueurs connues). Les maximums d’affichage étaient basés sur le signal le plus élevé observé pour cet anticorps dans n’importe quelle cellule. Les plages d’affichage ont été maintenues constantes entre les organoïdes non injectés et transplantés pour permettre une comparaison directe. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations : NPC = cellules progénitrices neurales ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole ; TUJ1 = tubuline bêta-III ; EGFP = protéine fluorescente verte améliorée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig6v2.jpg"> Figure 6 : Évaluation de l’état de différenciation et de localisation des cellules greffées par immunofluorescence cyclique des coupes histologiques. Des images de fluorescence monocanal provenant des organoïdes non injectés, (A) assortis selon l’âge et (B) transplantés sont montrées pour la première et la deuxième série de coloration, comme indiqué. Les minimums d’affichage ont été fixés pour exclure uniquement le signal des cellules négatives (déterminées pour l’EGFP à partir de la commande non injectée et pour d’autres canaux en fonction de combinaisons de marqueurs connues). Les maximums d’affichage étaient basés sur le signal le plus élevé observé pour cet anticorps dans n’importe quelle cellule. Les plages d’affichage (et bien sûr, les paramètres d’imagerie) ont été maintenues constantes entre le contrôle et les organoïdes injectés pour permettre une comparaison directe. Barres d’échelle = 100 μm. Une image superposée (à l’exception du DAPI) est affichée pour chaque cycle de coloration pour chaque organoïde à droite. (B) Pour l’organoïde injecté où l’enregistrement d’image a été effectué, toutes les images sont recadrées à la région observée dans les deux cycles de coloration. (B, C) Pour l’organoïde injecté, les régions cellulaires EGFP+ sont délimitées en bleu. Un diagramme de la façon dont DAPI est utilisé pour faire correspondre les caractéristiques lors de l’alignement d’images est présenté en (C), suivi d’une fusion globale de l’image enregistrée. Abréviations : DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole ; TUJ1 = tubuline bêta-III ; EGFP = protéine fluorescente verte améliorée ; MAP2 = protéine 2 associée aux microtubules ; GFAP = protéine acide fibrillaire gliale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig6v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Clone</td>
			<td>Fluorophore</td>
			<td>Concentration</td>
		</tr><tr><td>Anti-NESTIN</td>
			<td>10C2</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1 sur 2 000</td>
		</tr><tr><td>Anti-TUBB3</td>
			<td>TUJ1</td>
			<td>AlexaFluor 647</td>
			<td>1 sur 2 000</td>
		</tr><tr><td>Anti-GFP</td>
			<td>FM264G</td>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>1 sur 200</td>
		</tr><tr><td>Anti-GFAP</td>
			<td>SMI 25</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1 sur 500</td>
		</tr><tr><td>Anti-MAP2</td>
			<td>SMI 52</td>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>1 sur 1 000</td>
		</tr><tr><td>Anti-PAX6</td>
			<td>O18-1330</td>
			<td>AlexaFluor 647</td>
			<td>1 sur 100</td>
		</tr><tr><td>Anti-SATB2</td>
			<td>EPNCIR130A</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1 sur 500</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Concentrations d’anticorps pour la coloration. Abréviations : TUBB3 = bêta-tubuline III ; GFP = protéine fluorescente verte ; GFAP = protéine acide fibrillaire gliale ; MAP2 = protéine 2 associée aux microtubules ; PAX6 = protéine appariée de la boîte 6 ; SATB2 = protéine spéciale de liaison à la séquence riche en AT 2.

Nous décrivons ici un protocole pour la transplantation et le suivi de cellules neurales marquées dans des organoïdes cérébraux humains.

Un modèle organoïde cérébral humain de transplantation de cellules neurales

The advancement of cell transplantation approaches requires model systems that allow an accurate assessment of transplanted cell functional potency. For ...

Avec l’intérêt croissant pour les thérapies cellulaires, de nouvelles méthodes pour évaluer la fonctionnalité de ces cellules sont nécessaires. Ce protocole permet une évaluation in vitro à long terme de ces greffes cellulaires dans un contexte neuronal. Le principal avantage de cette technique est que tous les composants proviennent d’une origine humaine.En outre, la greffe peut être facilement suivie et l’environnement de l’organoïde peut être facilement modifié, ce qui permet de tester différents médicaments ou types de traitements. La démonstration de cette technique sera faite par Iliana Ibanez, une doctorante talentueuse de mon laboratoire. Commencez par retirer de la glace la suspension unicellulaire de cellules souches pluripotentes induites ou de cellules progénitrices neurales dérivées d’iPSC, ou NPC, et centrifugez-les à 300 g pendant cinq minutes à 4 degrés Celsius.Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 3 milligrammes par millilitre de matrice de membrane basale solubilisée pour obtenir un volume final de deux microlitres par injection. Remettez immédiatement la suspension sur la glace jusqu’à utilisation. Transférez la seringue pré-réfrigérée du congélateur à 20 degrés Celsius dans un seau à glace pour une utilisation ultérieure.Ensuite, retirez la plaque d’organoïde cérébral de l’incubateur et transférez-le dans une boîte de 35 millimètres à l’aide d’une pointe à large alésage. Pour stabiliser les organoïdes et faciliter l’injection, retirez le milieu autant que possible sans endommager l’organoïde. Placez la boîte de 35 millimètres contenant l’organoïde sous un microscope à dissection pour faciliter l’injection.Une fois que les organoïdes sont prêts à être injectés, remettre doucement en suspension les cellules NPC marquées EGFP à l’aide d’une pointe de pipette P20 réfrigérée, et déplacer deux microlitres de ces cellules sur une lame de verre stérile pré-refroidie. Prenez une seringue à insuline préremplie dans la glace et aspirez lentement les 2 microlitres de suspension cellulaire avec le biseau de l’aiguille vers le bas. Ouvrez le couvercle de la boîte contenant l’organoïde avant de focaliser le microscope dessus.Tenez le plat d’une main, placez le biseau de l’aiguille vers le haut. Et de l’autre main, injectez lentement la cellule dans la surface de l’organoïde. Après avoir injecté les cellules, remettez le couvercle dans la boîte et incubez l’organoïde injecté pendant une à deux minutes.Ensuite, ajoutez doucement 500 microlitres de milieu organoïde à la plaque avant de transférer l’organoïde dans une plaque de 24 puits avec une pointe à large alésage. Incuber l’organoïde à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avec un changement complet de milieu tous les deux jours. Chargez un organoïde non injecté ou de contrôle négatif dans un microscope à fluorescence.Et réglez l’intensité d’éclairage entre 1 et 2 et le temps d’exposition entre 80 et 100 millisecondes pour une autofluorescence minimale. Ensuite, chargez l’organoïde témoin positif et augmentez le temps d’exposition pour vous assurer que les cellules marquées sont visibles. Repositionnez l’organoïde avec une pointe de pipette à large diamètre pour trouver la protéine fluorescente verte améliorée ou la région EGFP plus pour l’injection.Retirez complètement le milieu de l’organoïde avant de charger l’organoïde. Et imaginez-le avec les paramètres sélectionnés. Une fois l’imagerie terminée, ajoutez immédiatement un milieu frais pour éviter que l’organoïde ne se dessèche.Après avoir répété le retrait du milieu et l’imagerie de tous les organoïdes, remettre les organoïdes à l’incubation normale et changer de milieu. Répétez l’imagerie aux intervalles souhaités. Placez la lame dans un bocal de coloration de diapositive Coplin rempli de toluène pendant deux minutes et répétez cette étape.Ensuite, transférez la lame de verre dans un bocal de coloration de diapositive en verre Coplin rempli d’alcool éthylique à 100 % pendant deux minutes. Et répétez cette étape avant de transférer la lame dans un bocal Coplin rempli d’eau pendant deux minutes. Répétez le lavage à l’eau.Ensuite, placez un récipient en plastique dans le bain-marie, en veillant à ce que le plastique ne touche pas le fond du bain. Versez le tampon de citrate à l’intérieur du récipient en plastique et laissez-le atteindre 95 à 100 degrés Celsius. Une fois que le tampon atteint la température souhaitée, placez les lames à l’intérieur du tampon et couvrez sans serrer le récipient avec un couvercle, en laissant les lames à l’intérieur du bain-marie pendant 30 à 40 minutes.Après l’incubation, retirez le récipient en plastique du bain-marie et laissez-le refroidir à température ambiante pendant 20 minutes. Lavez les lames trois fois pendant deux minutes chacune avec du PBS. Retirez le PBS avec un mouchoir en papier sans toucher l’échantillon.Préparez le tampon de perméabilisation et remplissez-en un bocal de coloration pour lames de verre. Plongez les lames dans le tampon de perméabilisation et incubez pendant 10 minutes. Répétez trois lavages de PBS pendant deux minutes chacun.Ensuite, préparez un mélange de coloration pour couvrir chaque échantillon et ajoutez 25 microlitres à la lame organoïde avant d’incuber la lame à température ambiante pendant une heure. Après l’incubation, répétez trois lavages de PBS pendant deux minutes chacun et éliminez les sels en rinçant la lame avec de l’eau distillée à l’intérieur d’un bocal de coloration en verre. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de supports liquides et de DAPI à chaque échantillon avant d’imager la lame à l’aide du microscope à fluorescence.Dans le bocal de coloration Coplin en verre rempli à moitié de tampon de trempe 2X, ajoutez 45 millilitres de PBS et placez les lames à l’intérieur de ce pot. Incuber le pot pendant la nuit à 4 degrés Celsius. Utilisez la microscopie à fluorescence pour vérifier si les fluorophores ont été efficacement éteints avant de répéter la coloration et l’imagerie.Une dépendance claire de la dose de fluorescence GFP était présente sur le nombre de cellules d’entrée, avec une détection constante de l’EGFP et des patchs cellulaires à 10 000 cellules et plus. Les organoïdes injectés et les témoins imagés pour la positivité de l’EGFP ont montré la persistance du site injecté tout au long de la période de suivi de quatre mois. D’autres patchs cellulaires positifs à l’EGFP sont apparus neuf jours après la transplantation et ont persisté jusqu’au point final de l’étude, indiquant la migration des cellules et leur intégration à leurs nouveaux sites.À un grossissement plus élevé, une morphologie neurale claire était observable avec de longues projections dans l’organoïde, confirmant l’intégration des cellules injectées. La coloration initiale en un seul tour a confirmé la présence de cellules EGFP plus au site d’injection, y compris un mélange de cellules conservant le statut de NPC et de cellules qui s’étaient différenciées vers un destin neural. Pour les organoïdes témoins et injectés, très peu de Nestin et de NPC ont été observés, avec une majorité de TUJ1 et de neurones matures immatures.Les deux colorations rondes ont donné plus de détails, révélant des neurones matures autour de la majeure partie de la région externe de l’organoïde, avec des zones de neurones immatures vers le milieu. Les astrocytes étaient présents dans les organoïdes injectés et témoins, et étaient intercalés sur les bords extérieurs. La tranche pour laquelle la coloration à deux rondes a été réalisée dans l’organoïde injecté a montré une petite colonie satellite d’EGFP plus des cellules éloignées du site d’injection qui avait adopté le phénotype des neurones matures.Certaines de ces colonies semblent être proches des astrocytes. Cependant, aucune cellule EGFP plus avec un chevauchement complet de la coloration GFP suggère qu’elles étaient adjacentes plutôt que de générer les astrocytes eux-mêmes. Lorsque vous injectez l’organoïde, vous devez éviter d’appliquer trop de force ou de le faire trop rapidement, car vous pouvez détruire complètement l’organoïde.Ainsi, après le suivi de la vie, les organoïdes peuvent être associés et utilisés pour l’analyse par cytométrie en flux ou les approches de séquençage de cellules uniques. Cela nous permettra de connaître l’état moléculaire des cellules. Cette technique pourrait être extrêmement utile pour faire progresser la thérapie cellulaire pour les maladies neurodégénératives, également pour modéliser les tumeurs cérébrales ou les métastases.

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Neuroscience

Neurosciences

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