Name: Visualisation des sites d’infection précoce de la maladie du souffle du riz (Magnaporthe oryzae) sur l’orge (Hordeum vulgare) à l’aide d’un microscope de base et d’un smartphone (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Découvrez une méthode simplifiée pour visualiser les étapes précoces de l'infection fongique sur Hordeum vulgare sans équipement coûteux. Cette technique accessible permet le criblage rapide des mutants de Magnaporthe oryzae.

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Les auteurs reconnaissent le financement du prix USDA-NIFA 2016-67013-24816.

1. Préparation du matériel expérimental
<ol><li>Préparer la gélose à l’avoine (OMA) en mélangeant la farine d’avoine jusqu’à ce qu’elle soit une poudre fine. Ajouter 25 g de poudre d’avoine et 15 g de gélose à 500 mL deddH2O, et autoclaver sur le cycle du média (ou porter à ébullition pendant 20 min). Versez le média dans des boîtes de Petri stériles de 60 mm. REMARQUE: D’autres types de supports qui induisent la sporulation, tels que la gélose V8, sont acceptables pour ce protocole.</li>
	<li>La plaque M. oryzae filtre les stocks directement sur les plaques OMA à l’aide de pinces stériles et leur permet de couvrir toute la plaque (9-12 jours). Placer les plaques dans un incubateur de croissance à 25 °C avec des cycles jour-nuit de 12h12 pour aider à induire la sporulation. REMARQUE : Certains mutants se développent plus lentement et nécessitent des soins supplémentaires (p. ex., un milieu complet d’abord, puis un transfert à l’OMA), et peuvent prendre une semaine supplémentaire pour produire suffisamment de conidies.</li>
	<li>Plantez directement les graines d’orge (Hordeum vulgare Lacey) dans un milieu de croissance humide (p. ex., terreau sans sol) avec 10 à 15 graines par pot de 6 pouces. Placez les pots dans des plateaux avec 1-2 po d’eau.</li>
	<li>Réglez les conditions de la chambre de croissance de l’orge à 22 °C pendant 12 h (lumière du jour) et à 19 °C pendant 12 h (obscurité) à 60 % d’humidité relative. Continuez à arroser par le fond pour ne pas déranger les graines.</li>
	<li>Cultivez l’orge jusqu’au deuxième stade foliaire, environ pendant 14 jours. À l’aide de ciseaux stériles, coupez le plant d’orge juste au-dessus de la ligne de sol. À l’aide d’une pince et d’un rasoir / scalpel, coupez soigneusement la gaine foliaire de la première feuille ouverte longitudinalement et, à l’aide de la pince, retirez-la de la base de la deuxième feuille. REMARQUE: Nettoyez les outils (pinces, scalpel, etc.) avant de les utiliser avec de l’éthanol à 75% à 80%. La gaine est la fine couche d’épiderme qui assure la fixation de la première à la deuxième feuille (deuxième à troisième feuille, etc.; voir Figure 1).</li>
	<li>Placez la première feuille à plat dans une boîte de Pétri stérile de 60 mm, contenant une serviette en papier humide pour maintenir l’humidité à l’intérieur de la plaque. À l’aide du scalpel, coupez la majorité de la première feuille loin de la gaine, ne laissant que 0,5 po du tissu foliaire pour le montage.</li>
	<li>Collez le tissu foliaire au fond de la plaque de Petri. REMARQUE: La gaine s’enroule, mais cela est acceptable car une gaine enroulée retient la gouttelette conidiale plus facilement.</li>
	<li>Prélever des plaques de M. oryzae âgées de 9 à 12 jours et ajouter 0,5 à 2 ml d’eau stérile dans les assiettes. À l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, grattez doucement le mycélium pour libérer les conidies attachées. Pipeter soigneusement la suspension conidiale dans un tube microcentrifuge contenant un petit morceau d’étamine pour filtrer les gros morceaux de mycélium de la suspension conidiale. NOTE: Les spores peuvent être collectées dès 7 jours, si la croissance et la sporulation sont suffisantes pour atteindre la concentration de spores souhaitée. La collecte ne peut pas être retardée de plus de 14 jours si vous travaillez avec un mutant génétique à croissance lente</li>
	<li>La concentration de spores souhaitée est de 5 x 10 4 spores par mL, mais une plage (1 x 10 4-1 x 10 5) est acceptable. Une concentration trop élevée rend difficile l’imagerie des sites d’infection individuels; Diluer la concentration de spores avec de l’eau stérile si nécessaire.</li>
	<li>Pipeter soigneusement la suspension conidiale à l’intérieur de la gaine de feuilles roulées. Commencez avec 25 μL (la taille des gouttelettes peut être augmentée en fonction de la taille de la gaine, jusqu’à 50 μL). REMARQUE: Il est recommandé d’effectuer trois à cinq répétitions de chaque souche mutante ou lignée d’orge. Il est fréquent que des dommages se produisent pendant le processus de coloration, c’est pourquoi des répliques de gaine supplémentaires sont recommandées.</li>
	<li>Remplir quatre ou cinq béchers de 500 ml avec du ddH2O et chauffer jusqu’à cuisson à la vapeur (à l’aide d’un four à micro-ondes ou d’une plaque chauffante). Soyez prudent lorsque vous déplacez les béchers d’eau chaude. Tenez le couvercle de la boîte de Petri sur l’un des béchers fumants pour emprisonner l’humidité à l’intérieur de la plaque.</li>
	<li>Empilez les plaques de gaine de feuilles infectées et entourez-les des béchers chauds restants. Cela crée un environnement humide et humide, nécessaire à la germination des spores. REMARQUE: Soyez prudent lorsque vous faites cuire les couvercles à la vapeur pour vous assurer qu’aucune eau chaude ou vapeur ne touche les gaines.</li>
	<li>Protégez les gaines de feuilles de la lumière, couvrez d’une boîte en caoutchouc ou en plastique de couleur unie (de préférence noire) et laissez reposer pendant 48 heures ou le point de temps souhaité pour l’imagerie. REMARQUE: Une boîte en carton ne convient pas car elle ne bloque pas l’humidité et absorbe la vapeur des béchers d’eau chaude. Une baignoire en plastique verrouillable fonctionne bien pour contenir l’humidité, et elle peut être recouverte de tissu noir ou d’un récipient sombre plus grand pour bloquer la lumière.</li>
</ol>2. Processus de coloration
<ol><li>Préparer la coloration comme suit: préparer une dilution fraîche de 45% d’acide acétique et ajouter 0,1% v/v de bleu de trypan. Aliquote 1 mL de la solution de colorant dans des tubes microcentrifugés. Réglez un bloc de chaleur ou un bain-marie à 40 °C.</li>
	<li>Avec précaution, à l’aide d’un rasoir ou d’un scalpel, coupez la gaine de feuilles loin du ruban. À l’aide de pinces, placez la gaine dans le tube de microcentrifugation et assurez-vous qu’elle est complètement immergée dans la solution de colorant. Laisser 2 h pour que le colorant pénètre dans la feuille. Chauffer les échantillons à 40 °C pendant le temps de coloration dans un bloc thermique ou un bain-marie pour augmenter la pénétration du colorant. NOTE: Les gaines essaient de flotter dans le tube de microcentrifugeuse; Pour éviter les poches non tachées de tissu foliaire, remplissez les tubes, immergez les gaines et fermez le tube. Ne mettez pas plusieurs gaines dans le même tube de microcentrifugeuse.</li>
	<li>Rincez soigneusement les gaines de feuilles dans du glycérol à 60% pour éliminer le colorant supplémentaire. Trois rinçages (chacun au glycérol frais) sont généralement suffisants. Gardez la gaine dans du glycérol jusqu’à ce qu’elle soit prête à monter sur des lames.</li>
</ol>3. Processus de montage et d’imagerie
<ol><li>Placez la gaine sur une lame de verre propre et ajoutez quelques gouttes de glycérol à 60%. À l’aide d’un microscope à dissection et de deux paires de pinces, déroulez soigneusement la gaine en laissant le centre inoculé orienté vers le haut. Tenez la gaine ouverte avec la pince et placez la lamelle de couverture sur le dessus pour empêcher la gaine de s’enrouler et de bloquer le site d’infection. REMARQUE: La gaine foliaire est très fragile et ces étapes doivent être effectuées avec soin pour éviter d’endommager la gaine.</li>
	<li>Scellez le couvercle à l’aide de vernis à ongles pour un stockage à long terme ou de ruban adhésif pour un stockage à court terme. Observez les lames sous un microscope à lumière composée.</li>
	<li>Prenez des images de base à l’aide d’un microscope et d’un téléphone cellulaire. Ici, les images ont été prises avec un support d’adaptateur de téléphone portable et un smartphone. Pour les appareils Android, réglez l’application appareil photo aux paramètres suivants: flash éteint, désactiver Top Shot, désactiver le réglage automatique de la luminosité et des ombres et définir la résolution de la photo sur complète. REMARQUE: L’utilisation de l’application appareil photo sur le téléphone diminue la durée de vie de la batterie plus rapidement que d’habitude, il est donc recommandé d’avoir une alimentation externe.</li>
	<li>Une fois le téléphone cellulaire monté sur le microscope, prenez une image d’un micromètre à l’échelle avec l’objectif qui sera utilisé pour acquérir les données. Les données de cette étude ont été acquises à un objectif d’air 40x 0,65 NA, et l’adaptateur téléphonique a été monté sur un oculaire 10x. Ajustez le zoom du téléphone à 2,5x et maintenez-le cohérent pour maintenir une taille de pixel constante.</li>
	<li>Le centre de la gaine abrite la plus grande concentration de spores et d’appressoires infectantes; Par conséquent, visez 9 à 12 images de chaque gaine pour obtenir des nombres significatifs pour l’analyse statistique. Le nombre de spores et d’appressoires varie en fonction de la concentration de spores appliquées.</li>
</ol>4. Évaluation et comptage d’images à l’aide d’ImageJ (FIJI)
<ol><li>Transférez les images sur un ordinateur exécutant ImageJ (FIJI). Pour ouvrir les images, faites glisser et déposez les fichiers sur la barre ImageJ.</li>
	<li>Définissez l’échelle des images en chargeant l’image micrométrique de la scène et en traçant une ligne droite entre deux marques pour l’échelle. Ouvrez Set Scale (Échelle définie), saisissez la distance connue de la ligne mesurée et saisissez l’unité de l’échelle. Sur le micromètre, dans cet exemple, la plus petite raie était de 10 μm. Cochez la case Définir global et appuyez sur OK. Toutes les images suivantes chargées auront la même échelle.</li>
	<li>Pour compter les appressoires, les spores ou d’autres objets, sélectionnez l’outil Point . Ensuite, ouvrez le Gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur la touche T du clavier pour ajouter des points à la liste. Ces régions d’intérêt peuvent être sauvegardées si nécessaire et rechargées sur la même image.</li>
	<li>Selon les objectifs expérimentaux, effectuez des mesures supplémentaires, telles que la longueur des spores, la taille de l’appressoire et la longueur du tube germinatif.</li>
</ol>

<ol><li>Roy, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+report+of+barley+blast+caused+by+Magnaporthe+oryzae+pathotype+Triticum+%28MoT%29+in+Bangladesh%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh.</a> Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).</li>
<li>Dean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Top+10+fungal+pathogens+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).</li>
<li>Dean, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+grisea%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea.</a> Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).</li>
<li>Wilson, R. A., Talbot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Under+pressure%3A+investigating+the+biology+of+plant+infection+by+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae.</a> Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).</li>
<li>Giraldo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+secretion+systems+facilitate+tissue+invasion+by+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Nature Communications. 4, 1996(2013).</li>
<li>Islam, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+wheat+blast+in+Bangladesh+was+caused+by+a+SouthAmerican+lineage+of+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae.</a> BMC Biology. 14 (1), 84(2016).</li>
<li>Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLangridge%2C+P+%22The+Barley+Genome.+Compendium+of+Plant+Genomes%22">The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes</a>. , Springer. Cham. 1-10 (2018).</li>
<li>Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+two+strains+of+Magnaporthe+grisea+with+rice%2C+goosegrass%2C+and+weeping+lovegrass%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass.</a> Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).</li>
<li>Gowda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+analysis+of+rice-blast+fungus+Magnaporthe+oryzae+field+isolates+from+southern+India%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Data%22%5BJournal%5D)">Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India.</a> Genomics Data. 5, 284-291 (2015).</li>
<li>Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+reporters+for+functional+analysis+in+rice+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Direct%22%5BJournal%5D)">Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves.</a> Plant Direct. 4 (2), 00188(2020).</li>
<li>Fernandez, J., Wilson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+no+feeding+frenzy%3F+Mechanisms+of+nutrient+acquisition+and+utilization+during+infection+by+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).</li>
<li>Cooper, J. G. Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+Delaware%22">University of Delaware</a>. , Doctoral dissertation (2022).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((al.The+plant+infection+test%3A+Spray+and+wound-mediated+inoculation+with+the+plant+pathogen+Magnaporthe+grisea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57675(2018).</li>
<li>Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inoculation+method+of+Magnaporthe+grisea+for+cytological+observation+of+the+infection+process+using+intact+leaf+sheaths+of+rice+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).</li>
<li>Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+surface+attachment+in+spores+of+a+plant+pathogenic+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus.</a> Science. 239 (4837), 288-290 (1988).</li>
<li>Khang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+of+Magnaporthe+oryzae+effectors+into+rice+cells+and+their+subsequent+cell-to-cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement.</a> The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Il existe de nombreux tests couramment utilisés pour tester les souches de M. oryzae qui fournissent un visuel macroscopique d’une réponse à une infection compatible ou incompatible, tels que les inoculations par pulvérisation ou gouttelettes, et l’utilisation de systèmes d’évaluation pour quantifier les tailles de lésion13,14. Un autre test courant pour M. oryzae consiste à tester la capacité de l’agent pathogène à former sa structure de pénétr...

Magnaporthe oryzae, le champignon de l’explosion du riz, infecte un assortiment de cultures céréalières, y compris l’orge, le blé et le riz1. Cet agent pathogène provoque des maladies dévastatrices et constitue une menace mondiale pour ces cultures précieuses, causant une perte complète de récoltes si elle n’est pas contrôlée. De nombreux laboratoires à travers le monde se concentrent sur la maladie du riz en raison de sa menace mondiale et de ses attributs en tant qu’excellent modèle pour les interactions plantes-champignons2. Il a été entièrement séquencé et la génétique de son cycle infectieux, en particulier les premiers événements, a été établie 3,4. Le cycle de vie commence par la germination d’une spore sur la surface d’une feuille, formant la structure de pénétration spécialisée appelée appressorium. L’appressorium pénètre dans le tissu foliaire et l’infection se poursuit avec le développement de lésions qui déclenchent le processus de sporulation et propagent la maladie4. La prévention de l’un de ces événements précoces inhiberait considérablement cette maladie dévastatrice. Par conséquent, la plupart des recherches actuelles sur la maladie blastique se sont concentrées sur les étapes précoces de l’infection, des conidies germées formant un appressorium au développement des hyphes invasifs et du complexe interfacial biotrophique (BIC)5.
De nombreuses recherches sur la maladie des blastes ont été menées sur le riz, même si M. oryzae est un agent pathogène important pour diverses cultures, et que de nouvelles souches émergent comme une menace mondiale pour le blé6. Alors que le riz est l’une des trois principales cultures de base utilisées pour nourrir la population, avec le blé et le maïs, l’orge est la quatrième céréale en termes d’alimentation du bétail et de production de bière7. À mesure que l’industrie de la bière artisanale se développe, la valeur économique de l’orge augmente également. Il y a des avantages distincts à utiliser M. oryzae et l’orge comme pathosystème pour étudier la maladie blastique. Tout d’abord, il existe des souches de M. oryzae qui n’infectent que l’orge, ainsi que des souches qui peuvent infecter plusieurs espèces de graminées. Par exemple, 4091-5-8 n’infecte principalement que l’orge, tandis que Guy11 et 70-15 peuvent infecter à la fois l’orge et le riz8. Ces souches sont génétiquement similaires et le processus d’infection est comparable9. Deuxièmement, dans des conditions standard de laboratoire et de serre, l’orge est plus facile à cultiver, car elle n’a pas les exigences compliquées du riz (contrôle concis de la température, humidité élevée, spectres lumineux spécifiques). Il y a aussi des problèmes d’imagerie avec le riz en raison de l’hydrophobicité de la surface des feuilles, dont l’orge ne présente pas10.
Ce protocole présente une méthode simple pour isoler et utiliser efficacement les gaines de feuilles d’orge pour l’analyse microscopique de plusieurs stades d’infection, en utilisant des fournitures de laboratoire courantes et un smartphone pour la collecte de données. Cette méthode pour le dosage de la gaine des feuilles d’orge est adaptable aux laboratoires du monde entier car elle nécessite un minimum de fournitures, tout en fournissant une image claire de l’interaction microscopique entre l’agent pathogène et les premières cellules qu’il infecte. Alors que les tests de pathogénicité, tels que l’inoculation par pulvérisation ou par gouttelettes, peuvent fournir une vue macro de la capacité de l’agent pathogène à former des lésions, ce test permet au chercheur de visualiser des étapes spécifiques de l’infection précoce, des événements de prépénétration à la colonisation des cellules épidermiques. En outre, les chercheurs peuvent facilement comparer l’infection par le champignon de type sauvage à l’infection par un mutant réduit en virulence.

<table><tbody><tr><td>Acide acétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Téléphone portable&nbsp ;</td><td>Google&nbsp ;</td><td>Pixel 4A</td><td>N’importe quel smartphone doté d’une caméra arrière pouvant être montée dans un support suffira.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Adaptateur de microscope pour téléphone portable</td><td>Vankey</td><td>B01788LT3S</td><td>https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+ %2Caps %2C63& sr=8-2 -spons& psc=1& spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQQ. md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>AmScope</td><td>FM690TC</td><td>40x&ndash ; 2500x Microscope d’épi-fluorescence droit trinoculaire</td></tr><tr><td>Flocons d’avoine à l’ancienne</td><td>Quaker</td><td>N/A</td><td>https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 & hvadid=312253390021& hvpos= & hvnetw=g& hvrand=98212627704 6839544& hvpone=& hvptwo=& hvq mt=& hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint =& hvlocphy=9007494& hvtargid =pla-568492637928& psc=1</td></tr><tr><td>ProMix BX</td><td>ProMix</td><td>1038500RG</td><td></td></tr><tr><td>Verre de protection rectangulaire</td><td>Corning</td><td>CLS2975245</td><td></td></tr><tr><td>Lames, microscope</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8902</td><td></td></tr><tr><td>Micromètre de platine&nbsp ;</td><td>OMAX</td><td>A36CALM7</td><td>0,1 mm et 0,01 mm Lame d’étalonnage du microscope</td></tr><tr><td>Trypan bleu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation des sites d’infection précoce de la maladie du souffle du riz (magnaporthe oryzae) sur l’orge (hordeum vulgare) à l’aide d’un microscope de base et d’un smartphone

Visualizing Early Infection Sites of Rice Blast Disease (Magnaporthe oryzae) on Barley (Hordeum vulgare) Using a Basic Microscope and a Smartphone

Comprendre comment les plantes et les agents pathogènes interagissent, et si cette interaction aboutit à la défense ou à la maladie, est nécessaire pour développer des stratégies plus solides et plus durables pour la santé des plantes. Les progrès des méthodes qui permettent d’imager plus efficacement les échantillons d’agents phytopathogènes pendant l’infection et la colonisation ont donné lieu à des outils tels que le test de la gaine de feuille de riz, qui a été utile pour surveiller l’infection et les événements de colonisation précoce entre le riz et l’agent pathogène fongique, Magnaporthe oryzae. Cet agent pathogène hémi-biotrophe provoque de graves pertes de maladies dans le riz et les monocotylédones apparentées, y compris le mil, le seigle, l’orge et, plus récemment, le blé. Le test de la gaine foliaire, lorsqu’il est effectué correctement, donne une section de plante optiquement claire, plusieurs couches d’épaisseur, ce qui permet aux chercheurs d’effectuer une imagerie de cellules vivantes lors d’une attaque pathogène ou de générer des échantillons fixes colorés pour des caractéristiques spécifiques. Les études cellulaires détaillées sur l’interaction orge-M. oryzae ont pris du retard par rapport à celles de l’hôte du riz, malgré l’importance croissante de cette céréale comme source de nourriture pour les animaux et les humains et comme boissons fermentées. Il est rapporté ici le développement d’un test de gaine de feuilles d’orge pour des études complexes des interactions de M. oryzae au cours des 48 premières heures suivant l’inoculation. Le dosage de la gaine foliaire, quelle que soit l’espèce étudiée, est délicat; Un protocole qui couvre tout, des conditions de croissance de l’orge à l’obtention d’une gaine foliaire, en passant par l’inoculation, l’incubation et l’imagerie de l’agent pathogène sur les feuilles des plantes. Ce protocole peut être optimisé pour le dépistage à haut débit en utilisant quelque chose d’aussi simple qu’un smartphone à des fins d’imagerie.

Une représentation du flux de travail initial pour cette technique est illustrée à la figure 1. Les gaines ont été récoltées sur des plants d’orge sensibles de 14 jours (H. vulgare). Les conidies ont été récoltées sur des plaques d’OMA sporulantes de M. oryzae âgées de 10 jours, avec une suspension conidiale préparée à l’aide de ddH2O stérile pour une concentration finale de 5 x 104 spores par mL. La suspension d’inoculum a été appliquée directement su...

Il s’agit d’un protocole simple d’essai de gaine de feuilles d’orge utilisant un minimum de réactifs et un équipement de laboratoire commun (y compris un smartphone de base). L’objectif est de visualiser le processus d’infection précoce de la maladie blastique dans des laboratoires sans accès à un équipement de microscopie avancé.

Visualisation des sites d’infection précoce de la maladie du souffle du riz (Magnaporthe oryzae) sur l’orge (Hordeum vulgare) à l’aide d’un microscope de base et d’un smartphone

Understanding how plants and pathogens interact, and whether that interaction culminates in defense or disease, is required to develop stronger and more ...

Notre protocole est une méthode simplifiée qui permet aux chercheurs de visualiser les étapes précoces de l’infection de mutants fongiques de type sauvage et génétique sans utiliser d’équipement coûteux. Le principal avantage de cette technique est l’utilisation de fournitures de laboratoire de base pour répondre à des questions biologiques complexes et pour le dépistage rapide des mutants fongiques pour une analyse plus approfondie. Une partie difficile de cette technique est le traitement de la gaine.La gaine est une fine couche de cellules qui peut être facilement endommagée, une manipulation prudente est donc essentielle pour une expérience réussie. Pour commencer, sélectionnez l’orge cultivée jusqu’au deuxième stade foliaire. Et à l’aide de ciseaux stériles, coupez le plant d’orge juste au-dessus de la ligne du sol.À l’aide d’une pince et d’un scalpel, coupez soigneusement la gaine de la première feuille ouverte longitudinalement. Et à l’aide de la pince, retirez-la de la base de la deuxième feuille. À l’aide d’un scalpel, coupez la majeure partie de la première feuille loin de la gaine, ne laissant que 0,5 pouce de tissu foliaire pour le montage.Placez la première feuille à plat dans une boîte de Petri stérile de 60 millimètres contenant une serviette en papier humide pour maintenir l’humidité à l’intérieur de la plaque. Collez le tissu foliaire au fond de la boîte de Pétri. Choisissez une plaque de culture Magnaporthe oryzae âgée de neuf à 12 jours et ajoutez-y 0,5 à deux millilitres d’eau stérile.À l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, grattez doucement le mycélium pour libérer les conidies attachées. Pipeter soigneusement la suspension conidiale dans un tube microcentrifuge contenant un petit morceau de tissu à fromage pour filtrer les gros morceaux de mycélium de la suspension conidiale. Si nécessaire, diluez la concentration de spores avec de l’eau stérile à cinq fois 10 à la quatrième spores par millilitre, car une concentration trop élevée rend difficile l’imagerie des sites d’infection individuels.Selon la taille de la gaine, pipeter soigneusement 25 à 50 microlitres de la suspension conidiale à l’intérieur de la gaine à feuilles roulées. Ensuite, remplissez quatre ou cinq béchers de 500 millilitres avec de l’eau distillée double et chauffez jusqu’à cuisson à la vapeur. Tenez le couvercle de la boîte de Petri sur l’un des béchers fumants pour emprisonner l’humidité à l’intérieur de la plaque.Empilez les plaques de gaine de feuilles infectées et entourez-les des béchers chauds restants, car cela crée un environnement humide et humide pour la germination des spores. Protégez cette configuration de la lumière en la recouvrant d’une boîte en caoutchouc ou en plastique de couleur unie et en la laissant intacte pendant 48 heures ou le point de temps souhaité pour l’imagerie. Préparez la tache en mélangeant de l’acide acétique 45% fraîchement dilué et du bleu de trypan à 0,1%.Aliquote d’un millilitre de la solution de colorant dans des tubes à microcentrifugation. À l’aide d’un scalpel, coupez soigneusement la gaine de feuilles loin du ruban. À l’aide de pinces, placez la gaine dans le tube de microcentrifugation et assurez-vous qu’elle est complètement immergée dans la solution de colorant.Laissez les tubes reposer pendant deux heures dans un bloc de chaleur de 40 degrés Celsius ou un bain-marie pour que le colorant pénètre dans la feuille. Ensuite, rincez soigneusement les gaines de feuilles trois fois dans 60% de glycérol frais pour enlever le colorant supplémentaire. Gardez la gaine dans du glycérol jusqu’à ce qu’elle soit prête à monter sur des lames.Placez la gaine sur une lame de verre propre et ajoutez quelques gouttes de glycérol à 60%. À l’aide d’un microscope à dissection et de deux paires de pinces, déroulez soigneusement la gaine en laissant le centre inoculé orienté vers le haut. En tenant la gaine ouverte avec la pince, placez le couvercle sur le dessus pour empêcher la gaine de s’enrouler et de bloquer le site d’infection.Scellez le couvercle à l’aide de vernis à ongles pour un stockage à long terme ou d’un ruban adhésif à court terme. Observez les lames sous un microscope à lumière composée. Prenez des images de base avec un smartphone en montant un adaptateur de téléphone portable au microscope.Pour les appareils Android, réglez les paramètres de l’application de l’appareil photo pour qu’ils clignotent, désactivez la prise de vue supérieure, désactivez le réglage automatique de la luminosité et des ombres et définissez la résolution de la photo sur complète. Après avoir monté le téléphone portable, prenez une image d’un micromètre à l’échelle avec un objectif souhaité pour l’acquisition des données. Ajustez le zoom du téléphone à 2,5 x et maintenez-le cohérent pour maintenir une taille de pixel cohérente.Le centre de la gaine abrite la plus grande concentration de spores et d’appressoires infectantes. Par conséquent, visez neuf à 12 images de chaque gaine pour obtenir des nombres significatifs pour l’analyse statistique. Les sites d’infection de la gaine ont été imagés à l’aide d’un smartphone et d’un adaptateur de microscope pour smartphone après coloration au bleu trypan.La chaleur et l’acide acétique dans la procédure de coloration adoucissent doucement le tissu foliaire. Les rinçages post-coloration à 60% de glycérol éliminent non seulement l’excès de tache, mais aident à réduire la diffusion de la lumière causée par la feuille et à améliorer la qualité de l’image. Les écarts par rapport au protocole de coloration peuvent entraîner des résultats sous-optimaux, comme illustré ici.L’orge infectée par le type sauvage 4091 a produit des cellules infectées avec succès identifiées par la présence d’hyphes infectés à l’intérieur du tissu de la gaine foliaire. Dans le cas de l’infection mutante J99A, le développement réussi d’appressories et de piquets de pénétration a été remarqué, mais n’a pas produit d’hyphes invasifs. Le timing est important pour les tests basés sur les infections.Des plantes et des spores fongiques bien vieillies sont essentielles au succès. Dans cette étude, nous avons examiné la présence ou l’absence des structures infectieuses. Des expériences supplémentaires pourraient répondre à des questions concernant le phénotype de la structure de l’infection et celui des hyphes envahisseurs.Notre méthodologie n’est pas nouvelle, mais une version simplifiée et accessible d’une expérience plus complexe et plus coûteuse.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Source : Wen, J., Pasman, et. al., Visualisation des germinosomes et de la membrane interne dans les spores de Bacillus subtilis . J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo démontre l’utilisation de la microscopie à éclairage structuré pour acquérir des images de fluorescence tridimensionnelles qui révèlent l’organisation des protéines de germination au sein de la spore bactérienne.

Visualisation des protéines de germination dans la membrane interne de spores bactériennes

Cette vidéo montre une technique pour établir l’infection par le champignon pathogène Magnaporthe grisea dans les feuilles des plants de riz. La suspension de conidies fongiques est pulvérisée sur des sections de feuilles de riz, et la progression de la maladie est évaluée en notant la formation de lésions nécrotiques.

Une technique d’inoculation par pulvérisation pour établir une infection fongique dans les feuilles de riz

Cette vidéo montre l’établissement de l’infection des feuilles de la plante de riz par inoculation de plaies avec du mycélium de Magnaporthe grisea. Le tube germinatif dérivé des spores fongiques pénètre dans la couche épidermique, entraînant une infection des tissus et des lésions sur les feuilles. Cette méthode facilite le dépistage des pathotypes et améliore la compréhension de la résistance des plantes pour la sélection moléculaire.

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Sectionnement transversal du riz mature (Oryza sativa L.) Noyaux pour l’imagerie par microscopie électronique à balayage à l’aide d’embouts de pipette comme support d’immobilisation

Ce travail décrit l’utilisation de la technologie d’édition du génome CRISPR-Cas9 pour éliminer le gène endogène OsABCG15 suivi d’un protocole de transformation modifié sous médiation agrobactériepour produire une lignée stable mâle-stérile dans le riz.

Agrobacterium-Transformation génétique médiée, production transgénique et application pour l’étude du développement de la reproduction masculine dans le riz

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Observation en fluorescence profonde dans les pousses de riz via la technologie de déblaiement

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Combinaison de la microscopie de compensation et de fluorescence pour visualiser les changements dans l’expression génique et les réponses physiologiques à Plasmodiophora brassicae

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Détection en temps réel de la production d’espèces réactives de l’oxygène dans la réponse immunitaire dans le riz avec un test de chimiluminescence

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Gaines de maïs détachées pour l’imagerie de cellules vivantes d’une infection par des agents pathogènes fongiques foliaires du maïs

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Production d’inoculum fongique mycorhizien arbusculaire (AM) et évaluation phénotypique de la symbiose du riz et de l’AM dans des conditions salines

Découvrez une méthode simplifiée pour visualiser les étapes précoces de l'infection fongique sur Hordeum vulgare sans équipement coûteux. Cette technique accessible permet le criblage rapide des mutants de Magnaporthe oryzae.

Visualisation des sites d’infection précoce de la maladie du souffle du riz (Magnaporthe oryzae) sur l’orge (Hordeum vulgare) à l’aide d’un microscope de base et d’un smartphone (Vidéo) | JoVE Journal

Visualisation des sites d’infection précoce de la maladie du souffle du riz (Magnaporthe oryzae) sur l’orge (Hordeum vulgare) à l’aide d’un microscope de base et d’un smartphone

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