Name: Ex Vivo Expansion et manipulation génétique de cellules souches hématopoïétiques de souris dans des cultures à base d’alcool polyvinylique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Apprenez l'expansion et la manipulation génétique de cellules souches hématopoïétiques de souris en culture ex vivo. Cette méthode permet d'étudier l'hématopoïèse et la biologie des CSH.

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<li>Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+potential+of+murine+hematopoietic+stem+cells%3A+a+rare+property+only+partially+predicted+by+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+guide+RNA+design+guidelines+for+efficient+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing.</a> Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).</li>
<li>Hanna, R. E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).</li>
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<li>Ieyasu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+all-recombinant+protein-based+culture+system+specifically+identifies+hematopoietic+stem+cell+maintenance+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Nous espérons que ce protocole fournira une approche utile pour étudier la biologie des CSH, l’hématopoïèse et l’hématologie plus généralement. Depuis le développement initial de la méthode de culture à base de PVA pourles CSH 8 purifiés par FACS, la méthode a été étendue. Par exemple, il a été démontré que la méthode fonctionne avec c-Kit enrichi en moelle osseuse et avec des plaques chargées en surface négative14. Sa compatibilité avec la transduction et l’électroporation...

Le système hématopoïétique soutient une gamme de processus essentiels chez les mammifères, de l’apport d’oxygène à la lutte contre les agents pathogènes, en passant par des types de cellules sanguines et immunitaires spécialisées. La production sanguine continue (hématopoïèse) est nécessaire pour soutenir l’homéostasie du système sanguin, qui est soutenue par les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC)1. La cellule hématopoïétique la plus primitive est la cellule souche hématopoïétique (CSH), qui possède des capacités uniques d’auto-renouvellement et de différenciation multilignée 2,3. Il s’agit d’une population de cellules rares, principalement dans la moelle osseuseadulte 4, où elles se produisent à une fréquence d’environ une toutes les 30 000 cellules. On pense que les CSH soutiennent l’hématopoïèse à vie et aident à rétablir l’hématopoïèse après un stress hématologique. Ces capacités permettent également aux CSH de reconstituer de manière stable l’ensemble du système hématopoïétique après la transplantation chez un receveur irradié5. Cela représente la définition fonctionnelle d’un CSH et constitue également la base scientifique de la thérapie de transplantation de CSH, un traitement curatif pour une gamme de maladies sanguines et immunitaires6. Pour ces raisons, les CSH sont un centre majeur de l’hématologie expérimentale.
Malgré un vaste centre de recherche, il est resté difficile d’étendre de manière stable les CSH ex vivo7. Nous avons récemment développé le premier système de culture d’expansion ex vivo à long terme pour les CSH8 de souris. L’approche peut multiplier par 234 à 899 les CSH transplantables sur une culture de 4 semaines. Par rapport aux approches alternatives, le principal changement dans le protocole a été l’élimination de l’albumine sérique et son remplacement par un polymère synthétique. L’alcool polyvinylique (PVA) a été identifié comme un polymère optimal pour les cultures HSC8 de souris, qui a maintenant également été utilisé pour la culture d’autres types de cellules hématopoïétiques9. Cependant, un autre polymère appelé Soluplus (un copolymère greffé de caprolactame-acétate-polyéthylèneglycol) a également été identifié récemment, ce qui semble améliorer l’expansion clonale du CSH10. Avant l’utilisation de polymères, on utilisait de l’albumine sérique sous forme de sérum fœtal bovin, de fraction V de l’albumine sérique bovine ou d’albumine sérique recombinante, mais ceux-ci avaient un soutien limité pour l’expansion des CSH et ne supportaient qu’une culture ex vivo à court terme (~ 1 semaine)7. Cependant, il convient de noter que les protocoles de culture de CSH qui maintiennent les CSH dans un état de repos peuvent soutenir un temps de culture ex vivo plus long11,12.
En comparaison avec d’autres méthodes de culture, un avantage majeur des cultures à base de PVA est le nombre de cellules qui peuvent être générées et la durée pendant laquelle le protocole peut être utilisé pour suivre les CSH ex vivo. Cela permet de surmonter plusieurs obstacles dans le domaine de l’hématologie expérimentale, tels que le faible nombre de CSH isolables par souris (seulement quelques milliers) et la difficulté de suivre les CSH dans le temps in vivo. Cependant, il est important de se rappeler que ces cultures stimulent la prolifération des CSH, alors que le pool de CSH in vivo est principalement au repos à l’étatd’équilibre 13. De plus, bien que les cultures soient sélectives pour les CSH, d’autres types de cellules s’accumulent avec les cultures au fil du temps, et les CSH transplantables ne représentent qu’environ une cellule sur 34 après 1 mois. Les cellules progénitrices hématopoïétiques myéloïdes semblent être le principal type de cellules contaminantes dans ces cultures de CSH8. Néanmoins, nous pouvons utiliser ces cultures pour enrichir les CSH à partir de populations cellulaires hétérogènes (par exemple, les CSSP de moelle osseuse c-Kit+ 14). Il prend également en charge la transduction ou l’électroporation des CSH pour la manipulation génétique14,15,16. Pour aider à identifier les CSH de la population hétérogène de CSHS cultivées, le CD201 (EPCR) a récemment été identifié comme un marqueur de CSH ex vivo 10,17,18 utile, avec des CSH transplantables limitées à la fraction CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lignée.
Ce protocole décrit les méthodes d’initiation, de maintenance et d’évaluation des cultures d’expansion de CSH chez souris à base de PVA, ainsi que les protocoles de manipulation génétique au sein de ces cultures par électroporation ou transduction de vecteurs lentiviraux. Ces méthodes devraient être utiles pour une gamme d’hématologues expérimentaux.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td>Dissection Kit Fisher Scientific 12764416 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Appleton Woods Ltd</td><td>HC002</td><td></td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X</td><td>Kit Lonza&nbsp ;</td><td>V4XP-3024</td><td></td></tr><tr><td>Pilon et mortier</td><td>Scientific Laboratory Supplies Limited</td><td>X18000</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL seringue</td><td>VWR International Ltd</td><td>720-2519</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 19 G</td><td>VWR International Ltd</td><td>613-5394</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu ; crépine à cellules m</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2317</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu ; m filtre cellulaire</td><td>Corning</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech lingettes</td><td>VWR International Ltd</td><td>115-2075</td><td></td></tr><tr><td>LS Colonne MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nucléase V3, 100 &mu ; g</td><td>IDT&nbsp ;</td><td></td><td></td>1081058</tr><tr><td>Facteur de cellules souches de souris recombinantes animales&nbsp ;</td><td>Peprotech</td><td>AF-250-03</td><td></td></tr><tr><td>Thrombopoïétine de souris recombinante libre</td><td>animale Peprotech</td><td>AF-315-14</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD117 APC (clone : 2B8)</td><td>ThermoFisher</td><td>17-1171-83</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD117 BV421 (clone : 2B8)</td><td>Biolegend</td><td>105828</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD127&nbsp ; APC/Cy7 (clone : A7R34)</td><td>Biolegend</td><td>135040</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD127 biotine (clone : A7R34)</td><td>Biolegend</td><td>135006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD150 PE/Cy7 (clone : TC15-12F12.2)</td><td>Biolegend</td><td>115914</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD201&nbsp ; APC (clone : eBio1560)</td><td>ThermoFisher</td><td>17-2012-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD34 FITC (clone : RAM34)</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0341-85</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD4&nbsp ; APC/Cy7 (clone : RM4-5)</td><td>Biolegend</td><td>100526</td><td></td></tr><tr><td>Biotine CD4 anti-souris (clone : RM4-5)</td><td>Biolegend</td><td>100508</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD45R&nbsp ; APC/Cy7 (clone : RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103224</td><td></td></tr><tr><td>Biotine CD45R anti-souris (clone : RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD48 BV421 (clone : HM48-1)</td><td>Biolegend</td><td>103428</td><td></td></tr><tr><td>Biotine CD8 anti-souris (clone : 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100704</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD8a&nbsp ; APC/Cy7 (clone : 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100714</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris Ly6G/Ly6C&nbsp ; APC/Cy7 (clone : RB6-8C5)</td><td>Biolegend</td><td>108424</td><td></td></tr><tr><td>Biotine anti-souris Ly6G/Ly6C (clone : RB6-8C5)</td><td>Biolegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris Sca1 PE (clone : D7)</td><td>Biolegend</td><td>108108</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris Ter119&nbsp ; APC/Cy7 (clone : TER-119)</td><td>Biolegend</td><td>116223</td><td></td></tr><tr><td>Biotine Ter119 anti-souris (clone : TER-119)</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>Plaques CellBIND, 24 puits</td><td>Corning</td><td>3337</td> à <td>charge négative en surface</td></tr><tr><td>, 96 puits.</td><td>Corning</td><td>3330</td><td>à charge de surface négative</td></tr><tr><td>SgRNA synthétique personnalisé&nbsp ;</td><td>Synthego, Sigma Aldrich, IDT</td><td>Commande</td><td></td>personnalisée</tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Merck Life Science UK Limited</td><td>F7524-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Plaques enrobées de fibronectine, 96 puits</td><td>BD Biosciences</td><td>354409</td><td></td></tr><tr><td>Mélange de nutriments F-12</td><td>de Ham Gibco</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Insuline-Transferrin-Selenium-X (100x)</td><td>Gibco</td><td>51500.056</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61196. </td><td></td>AP</tr><tr><td>Alcool polyvinylique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>Enzo Life Sciences (UK) Ltd</td><td>EXB-0018</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine APC/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>405208</td><td></td></tr><tr><td>T&uuml ; rks' solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>109277</td><td></td></tr><tr><td>Virkon</td><td>Mettler-Toledo Ltd</td><td>95015662</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo expansion et manipulation génétique de cellules souches hématopoïétiques de souris dans des cultures à base d’alcool polyvinylique

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Les cellules souches hématopoïétiques multipotentes (CSH) autorenouvelables sont un type cellulaire important en raison de leur capacité à soutenir l’hématopoïèse tout au long de la vie et à reconstituer l’ensemble du système sanguin après la transplantation. Les CSH sont utilisées cliniquement dans les thérapies de transplantation de cellules souches, qui représentent un traitement curatif pour une gamme de maladies du sang. Il existe un intérêt considérable à la fois pour la compréhension des mécanismes qui régulent l’activité des CSH et de l’hématopoïèse, et pour le développement de nouvelles thérapies basées sur les CSH. Cependant, la culture stable et l’expansion des CSH ex vivo ont été un obstacle majeur à l’étude de ces cellules souches dans un système ex vivo traitable. Nous avons récemment développé un système de culture à base d’alcool polyvinylique qui peut soutenir l’expansion à long terme et à grande échelle des CSH de souris transplantables et des méthodes pour les modifier génétiquement. Ce protocole décrit les méthodes de culture et de manipulation génétique des CSH de souris par électroporation et transduction lentivirale. Ce protocole devrait être utile à un large éventail d’hématologues expérimentaux intéressés par la biologie des CSH et l’hématopoïèse.

Pour la purification FACS des CSH, nous nous attendons à ce que dans la moelle osseuse enrichie en c-Kit, ~0,2% des cellules soient la population CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage- pour les jeunes souris C57BL/6 (8-12 semaines) (Figure 1). Cependant, il est probable que les souris transgéniques ou les souris d’âges différents présentent des fréquences de CSH différentes. Après 4 semaines de culture, nous nous attendons à ce que la fraction C...

On présente ici un protocole pour initier, maintenir et analyser des cultures de cellules souches hématopoïétiques de souris en utilisant une expansion ex vivo à base d’alcool polyvinylique, ainsi que des méthodes pour les manipuler génétiquement par transduction lentivirale et électroporation.

Ex Vivo Expansion et manipulation génétique de cellules souches hématopoïétiques de souris dans des cultures à base d’alcool polyvinylique

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout ...

Ce protocole permet l’expansion et la manipulation génétique de cellules souches hématopoïétiques fonctionnelles de souris, permettant une compréhension plus approfondie de la biologie des cellules souches hématopoïétiques et de l’hématopoïèse. L’avantage de cette technique est qu’elle peut soutenir les cellules souches hématopoïétiques en culture ex vivo à long terme et permettre la manipulation génétique pour interroger la génétique de l’hématopoïèse. Ce système de culture fournit une technologie de plate-forme pour diverses études sur la biologie des cellules souches hématopoïétiques et l’hématopoïèse, y compris les études génétiques, moléculaires et biochimiques.Le tableau de dépannage répertorie les causes et les solutions aux difficultés courantes rencontrées avec cette technique. Il est beaucoup plus facile et plus efficace de montrer comment extraire correctement les cellules de la moelle osseuse et effectuer des changements de médias complets plutôt que de lire à ce sujet. Pour commencer l’extraction de cellules souches hématopoïétiques, ou CSH, utilisez des lingettes délicates non pelucheuses pour nettoyer les os fraîchement isolés de souris correctement euthanasiées.Retirez les muscles et la moelle épinière des os avant de les ajouter à un mortier contenant environ trois millilitres de PBS. À l’aide d’un pilon, écrasez les os sans les broyer pour minimiser les forces de cisaillement. Ensuite, à l’aide d’une aiguille de calibre 19 fixée à une seringue de 5 millilitres, briser les gros fragments de moelle osseuse libérés dans le PBS et transférer la suspension à travers un filtre de 70 microns dans un tube conique de 50 millilitres.Une fois la suspension transférée, répétez le processus avec du PBS frais jusqu’à ce que les os soient blanchis. Visez un volume final d’environ 30 millilitres par souris et 50 millilitres pour deux souris pour blanchir les os jusqu’à ce que plus aucune moelle ne soit visible. Préparez-vous à l’enrichissement de la colonne en plaçant une colonne de filtration magnétique dans l’aimant d’un séparateur de colonne magnétique avec un filtre de 50 microns sur le dessus et un tube conique de 15 millilitres en dessous.Ensuite, après avoir traité les cellules avec un anticorps anti-c-Kit allophycocyanine et des microbilles magnétiques allophycocyanines, faites passer trois millilitres de PBS stérile à travers le filtre de 50 microns et la colonne de filtration. Une fois que le PBS a traversé, passez la suspension cellulaire à travers la colonne, suivie de trois lavages de trois millilitres de PBS froid à chaque fois. Après chaque lavage, attendez que la colonne cesse de couler avant d’ajouter du PBS pour le prochain lavage.Ensuite, retirez la colonne de l’aimant et placez-la sur un nouveau tube de 15 millilitres et ajoutez cinq millilitres de PBS froid dans la colonne avant d’y installer le piston de colonne et d’éluer les cellules en poussant le piston. Suivez le protocole décrit dans le texte pour préparer suffisamment de milieu HSC pour le nombre souhaité de cellules ou de puits afin d’ensemencer 0,5 à 1 million de cellules par millilitre. Ensuite, faites tourner les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices enrichies en c-Kit, ou HSPC, et remettez la pastille en suspension dans le milieu HSC fraîchement préparé à la densité cellulaire souhaitée.Transférer les cellules sur des plaques recouvertes de fibronectine ou chargées en surface négative, en maintenant un volume approprié. Placez les cellules dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après avoir retiré délicatement la plaque de l’incubateur de culture tissulaire sans perturber les cultures cellulaires, utilisez une pipette ou une pompe à vide pour aspirer lentement environ 90 à 95% du milieu du ménisque liquide de chaque puits.Évitez d’aspirer le milieu à partir de la base du puits. Ajoutez ensuite un millilitre de milieu frais préchauffé à 37 degrés Celsius dans le puits. Remettez la plaque dans l’incubateur de culture tissulaire et changez de milieu tous les deux ou trois jours jusqu’à ce que l’expérience le nécessite.Après avoir remis les cellules en suspension dans un tampon de nucléofection, transférer immédiatement la suspension cellulaire dans le tube de PCR contenant la ribonucléoprotéine complexée, et mélanger doucement en pipetant lentement de haut en bas. Maintenant, transférer le mélange dans une cuvette d’électroporation de volume approprié très lentement, en maintenant un mouvement fluide continu pour éviter de former des bulles d’air à l’intérieur de la cuvette. Ensuite, sur l’électroporateur, sélectionnez la position des puits en cours d’électroporage.À l’aide de l’écran tactile, sélectionnez le programme de type de cellule comme humain CD34 positif ou tapez le code d’impulsion EO100, puis appuyez sur le bouton OK. Transférez la cuvette dans l’électroporateur et appuyez sur le bouton Start de l’écran tactile pour lancer l’électroporation. Immédiatement après l’électroporation, ajouter cinq fois le volume de réaction du milieu de culture à la cuvette.Maintenant, transférez doucement les cellules dans la plaque préparée et replacez la plaque dans l’incubateur de culture tissulaire. Après avoir effectué un changement de milieu comme démontré précédemment, prélever 10 microlitres de cellules et les compter en utilisant la solution de Turk à une dilution de 1:2 avec un hémocytomètre. Replaquer la dose requise de cellules dans des plaques recouvertes de fibronectine pour la transduction, et séparément, plaquer les cellules témoins négatives non transduites.Ajoutez ensuite le vecteur lentiviral à chaque cellule contenant du puits, en maintenant une dose de 20 unités de transduction par cellule pour atteindre une efficacité de transduction d’environ 30%. Cependant, déterminer empiriquement la dose de vecteur lentiviral en fonction des exigences expérimentales. Enfin, remettez les cellules dans l’incubateur de culture tissulaire pendant six heures.Effectuez une modification de support comme décrit précédemment. Le tri cellulaire activé par fluorescence des CSH enrichies en kit c a produit environ 0,2 % des cellules qui étaient CD150-positives, CD34-négatives, c-kit-positives, Sca1-positives et lignées négatives. Après quatre semaines de culture HSPC, les fractions CD201-positive, CD150-positive, c-Kit-positive, Sca1-positive et lignée négative se sont avérées être d’environ 10% Après la transduction avec un vecteur lentiviral exprimant la GFP, les cellules GFP-positives étaient d’environ 30%Lorsqu’elles étaient confluentes, la densité attendue des cultures était d’environ 2 millions de cellules par millilitre.Environ 50 % de la mort cellulaire a été observée dans les 24 à 48 heures précédant le premier changement de milieu. Après une semaine, cependant, le nombre de cellules est revenu à 80 à 100% du nombre de cellules ensemencées. Des changements de milieux précis utilisant des milieux frais et préchauffés sont essentiels pour la stabilité à long terme de cette méthode de culture HSC.Depuis la publication de la méthode originale en 2019, le domaine a commencé à l’utiliser de différentes manières pour étudier la biologie des CSH.

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Ex Vivo Expansion et manipulation génétique de cellules souches hématopoïétiques de souris dans des cultures à base d’alcool polyvinylique (Vidéo) | JoVE Journal

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