Transformation génétique médiée par Agrobacterium tumefaciens du plantain à feuilles étroites

Les espèces de Plantago peuvent être utilisées comme plantes modèles pour la biologie vasculaire végétale et la physiologie du stress. L’établissement d’un protocole de transformation permet d’étudier en profondeur ces plantes les relations entre les gènes et leur phénotype associé. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise les aliments comme explants pour transformer le plantain à feuilles étroites avec une grande efficacité.

Pour commencer, placez les graines sauvages de type Plantago lanceolata disponibles dans le commerce dans un tube à centrifuger de 50 millilitres jusqu’à la marque de 5 millilitres, en fonction du nombre de plantes souhaitées. Plongez les graines dans de l’éthanol à 75 % pendant 60 secondes. Après avoir jeté l’éthanol, plongez les graines dans de l’hypochlorite de sodium à 20% fraîchement préparé pendant 40 minutes en retournant doucement le tube.

Sous une hotte stratifiée, jeter la solution d’hypochlorite de sodium, puis laver les graines cinq fois avec de l’eau distillée. Ajoutez un petit volume d’eau aux graines après le rinçage final, car cela peut aider à faciliter le mouvement des plantes sur les assiettes. À l’aide d’une pince stérile, transférer les graines sur une boîte de Petri préparée à l’avance avec un milieu MS solide en répartissant les graines uniformément sur la surface de la plaque, environ 1 centimètre entre chaque graine pour éviter le surpeuplement des plantules en germination.

Scellez la plaque avec deux couches de film de paraffine pour éviter la contamination et incuber sous une lampe de culture blanche froide à température ambiante. Une fois que les plantules ont germé et sont assez grosses pour être transférées, généralement après deux ou trois jours de germination, utilisez des pinces stériles et transférez les plantules dans des boîtes stériles contenant de 50 à 100 millilitres de MS Medium. Scellez les boîtes avec du ruban chirurgical et laissez les plantes pousser sous la lumière de croissance blanche et froide pendant environ trois à quatre semaines.

Streak Agrobacterium tumefaciens contenant le plasmide désiré sur une plaque LB solide préparée avec l’agent de sélection approprié. Incuber la plaque scellée à la paraffine à 28 degrés Celsius jusqu’à 48 heures, ou jusqu’à ce que la bactérie devienne assez grosse pour être cueillie. Après l’incubation, choisissez une colonie de bactéries à l’aide d’une pointe de pipette deux jours avant la transformation et inoculez-la dans un tube à fond rond de 15 millilitres contenant six millilitres de LB liquide avec l’agent de sélection approprié.

Secouez à 200 tr / min dans un agitateur de table de 28 degrés Celsius, pendant la nuit, jusqu’à ce que le OD 600 atteigne 0,6 à 0,7. Une fois que les bactéries atteignent la DO requise, transférer 200 microlitres de la culture bactérienne dans une fiole stérile contenant 100 millilitres de LB avec l’agent de sélection. Secouer à 200 tr/min à 28 degrés Celsius, toute la nuit.

Ensuite, transférez la culture bactérienne dans des tubes centrifugés stériles de 50 millilitres et centrifugez à 2 200 G pendant 10 minutes à température ambiante pour recueillir les bactéries. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille bactérienne dans cinq millilitres de solution de suspension fraîchement préparée ou de SS à température ambiante par pipetage. Ensuite, ajoutez plus de SS jusqu’à la marque de 50 millilitres et inversez pour mélanger plusieurs fois.

Une fois que les plantes atteignent le stade idéal de transformation, dans environ trois semaines, utilisez des pinces et des ciseaux stériles pour séparer les racines de la plante et jeter la feuille et le matériel de la tige. Immédiatement après la coupe, transférer aseptiquement les morceaux de racines dans des boîtes contenant de l’eau stérile à l’aide d’une pince pour les garder hydratés. Ensuite, versez la culture bactérienne d’Agrobacterium tumefaciens en suspension SS dans des boîtes de Petri jetables stériles de 150 par 15 millimètres.

Transférer les racines coupées dans la culture bactérienne et incuber pendant au moins 20 minutes. Pendant l’incubation, utilisez un scalpel stérile avec une lame tranchante pour couper les racines en fragments d’un centimètre séparant les racines primaires des racines latérales. Ensuite, faites de fines coupures peu profondes à la surface des racines pour permettre aux bactéries d’infecter la plante.

Après l’incubation, transférer les morceaux de racines dans des serviettes en papier stériles pour éliminer l’excès de bactéries. Ensuite, transférer les racines séchées dans les boîtes de Petri préparées contenant des milieux de co-culture solides environ 10 à 20 racines par assiette en fonction de la taille des racines. Scellez les plaques avec deux couches de film plastique transparent, puis avec du papier d’aluminium pour incuber à température ambiante pendant trois jours.

Après trois jours d’incubation. Dans les milieux de co-culture, transférer les morceaux de racines dans des boîtes de Petri préparées avec un milieu d’induction de pousses solides ou SIM avec 500 milligrammes par litre de témétine et une sélection appropriée d’antibiotiques. Incuber les plaques scellées en film plastique transparent sous une lampe de culture pendant un mois ou jusqu’à ce que les pousses commencent à émerger.

Une fois que les plantules poussent de 1,5 à 2,0 centimètres de long. Transférez-les dans des boîtes stériles préparées. Avec un milieu d’induction racinaire solide.

Cultivez les plantes sous une lampe de culture pendant plusieurs semaines jusqu’à ce que les racines se forment. En règle générale, après une semaine, lorsque les systèmes racinaires deviennent assez grands pour être transférés, généralement après un mois de croissance, prenez la plante et lavez doucement les racines avec de l’eau pour enlever tout milieu qui colle aux racines. Ensuite, transférez les plantes dans des pots carrés de 3,5 pouces contenant du sol tout usage pré-mouillé BM sept couvrir les plantes avec un couvercle de rempotage en plastique, puis avec un sac en plastique transparent pour s’assurer que les plantes restent dans un environnement humide.

Cette méthode a été testée sur la feuille racinaire et le vieux tissu petit. Dans l’expérience préliminaire, bien que la callosité puisse être induite dans tous les types de tissus, seul le tissu racinaire a produit des initiales de pousses après un mois dans SIM, la feuille et la pédale sont devenues brunes et sont mortes. La progression des initiales des pousses émergeant des tissus transformés a été observée dès le premier jour.

Les racines ont été placées sur la carte SIM jusqu’au moment où les pousses étaient prêtes à être enracinées. Après une semaine, le tissu racinaire a formé une callosité au début des initiales de pousse. Les pousses ont continué à émerger pendant les semaines deux et trois et après quatre semaines, les pousses étaient prêtes à être transférées dans le milieu d’induction racinaire.

L’identification des plantes transgéniques punitives a été réalisée à l’aide du test histochimique GUS bêta-glucuronidase utilisant les segments de feuilles prélevés une fois que les pousses mesuraient environ 0,5 centimètre de long. Le type sauvage dans la transformation avec des vecteurs vides ne présente aucun motif de coloration. En raison de l’absence du gène GUS, la transformation avec le gène GUS bêta glucuronidase a montré un motif de coloration bleu clair dans les veines confirmant que les plantes sont transgéniques Les racines doivent toujours être maintenues hydratées pour éviter le dessèchement pendant la procédure, transférez les racines environ 10 à la fois pour éviter cela.