Name: Analyses de l’expression génique dans les follicules humains (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Apprenez à isoler des follicules ovariens humains à partir de tissu cortical congelé pour des analyses d'expression génique. Cette méthode enzymatique et mécanique préserve l'intégrité folliculaire et permet d'étudier les déficits d'expression génique liés aux maladies.

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Ce travail a été soutenu par une subvention d’excellence scientifique (EOS) (ID: 30443682). I.D. est chercheur associé au Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).

Ce projet a été approuvé par le Comité d’éthique de l’hôpital Erasme (Bruxelles, Belgique). La patiente incluse dans ce protocole a subi une cryoconservation du tissu ovarien (OTC) pour la préservation de la fertilité avant l’exposition à la chimiothérapie en 2000. La patiente a signé un consentement écrit éclairé pour faire don de ses tissus congelés résiduels à la recherche à la fin de la période d’entreposage.
1. Décongélation du tissu ovarien cryoconservé
<ol><li>Préparer une plaque à 6 puits contenant cinq solutions de décongélation. Le premier puits contient 5 mL de solution cryoprotectrice composée de milieu Leibovitz-15, de 0,1 mol/L de saccharose, de 1,5 mol/L de diméthylsulfoxyde (DMSO) et de 1 % d’albumine sérique humaine (HSA). Les puits suivants contiennent 5 mL de milieu Leibovitz-15 avec des concentrations décroissantes de cryoprotecteur : 1 mol/L, 0,5 mol/L et 2 x 0 mol/L de DMSO. REMARQUE: La solution cryoprotectrice peut différer selon le protocole utilisé dans la clinique de fertilité.</li>
	<li>Retirer un flacon contenant un fragment cortical ovarien de l’azote liquide dans le respect des règles de sécurité (gants cryogéniques, lunettes de protection et chaussures fermées) et conserver le tube à température ambiante (RT) pendant 30 s.</li>
	<li>Faire tremper le flacon dans de l’eau bidistillée pendant 2 min à TA en agitant doucement avant d’ouvrir le flacon sous une hotte verticale et de le transférer directement dans le premier puits de la plaque à 6 puits (sur glace).</li>
	<li>Transférer le fragment successivement dans chaque puits de la plaque de 6 puits, chacun contenant des concentrations décroissantes de cryoprotecteur dans 5 mL de milieu Leibovitz-15. Agiter doucement le tissu dans chaque milieu pendant 5 min (sur glace).</li>
</ol>2. Isolement des follicules
NOTE: Toutes les expériences sont menées en utilisant des matériaux sans RNase et sous un capot vertical.
<ol><li>Transférer le tissu décongelé dans une boîte de Petri grillée de 2 mm remplie de 10 mL de milieu de dissection (milieu Leibovitz-15, pyruvate de sodium [2 mmol/L], L-glutamine [2 mmol/L], HSA [0,3 %], pénicilline G [30 μg/mL] et streptomycine [50 μg/mL]). Ajustez la taille du tissu avec un scalpel si nécessaire. REMARQUE : Selon le protocole clinique, la taille du tissu congelé peut varier de 8 mm x 4 mm x 1 mm à 4 mm x 2 mm x 1 mm. Pour ce protocole, deux bandes de 4 mm x 2 mm x 1 mm ont été utilisées.</li>
	<li>Empilez les trois morceaux de la trancheuse à tissu, placez le fragment entre les deux blocs et coupez le fragment en deux à l’aide d’une lame, en glissant à travers les blocs pour obtenir deux fragments de 0,5 mm d’épaisseur.</li>
	<li>Utilisez le hachoir à tissus pour couper le fragment et obtenir des morceaux plus petits. Si nécessaire, coupez les morceaux restants manuellement avec un scalpel jusqu’à ce que le tissu soit totalement brisé.</li>
	<li>Transférer le tissu fragmenté dans une boîte de Petri quadrillée remplie de 7 mL de milieu de digestion (milieu de culture [milieu de McCoy’s 5A, 3 mmol / L de glutamine, 0,1% HSA, 30 μg / mL de pénicilline G, 50 μg / mL de streptomycine, 2,5 μg / mL de transferrine, 4 ng / mL de sélénium et 50 μg / mL d’acide ascorbique] complété par 0,2% de collagénase et 0,02% de DNase).</li>
	<li>Mettez le plat dans l’incubateur à 5% de CO2 et 37 °C. Toutes les 10 minutes, sortez la boîte de Petri de l’incubateur et rincez le tissu en le pipetant de haut en bas avec une pipette de 1 mL.</li>
	<li>Après 45 min d’incubation dans le milieu de digestion, placer la capsule sous un stéréomicroscope avec une plage de grossissement de 5x-6,3x, et récupérer les follicules à l’aide d’une pipette microcapillaire. Sélectionnez les follicules d’intérêt et isolez-les en les aspirant avec une pipette buccale. REMARQUE : Le pipetage buccal doit être effectué avec soin pour éviter la perte de matière dans le tuyau et la contamination.</li>
	<li>Si les follicules restent coincés dans un morceau de cortex, isolez-les mécaniquement avec deux seringues de 27 G en arrachant le cortex avec l’extrémité des seringues pour libérer les follicules du stroma. REMARQUE: Ne touchez pas les follicules avec les seringues pour éviter de les endommager.</li>
	<li>Transférer les follicules avec le microcapillaire dans une plaque à 4 puits contenant des gouttes de 15 μL du milieu de culture étalonné recouvert de 500 μL de culture huileuse (1 à 10 follicules par goutte). Cette étape maintient la viabilité du follicule pendant le processus de collecte. À la fin de la procédure, rincer les follicules deux fois pendant 5 s à chaque fois en deux gouttes de 15 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) recouverte de 500 μL d’huile de culture (sur glace).</li>
	<li>Prélever 20 follicules avec une quantité minimale de PBS à l’aide de la pipette buccale (maximum 10 μL) dans un tube vide et garder le tube sur de la glace. REMARQUE: Pour la stabilité de l’ARN, il est crucial d’effectuer les étapes 2.8 et 2.9 sur la glace. Environ 20 follicules (<75 μm) sont nécessaires pour avoir suffisamment d’ARN pour la RT-qPCR standard (SYBR Green).</li>
	<li>Après un maximum de 90 min d’incubation dans le milieu de digestion, arrêter la réaction enzymatique en ajoutant dans la boîte de Petri un excès de solution de blocage froide (4 °C) (7,5 mL) composée d’un milieu de culture supplémenté à 10% de sérum fœtal bovin (FBS). REMARQUE: La solution bloquante peut être ajoutée dès que l’expérimentateur observe des follicules collés sur la plaque ou des follicules endommagés (forme asymétrique ou follicules de couleur plus foncée). Il est conseillé d’effectuer une isolation folliculaire dans un délai maximum de 2,5 heures pour éviter les dommages folliculaires et d’effectuer une extraction d’ARN immédiatement après l’isolement.</li>
</ol>3. Extraction de l’ARN
NOTE: L’extraction de l’ARN est effectuée en suivant les instructions fournies avec un kit d’extraction d’ARN en adaptant les volumes d’élution.
<ol><li>Suspendre les follicules isolés en ajoutant 100 μL de la solution de lyse fournie avec le kit d’extraction d’ARN au tube contenant les follicules sous une capuche chimique, et vortex à grande vitesse (2 500 tr/min) pour briser la structure des follicules. Ajouter 50 μL d’éthanol (100%) dans le tube et vortex brièvement à grande vitesse. NOTE: Comme le tampon de lyse contient du 2-mercaptoéthanol et de l’acide thiocyanique, cette étape doit être effectuée avec prudence sous une hotte chimique.</li>
	<li>Transférer le volume total du tube (environ 160 μL) dans une cartouche de microfiltre comprenant une colonne et un tube de collecte, et le centrifuger pendant 10 s à 16,363 x g à 4 °C. Laver la colonne avec 180 μL de solution de lavage 1, fournie avec le kit, et centrifuger le tube pendant 10 s à 16 363 x g à 4 °C.</li>
	<li>Ajouter 180 μL de solution de lavage 2/3, fournie avec le kit, dans la colonne et centrifuger pendant 10 s à 16 363 x g à 4 °C. Effectuez cette étape deux fois. Centrifuger le tube une dernière fois pendant 1 min pour sécher le filtre, et placer un nouveau tube de collecte sous la cartouche.</li>
	<li>Effectuer l’élution des acides nucléiques en deux étapes:<ol><li>Tout d’abord, ajouter 8 μL de solution d’élution chaude (75 °C) dans le filtre, attendre 1 min à TA et centrifuger pendant 30 s à 16 363 x g à 4 °C.</li>
		<li>Répétez cette étape avec 7 μL de solution d’élution. REMARQUE : Le tube contenant les acides nucléiques élués doit être conservé sur de la glace. Pour éviter la contamination de l’ADN, une étape supplémentaire de dégradation de l’ADN est fortement recommandée - étape 3.5.</li>
	</ol></li>
	<li>Incuber le tube avec 2 UI de DNase et 1x tampon DNase pendant 20 min à 37 °C. Bloquer l’activité enzymatique avec le réactif d’inactivation de la DNase 1/10 pendant 2 min à TA.</li>
	<li>Centrifuger le tube pendant 1,5 min à 16 363 x g à 4 °C. Enfin, récupérez la suspension contenant l’ARN et transférez-la dans un nouveau tube.</li>
	<li>Évaluer la quantité d’ARN présente dans l’échantillon à l’aide d’un spectrophotomètre (logiciel NanoDrop 2000 > l’ARN > des acides nucléiques). Utiliser 1 μL de solution d’élution comme blanc et mesurer la quantité d’ARN extraite des follicules isolés avec 1 μL de solution.</li>
	<li>Vérifiez le rapport 260/280 pour la pureté de l’ARN (environ 2,0). Conservez l’échantillon à -80 °C ou rétrotranscrivez-le directement pour effectuer la RT-qPCR. REMARQUE : Pour évaluer l’intégrité de l’ARN, l’échantillon peut être traité avec un système d’électrophorèse automatisé à haute résolution avant ou après la congélation à -80 °C. Dans ce travail, après rétrotranscription, la RT-qPCR a été réalisée avec le cycle suivant: Tenir l’étage avec 20 s à 50 °C et 10 min à 95 °C 40 cycles de PCR avec 15 s à 95 °C et 1 min à 60 °C Étage de courbe de fusion avec 15 s à 95 °C, 1 min à 60 °C, 30 s à 95 °C et 15 s à 60 °C</li>
</ol>

<ol><li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ovarian+follicular+development%3A+From+activation+of+resting+follicles+to+preovulatory+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Annales+d%27Endocrinologie%22%5BJournal%5D)">Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation.</a> Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).</li>
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<li>Vanacker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+isolation+of+human+primordial+and+primary+ovarian+follicles+with+Liberase+DH%3A+Protocol+for+application+in+a+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting.</a> Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).</li>
<li>Amargant, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+stiffness+increases+with+age+in+the+mammalian+ovary+and+depends+on+collagen+and+hyaluronan+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices.</a> Aging Cell. 19 (11), 13259(2020).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

La cryoconservation du tissu ovarien est une approche prometteuse pour préserver la fertilité des patientes atteintes de cancer. En clinique, le tissu cortical décongelé est greffé à la patiente après la rémission, permettant la reprise de la fonction ovarienne et de la fertilité19,20. Outre l’utilisation clinique, des fragments ovariens résiduels peuvent également être donnés pour la recherche à la fin de la période de stockage afin d’étudier les mécanismes de r...

L’ovaire est un organe complexe composé d’unités fonctionnelles et structurelles, y compris les follicules dans le cortex et le stroma. La folliculométrie, le processus d’activation, de croissance et de maturation des follicules d’un état de repos primordial à un follicule mature capable d’être fécondé et de soutenir le développement embryonnaire précoce, est largement étudiée dans la recherche1. Démêler les mécanismes à l’origine de ce phénomène pourrait améliorer les soins de fertilité pour les femmes2. Les analyses sur tissus humains fixes permettent d’évaluer l’expression des protéines et la localisation des gènes au sein des unités fonctionnelles de l’ovaire 3,4. Cependant, des techniques spécifiques sont nécessaires pour dissocier les follicules du cortex environnant afin d’évaluer avec précision les niveaux d’expression génique dans les follicules ovariens. Ainsi, dans une étude précédente, une technique d’isolement des follicules a été développée pour permettre des analyses de l’expression génique directement à partir de l’unité fonctionnelle de l’ovaire5. Différentes approches ont été développées, telles que la digestion enzymatique et/ou l’isolation mécanique, ainsi que la microdissection par capture laser, qui permettent l’isolation du follicule dans un morceau de tissu 6,7,8,9. L’isolement des follicules est largement utilisé, que ce soit avec du tissu ovarien humain ou animal, pour évaluer les profils d’expression génique des follicules à tous les stades de développement10,11,12. Cependant, une procédure d’isolement optimale doit tenir compte de la structure fragile du follicule dans le cortex dense et, par conséquent, doit être effectuée avec soin pour éviter tout dommage7. Ce manuscrit décrit une procédure, adaptée d’un protocole décrit par le laboratoire de Woodruff, pour isoler des follicules humains du cortex ovarien gelé-décongelé afin d’effectuer des analyses d’expression génique13.
La première étape de l’isolement du follicule ovarien à partir de tissus humains congelés est la procédure de décongélation. Ce processus est réalisé sur la base du protocole clinique utilisé pour la greffe de tissu ovarien cryoconservé, tel que décrit précédemment14,15. Le procédé vise à éliminer les agents cryoprotecteurs en rinçant le cortex ovarien à des concentrations décroissantes du milieu. Ensuite, le tissu est fragmenté avant isolement enzymatique et mécanique pour récupérer les follicules. Les follicules à différents stades peuvent être distingués à l’aide d’un stéréomicroscope à fort grossissement et à optique de bonne qualité afin d’isoler ceux qui vous intéressent. Chaque follicule isolé est mesuré à l’aide d’une règle intégrée au microscope, et les follicules peuvent être regroupés en fonction de leur stade de développement : follicules primordiaux (30 μm), follicules primaires (60 μm), follicules secondaires (120-200 μm) et follicules antraux (>200 μm)16. Une classification plus poussée peut être effectuée en fonction de la morphologie des follicules: les follicules primordiaux ont une couche de cellules granulosa aplaties (GC), les follicules primaires ont une couche de GC cuboïdes, les follicules secondaires ont au moins deux couches de GC cuboïdes et la présence d’une cavité parmi les GC caractérise le stade antral. Lorsque les follicules d’intérêt sont sélectionnés, une extraction d’ARN est effectuée. La quantité et la qualité de l’ARN sont évaluées avant la réaction quantitative en chaîne de la polymérase en temps réel (RT-qPCR) (Figure 1).

<table><tbody><tr><td>Boîte de Pétri quadrillée de 2 mm</td><td>Corning</td><td>430196</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyseur Agilent</td><td></td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>2100 Logiciel expert</td><td>Agilent</td><td>version B.02.08.SI648</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 4 puits</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6789</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 6 puits</td><td>Carl Roth</td><td>&nbsp ; EKX5.1</td><td></td></tr><tr><td>Agilent total RNA 6000 pico kit Agilent</td><td></td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Tubes d’aspiration pour pipettes microcapillaires</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase IV</td><td>LifeTechnologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4527-10kU</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>GoScript transcriptase inverse</td><td>Promega</td><td>A5003</td><td></td></tr><tr><td>HSA</td><td>CAF DCF&nbsp ;</td><td>LC4403-41-080</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz-15</td><td>LifeTechnologies</td><td>11415-049</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>McCoy' s 5A + bicarbonate + Hepes</td><td>LifeTechnologies</td><td>12330-031</td><td></td></tr><tr><td>Hachoir à tissus McIlwain</td><td>Stoelting</td><td>51350</td><td></td></tr><tr><td>Microcapillaire RI EZ-Tips 200 &micro ; m</td><td>CooperSurgical</td><td>7-72-2200/1</td><td></td></tr><tr><td>Microcapillaire RI EZ-Tips 75 & micro ; m</td><td>CooperSurgical</td><td>7-72-2075/1</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’exploitation NanoDrop 2000/2000c</td><td>ThermoFisher</td><td>version 1.6</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre NanoDrop</td><td>ThermoFisher</td><td>2000/2000c</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>PowerTrack SYBR green master mix</td><td>ThermoFisher</td><td>A46109</td><td></td></tr><tr><td>Amorces : GDF9</td><td></td><td></td><td>F : CCAGGTAACAGGAATCCTTC R : GGCTCCTTTATCATTAGATTG</td></tr><tr><td>Amorces : HPRT</td><td></td><td></td><td>F : CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R : GAGCACACAGAGGGCTACAA</td></tr><tr><td>Amorces : Kit Ligand</td><td></td><td></td><td>F : TGTTACTTTCTCATTGGGGGG R : AGTCCTGCTCCATGCAAGTT</td></tr><tr><td>Real-Time qPCR Quantstudio 3</td><td>ThermoFisher</td><td>A33779</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’isolement de l’ARN total ARNaque-micro</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Sélénium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de streptomycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1277</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma Series II&nbsp ; avec chemise d’eau CO2 ; incubateurs</td><td>ThermoFisher</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Thomas Stadie-Riggs trancheuse de tissus</td><td>Thomas Scientific</td><td>6727C10</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Roche&nbsp ;</td><td></td><td></td>10652202001</tr></tbody></table>

analyses de l’expression génique dans les follicules humains

Gene Expression Analyses in Human Follicles

L’ovaire est un organe hétérogène composé de différents types de cellules. Pour étudier les mécanismes moléculaires se produisant au cours de la folliculogenèse, la localisation des protéines et l’expression des gènes peuvent être effectuées sur des tissus fixes. Cependant, pour évaluer correctement les niveaux d’expression génique dans un follicule humain, cette structure complexe et délicate doit être isolée. Par conséquent, un protocole adapté précédemment décrit par le laboratoire de Woodruff a été développé pour séparer les follicules (l’ovocyte et les cellules de la granulosa) de leur environnement. Le tissu cortical ovarien est d’abord traité manuellement pour obtenir de petits fragments à l’aide de deux outils: une trancheuse de tissu et un hachoir à tissus. Le tissu est ensuite digéré enzymatiquement avec 0,2% de collagénase et 0,02% de DNase pendant au moins 40 min. Cette étape de digestion est réalisée à 37 °C et 5% de CO2 et s’accompagne d’un pipetage mécanique du milieu toutes les 10 min. Après incubation, les follicules isolés sont collectés manuellement à l’aide d’une pipette microcapillaire calibrée sous grossissement au microscope. Si les follicules sont toujours présents dans les morceaux de tissu, la procédure est complétée par une microdissection manuelle. Les follicules sont recueillis sur de la glace dans un milieu de culture et sont rincés deux fois dans des gouttelettes de solution saline tamponnée au phosphate. Cette procédure de digestion doit être soigneusement contrôlée pour éviter la détérioration du follicule. Dès que la structure des follicules semble compromise ou après un maximum de 90 min, la réaction est arrêtée avec une solution bloquante à 4 °C contenant 10% de sérum bovin fœtal. Un minimum de 20 follicules isolés (de moins de 75 μm) doit être recueilli pour obtenir une quantité adéquate d’ARN total après extraction de l’ARN pour la réaction en chaîne quantitative en chaîne de la polymérase en temps réel (RT-qPCR). Après extraction, la quantification de l’ARN total de 20 follicules atteint une valeur moyenne de 5 ng/μL. L’ARN total est ensuite rétrotranscrit en ADNc, et les gènes d’intérêt sont analysés plus en détail à l’aide de la RT-qPCR.

En utilisant cette procédure d’isolement, l’expérimentateur peut récupérer des follicules de l’environnement stromal pour effectuer des analyses d’expression génique spécifiques. En fonction de la taille et de la morphologie des follicules, il est possible de différencier les différentes étapes de la folliculogenèse. L’expérimentateur peut sélectionner les follicules d’intérêt en fonction de leur taille à l’aide d’une pipette microcapillaire adaptée. En utilisant un microcapillaire de 75 μm maximum, il est possible de di...

Ici, nous décrivons un protocole décrivant comment isoler les follicules ovariens humains du tissu cortical gelé-décongelé pour effectuer des analyses d’expression génique.

Analyses de l’expression génique dans les follicules humains

The ovary is a heterogeneous organ composed of different cell types. To study the molecular mechanisms occurring during folliculogenesis, the localization ...

Ce protocole décrit une méthode efficace pour isoler les follicules ovariens des cellules stroma environnantes afin d’évaluer les analyses d’expression génique sur ces cellules germinales. Cette technique, utilisant des isolations enzymatiques et mécaniques contrôlées, permet de récupérer les follicules tout en maintenant leur intégrité. En suivant ce protocole, le chercheur peut évaluer des expressions géniques spécifiques à partir de ces cellules.La technique pourrait être utilisée pour mieux comprendre le déficit d’expression génique dans les follicules lié à des maladies affectant la fonction ovarienne ou après une exposition à des agents toxiques. Commencez à préparer une plaque de six puits en ajoutant cinq millilitres de solution cryoprotectrice au premier puits et cinq millilitres de milieu Leibovitz 15 avec des concentrations décroissantes de cryoprotecteur aux quatre puits suivants. Retirer un flacon contenant un fragment cortical ovarien de l’azote liquide conformément aux règles de sécurité.Après 30 secondes à température ambiante, ou RT, faire tremper le flacon dans de l’eau distillée double pendant deux minutes. À l’intérieur d’une hotte verticale, agiter doucement et ouvrir le flacon de fragments corticaux ovariens avant de transférer le contenu dans le premier puits de la plaque de six puits placée sur de la glace. Ensuite, transférer successivement le fragment cortical ovarien dans le premier puits dans chaque puits de la plaque de six puits contenant des concentrations décroissantes de cryoprotecteur dans cinq millilitres de milieu Leibovitz 15.Agitez doucement le tissu dans chaque milieu pendant cinq minutes. Pour l’isolement du follicule, transférer le tissu ovarien décongelé dans une boîte de Petri quadrillée de deux millimètres remplie de 10 millilitres de milieu de dissection, de 30 microgrammes par millilitre de pénicilline G et de 50 microgrammes par millilitre de streptomycine. Ajustez la taille du tissu avec le scalpel, si nécessaire.Empilez les trois morceaux de la trancheuse à tissu et placez le fragment ovarien entre les deux blocs. Couper le fragment en deux à l’aide d’une lame, en glissant à travers les blocs pour obtenir deux fragments de 0,5 millimètre d’épaisseur. Coupez le tissu à l’aide du hacheur de tissu pour obtenir les plus petits morceaux.Si nécessaire, coupez les morceaux restants manuellement avec le scalpel jusqu’à ce que le tissu soit brisé. Une fois le tissu brisé, transférez le tissu fragmenté dans une boîte de Petri grillagée remplie de sept millilitres de milieu de digestion avant de placer la boîte dans l’incubateur à 5% de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius. Prenez la boîte de Petri de l’incubateur toutes les 10 minutes.Rincer le tissu en pipetant le milieu digestif de haut en bas avec une pipette d’un millilitre. Après 45 minutes d’incubation dans le milieu de digestion, placer la capsule sous un stéréomicroscope avec une plage de grossissement de cinq à 6,3 fois et récupérer les follicules à l’aide d’une micro pipette capillaire. Sélectionnez les follicules d’intérêt et isolez-les en les aspirant avec une pipette buccale.Si les follicules restent coincés dans un morceau de cortex, isolez-les mécaniquement avec deux seringues de calibre 27 en arrachant le cortex avec l’extrémité des seringues et en libérant les follicules du stroma. À l’aide du microcapillaire, transférer les follicules isolés dans une plaque à quatre puits contenant 15 microlitres du milieu de culture étalonné recouvert de 500 microlitres de culture d’huile. Après avoir transféré un à 10 follicules, rincez-les deux fois dans deux gouttes de 15 microlitres de PBS recouvertes de 500 microlitres de culture d’huile pendant cinq secondes chacune.À l’aide de la pipette buccale, recueillir 20 follicules avec un minimum de PBS dans un tube vide et garder le tube sur de la glace. Après 90 minutes d’incubation dans le milieu digestif, arrêtez la réaction enzymatique en ajoutant une solution de blocage du froid. Sous le capot chimique, suspendre les follicules isolés dans 100 microlitres de la solution de lyse fournie avec le kit d’extraction d’ARN.Vortex les follicules isolés à 2500 RPM par minute pour casser leur structure, puis ajouter 50 microlitres d’éthanol à 100% dans le tube. Et brièvement vortex le tube à grande vitesse. Après vortex, transférer le volume total du tube dans un ensemble de cartouches microfiltrantes, comprenant une colonne et un tube de collecte.Et centrifuger l’ensemble pendant 10 secondes à 16, 363g à quatre degrés Celsius. Lavez la colonne avec 180 microlitres de solution de lavage 1 fournie avec le kit avant de centrifuger le tube pendant 10 secondes. Après avoir donné deux lavages de 180 microlitres de solution de lavage 2, 3 à la colonne, sécher le filtre en centrifugeant le tube une dernière fois et placer un nouveau tube de collecte sous la cartouche.Pour effectuer l’élution des acides nucléiques, ajoutez d’abord huit microlitres de solution d’élution à 75 degrés Celsius à l’ensemble du filtre. Après une minute, centrifuger l’ensemble pendant 30 secondes. Répétez cette étape avec sept microlitres de solution d’élution.Une fois cela fait, ajoutez deux tampons DNase et DNase d’unité internationale au tube et incuber le tube pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. Bloquer l’activité enzymatique avec un réactif d’inactivation de la DNase pendant deux minutes à température ambiante. Ensuite, centrifuger le tube pendant 1,5 minute à 16, 363g à quatre degrés Celsius et transférer la suspension contenant l’ARN dans un nouveau tube.À l’aide d’un spectrophotomètre, évaluer la quantité d’ARN dans l’échantillon. Utiliser une solution d’élution de microlitre comme solution vierge et une solution de microlitre d’ARN extraite de follicules isolés. Vérifiez si le rapport 260/280 est d’environ 2,0 pour la pureté de l’ARN.Et conservez l’échantillon à moins 80 degrés Celsius ou rétrotranscrivez-le directement pour effectuer une RT-qPCR. En utilisant ce protocole, les deux fragments ovariens homogénéisés de 4x2x1 millimètre de la même patiente ont été traités pour isoler les follicules. La quantification de l’ARN a révélé que 4,8 nanogrammes par microlitre d’ARN total ont été extraits de follicules de moins de 75 micromètres avec un rapport de pureté de 1,89.Sur les follicules de moins de 200 micromètres, 10,5 nanogrammes par microlitre d’ARN total ont été extraits avec un rapport de pureté de 1,74. Les valeurs du nombre d’intégrité de l’ARN, ou RIN, étaient de 7,1 et 7,9 dans les tubes un et deux respectivement, validant la qualité de l’ARN de nos échantillons. Après avoir exécuté un cycle standard sur un système de PCR en temps réel, les seuils de cycle, ou CT, obtenus étaient de 30,87 et 29,56 pour HPRT, 33,5 et 31,77 pour le ligand kit, et 30,71 et 30,57 pour GDF9.La digestion enzymatique du tissu est un point critique. L’expérimentateur doit continuellement évaluer et assurer l’intégrité du follicule pendant la réaction en l’arrêtant si nécessaire. Outre les analyses d’expression génique, des follicules isolés sont utilisés pour développer des systèmes expérimentaux visant à préserver la fertilité des patients atteints de cancer, comme la culture de follicules in vitro ou l’ovaire artificiel.La technique d’isolement nécessitait une courbe d’apprentissage pour récupérer un grand nombre de follicules intacts. Il est conseillé aux chercheurs de s’assurer que le tissu est bien brisé avant la digestion.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

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