Détection et quantification d’un peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP) dans le plasma humain à l’aide d’un dosage immuno-enzymatique modifié

Ce protocole ELISA modifié permet la purification et la quantification précise du CGRP dans le plasma humain. Il a fait l’objet des expériences de validation nécessaires et peut servir à normaliser les futures méthodologies de quantification. Ce protocole offre les avantages d’inclure le traitement des échantillons avant une dégradation significative de la protéase, la purification par extraction en phase solide et la limitation de la liaison non spécifique par application d’un tampon de blocage aux plaques de microtitrage.

Le CGRP joue un rôle punitif dans la physiopathologie de la migraine et peut-être un candidat au statut de biomarqueur. Il a également été impliqué dans des processus cardiovasculaires, dermatologiques, viraux et même liés à la COVID-19. Pour commencer, prélevez 5 millilitres de sang total de la veine antécubitale par des méthodes de ponction veineuse standard dans un tube EDTA vacutainer de 6 millilitres.

Pour bloquer la lyse du peptide cible, ajoutez 0,5 millilitre d’inhibiteur de la sérine protéase compétitive de l’aprotinine. Retourner le tube 10 fois et le conserver sur de la glace jusqu’à l’étape suivante. Ensuite, centrifuger le tube à 600 4g pendant quatre minutes à 4 degrés Celsius.

Et transférer la fraction plasmatique dans un flacon cryogénique stérile à fond rond de 2 millilitres. Conservez immédiatement le flacon cryogénique à moins 80 degrés Celsius pendant deux semaines. Pour extraire l’échantillon de plasma, placez une cartouche d’extraction à l’intérieur d’un tube centrifuge conique de 15 millilitres.

Faites passer 5 millilitres de 100% de méthanol, puis 10 millilitres d’eau ultrapure à travers la cartouche pour l’activer. Le fluide sera recueilli dans le tube lorsqu’il traversera la cartouche par un écoulement entraîné par gravité. Éliminez l’excès de liquide accumulé pour l’empêcher d’engloutir la cartouche et assurez-vous qu’il ne sèche pas pendant l’expérience.

Diluez 250 microlitres de plasma dans 750 microlitres d’acide acétique à 4% et faites-le passer lentement dans la cartouche. Ensuite, lavez la cartouche avec 10 millilitres d’acide acétique. Une fois l’excès de liquide retiré, transférez la cartouche dans un nouveau tube centrifuge conique de 15 millilitres.

Préparer 3 millilitres de solution d’acide acétique au méthanol pour éluer le peptide apparenté au gène de la calcitonine ou CGRP. Passez 1 millilitre de celui-ci à travers la cartouche et attendez 25 minutes entre chaque élution. Après la dernière élution, le tube contient 3 millilitres d’éluant total.

Transférez 1 millilitre d’éluant dans un tube microcentrifuge de 1,7 millilitre et faites-le tourner dans une mini-centrifugeuse pendant une seconde pour régler l’éluant. Sécher ensuite l’échantillon dans une centrifugeuse sous vide à 1 400 tr / min et 4 degrés Celsius. Immédiatement avant l’essai, reconstituer l’échantillon séché à l’aide d’immunodosage enzymatique décongelé ou d’un tampon EIA.

Pour le blocage des plaques, ajoutez 250 microlitres de tampon bloquant la gélatine de poisson TBS à chaque puits. Placez une feuille de couverture sur la plaque et incuber pendant deux heures à température ambiante. Après l’incubation, retirez la feuille de couverture et videz la plaque en la retournant.

Ensuite, épongez l’assiette sur une serviette en papier pour éliminer toute trace de liquide et séchez-la dans une hotte à flux laminaire pendant 10 minutes. Une fois que la plaque est visiblement sèche, placez-la dans une pochette en aluminium scellée avec un sachet déshydratant en gel de silice. Conservez-le à moins 20 degrés Celsius pendant 24 heures.

Avant d’effectuer le test, décongeler tous les échantillons et préparer les réactifs à température ambiante. Pour rincer les puits de la plaque de bloc, ajoutez 300 microlitres de tampon de lavage et laissez-le reposer pendant 30 secondes. Ensuite, jetez le tampon de lavage et répétez le rinçage cinq fois.

Après le dernier rinçage, éponger la plaque comme indiqué précédemment. Ensuite, distribuez 100 microlitres de tampon EIA aux deux puits de liaison non spécifiques ou NSB dédiés. Ajouter 100 microlitres des normes CGRP, suivis de l’échantillon reconstitué et du contrôle de la qualité en double dans les puits appropriés.

Ajouter 100 microlitres de traceur CGRP à chaque puits, à l’exception des puits vierges. Enfin, scellez la plaque à l’aide d’une feuille de couverture transparente, en veillant à ce que les échantillons et les réactifs ne s’évaporent pas, et incuber la plaque pendant 16 à 20 heures à 4 degrés Celsius. Lorsque la période d’incubation est terminée, préparez le réactif d’Ellman conformément aux instructions du fabricant.

Une fois la plaque décantée, lavez chaque puits trois fois comme démontré précédemment. Après le dernier rinçage, agiter la plaque à 120 tr/min pendant deux minutes. Encore une fois, rincez la plaque trois fois et épongez-la.

Tapotez la plaque inversée jusqu’à ce que le liquide soit visiblement retiré des puits. Ajoutez ensuite 200 microlitres de réactif d’Ellman dans chaque puits, à l’exception des puits vierges. Une fois la plaque recouverte, enveloppez-la dans du papier d’aluminium pour éviter toute exposition à la lumière et incuberez-la dans l’obscurité à température ambiante pendant une heure avant d’enregistrer l’absorbance.

La présente étude a démontré que l’ajout de l’étape de blocage, les taux de récupération dans chaque échantillon de pointe du CGRP se situaient dans la plage acceptable. Cependant, lorsque l’étape de blocage a été exclue, la liaison non spécifique a entraîné des taux de récupération dépassant la limite supérieure de 125%Il est important d’ajouter de l’aprotinine pour conserver les échantillons de sang peu de temps après le prélèvement afin de limiter la dégradation du CGRP. En outre, le tampon de blocage devrait être ajouté à la plaque de microtitrage avant le test ELISA afin de réduire davantage la liaison non spécifique.

Ce protocole peut donc être utilisé pour explorer la candidature du CGRP en tant que biomarqueur de la migraine vestibulaire en quantifiant les niveaux de CGRP chez les patients plasmatiques souffrant de migraine et de migraine vestibulaire par rapport aux témoins.