Enregistrement du courant de potassium voltage-dépendant sur les cardiomyocytes H9C2 via la technique de patch-clamp à cellules entières

Ce protocole enregistre avec succès les effets de l’aconitine sur l’IKv des cellules H9C2. Promouvoir de nouvelles phases pour étudier le mécanisme de cardiotoxicité des médicaments du point de vue des canaux ioniques. La technique de patch-clamp à cellules entières est l’étalon-or de la recherche sur les canaux ioniques avec une sensibilité élevée, une haute précision et une spécificité élevée.

La technique de patch-clamp à cellules entières peut être utilisée pour explorer les mécanismes pharmacologiques ou toxiques de la juxta gating des canaux ioniques spécifiques pour des maladies multisystémiques, telles que le système cardiovasculaire et le système nerveux. Pour commencer, digérez les cellules avec 0,25% de trypsine pendant 30 secondes, une fois que la boîte de culture H9C2 devient 80% confluente. Culture 2 fois 10 à la 5ème cellule par millilitre avec un milieu normal ou contenant un médicament dans un plat de 35 millimètres tapissé de plaques de verre pendant 24 heures à 37 degrés Celsius, avec une atmosphère de dioxyde de carbone de 5% et 70 à 80% d’humidité relative.

Allumez l’extracteur de micropipette et préchauffez pendant 30 minutes. Placez ensuite un capillaire en verre borosilicaté avec un filament sur l’extracteur de micropipette. Sélectionnez le programme et cliquez sur Entrée dans le panneau de configuration.

Cliquez sur le programme de rampe dans le coin supérieur droit pour déterminer le pouvoir calorifique du capillaire en verre. Écrivez le programme de tirage de l’électrode en fonction de la valeur déterminée par le test de rampe et cliquez sur tirer pour commencer à fabriquer les pipettes. Allumez le convertisseur analogique numérique, l’amplificateur de signal, le micromanipulateur, le microscope et l’appareil photo.

Ouvrez l’application d’imagerie, le logiciel d’amplificateur de signal et le logiciel d’acquisition de données en séquence. Cliquez sur acquérir et sélectionnez modifier le protocole dans le logiciel d’acquisition de données. Modifiez le programme dans l’interface de forme d’onde.

Entrez des valeurs pour le premier niveau, le niveau delta, la première durée et la durée delta pour l’époque A, l’époque B et l’époque C.Cliquez ensuite sur l’interface de débit de mode et définissez les données de hiérarchie d’essai. Ensuite, cliquez sur modifier le protocole pour sélectionner le bouton de stimulus et définissez le programme de soustraction de fuite dans la boîte de dialogue de soustraction de fuite PM. Pour établir le chemin de stockage des données, cliquez sur fichier et sélectionnez définir les noms de fichiers de données dans le logiciel d’acquisition de données.

Ouvrez ensuite le protocole lKv établi en sélectionnant acquérir et en cliquant sur protocole ouvert dans le logiciel d’acquisition de données. Enfin, cliquez sur l’option Outils et sélectionnez test de membrane pour commencer à exécuter le protocole. Ajouter la solution extracellulaire au bain cellulaire sur l’appareil de serrage patch-clamp à cellules entières et placer le couvercle vers le haut avec les cellules H9C2 dans le bain.

Remplissez 30% de la pipette avec la solution extracellulaire et installez-la sur le support d’électrode d’enregistrement intégré dans l’appareil de serrage patch. Serrez la pipette avec le porte-électrode d’enregistrement. Déposez ensuite la pipette dans le bain avec le micro manipulateur.

Cliquez sur l’interface de décalage de la pipette du logiciel de l’amplificateur de signal pour maintenir la ligne de base du courant lKv à zéro picoampères. Délivrez manuellement une pression positive appropriée avec une seringue de 1,0 millilitre, connectée au porte-électrode d’enregistrement, à travers un tube en plastique. Déplacez légèrement la pipette en manipulant le micromanipulateur en trois dimensions pour entrer en contact avec la cellule.

Une fois que la membrane teste les ondes carrées chute d’un tiers à la moitié après que la pipette touche la membrane cellulaire, retirez la pression positive et délivrez manuellement une pression négative appropriée. Cliquez ensuite sur l’interface patch du logiciel d’acquisition de données pour former le gigaseal. Utilisez le logiciel d’amplificateur de signal rapide et lent de compensation de capacité pendant le plafond de la cellule pour compenser la capacité rapide et lente.

Appliquez de brèves impulsions de pression négative pour rompre un patch de la membrane cellulaire. Exécutez la compensation capacitive de la membrane de la cellule entière en cliquant sur le bouton de la cellule entière du logiciel d’amplificateur de signal. Enfin, enregistrez et enregistrez les données en cliquant sur le bouton d’enregistrement des données.

Ouvrez les données lKv enregistrées avec le logiciel d’analyse de données. Enregistrez les relations de tension actuelles. Cliquez sur analyser pour sélectionner les statistiques.

Sélectionnez la plage en tant que curseurs 1 et 2 pour l’analyse des données, cliquez sur les boutons d’amplitude de crête et de moyenne, puis cliquez sur OK pour afficher les données dans la page de résultats. Enfin, copiez la colonne des données moyennes lKv dans le logiciel de dessin de fonction pour une analyse plus approfondie. Enregistrez les traces de courant lKv représentatives.

Cliquez sur modifier pour sélectionner les traces de transfert, puis sélectionnez la trace complète dans la région à transférer. Ensuite, cliquez sur sélectionner dans la sélection de trace et sélectionnez IN 0 dans les signaux. Enfin, cliquez sur OK pour afficher les données dans la page de résultats et copiez les données totales dans le logiciel de dessin de fonction pour dessiner les traces actuelles.

Enregistrez le protocole lKv. Cliquez sur modifier pour sélectionner créer un signal de forme d’onde de stimulus et sélectionnez OK. Répétez ensuite l’étape pour dessiner des traces de courant sans sélectionner le signal.

Le lKv a été déclenché par 150 millisecondes de stimulus d’impulsion dépolarisant de moins 40 à plus 60 millivolts à un potentiel de maintien de moins 60 millivolts. Le lKv des cardiomyocytes de rat H9C2 est apparu pour la première fois autour de moins 20 millivolts, puis l’amplitude a augmenté avec la dépolarisation. En comparaison avec le groupe témoin, l’amplitude lKv a été sensiblement réduite après les cinq minutes de traitement avec 1,5 millimolaire 4-AP.

De plus, le lKv a diminué de manière significative aux potentiels membranaires de 10 à 60 millivolts de manière dose-dépendante, après le traitement AC de 24 heures. La cellule individuelle, après l’enregistrement du canal ionique, peut être utilisée pour d’autres évaluations omiques unicellulaires, telles que la génomique unicellulaire, la transcriptomique, la protéomique et la métabolomique.