Tester l’efficacité in vitro et in vivo de nanoparticules d’ARNm-lipides formulées par mélange microfluidique

Ce protocole peut être utilisé pour formuler des nanoparticules lipidiques cohérentes encapsulant l’ARM. Les paramètres de formulation peuvent être ajustés et les différentes nanoparticules lipidiques peuvent être évaluées pour leur puissance et leur biodistribution. Un protocole standardisé pour la formulation de nanoparticules lipidiques et les tests in vitro et in vivo peut être utilisé pour formuler des nanoparticules lipidiques cohérentes qui peuvent être comparées les unes aux autres.

Il y a beaucoup de petits détails à garder à l’esprit lors de la formulation et de l’évaluation de la puissance des nanoparticules, mais quels détails ont pris en compte ? La préparation de la formulation ne devrait pas être difficile. Commencez par remplir un bécher propre de quatre litres avec 200 à 300 millilitres de PBS frais 10X et diluez-le à 1X avec de l’eau ultra-pure.

Assurez-vous que le volume final de PBS est compris entre deux et trois litres. Placer des cassettes de dialyse de la capacité appropriée pour la formulation de nanoparticules lipidiques, ou LNP, dans le bécher de champ. Diluez dix fois un tampon d’acide citrique de 100 millimolaires en utilisant de l’eau ultrapure pour créer un tampon d’acide citrique de 10 millimolaires pour la dilution de l’ARNm.

Ensuite, fabriquez du C 12 200 lipide ionisable, du lipide auxiliaire, du cholestérol et du PEG ancré lipidique ou des solutions mères de PEG lipidique en dissolvant chaque lipide dans de l’éthanol à 100 %. Assurez-vous que les solutions mères sont complètement dissoutes en les chauffant et en les mélangeant à 37 degrés Celsius. Combinez les volumes calculés des différents composants lipidiques dans un tube conique.

Diluer les lipides avec 100% d’éthanol jusqu’au volume final de V, ce qui représente 25% du volume final de LNP. Calculez la quantité d’ARNm nécessaire à la formulation en fonction du rapport lipide/poids de l’ARNm ionisable et du volume total d’ARNm-LNP. Ensuite, décongelez la luciférase luciole codant pour l’ARNm sur la glace.

Diluez ensuite l’ARNm jusqu’à obtenir un volume final trois fois supérieur à celui de la phase organique à l’aide du tampon d’acide citrique de 10 millimolaires. Vaporisez une lingette délicate avec un décontaminant de surface pour les ARN et l’ADN, et essuyez soigneusement l’intérieur de l’instrument microfluidique. Ensuite, ouvrez une nouvelle cartouche microfluidique et insérez-la avec les canaux d’entrée vers le bas et vers l’extérieur.

Disposez deux tubes coniques stériles de 15 millilitres sur le support avec les bouchons enlevés. Une fois cela fait, remplissez une seringue de cinq millilitres avec la solution d’ARNm contenant de l’ARNm diluée dans un tampon d’acide citrique de 10 millimolaires. Remplissez ensuite une seringue de trois millilitres avec la solution lipidique contenant les lipides dilués dans de l’éthanol à 100 %.

Assurez-vous d’éliminer l’air des seringues. Ensuite, sans l’aiguille, insérez la seringue de cinq millilitres contenant la solution d’ARNm dans l’entrée gauche de la cartouche, et insérez la seringue de trois millilitres contenant la solution lipidique dans l’entrée droite de la cartouche. Allumez l’instrument microfluidique et sélectionnez l’exécution rapide.

Après avoir sélectionné les types de seringues appropriés pour les seringues de cinq et trois millilitres insérées, entrez les paramètres de la formulation du LNP à un rapport de débit aqueux/organique de trois pour un, avant d’appuyer sur le bouton de démarrage pour formuler les ARNm-LNP. Chargez les ARNm-LNP collectés dans le tube conique droit dans les cassettes de dialyse préalablement hydratées à l’aide d’une seringue sans percer ni toucher la membrane de la cassette, replacez les cassettes de dialyse contenant les ARNm-LNP dans le bécher contenant le PBS et laissez-les se dialyser pendant au moins deux heures. Après la dialyse, amenez les cassettes de dialyse contenant les ARNm-LNP dans une enceinte de sécurité biologique stérile et retirez les ARNm-LNP à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille.

Filtrer stérilement les ARNm-LNP à l’aide d’un filtre seringue de 0,22 micromètre et les recueillir dans un tube conique stérile. Placez ensuite 65 microlitres de la solution d’ARNm-LNP dans un microtube de 1,5 millilitre pour la caractérisation. Plaque 5 000 cellules HepG2 dans une paroi blanche, fond transparent, plaque de 96 puits dans 100 microlitres de milieu de culture cellulaire complet et incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur contrôlé à 37 degrés Celsius contenant 5% de dioxyde de carbone.

Avant de traiter les cellules avec des ARNm-LNP, retirez le milieu complet des puits. Ensuite, traitez les cellules avec soit 100 microlitres d’ARNm-LNP dilués dans un milieu de culture cellulaire complet aux doses souhaitées, soit 100 microlitres de milieu complet avant une incubation de 24 heures. Après l’incubation, retirez le milieu de culture cellulaire de la plaque à 96 puits, ajoutez 20 microlitres de tampon de lyse dans chaque puits, puis 100 microlitres de réactifs de dosage de la luciférase.

Protégez la plaque de la lumière et placez-la dans un lecteur de plaque pour mesurer le signal bioluminescent. Diluer la solution d’ARNm-LNP à l’aide de PBS stérile afin que deux microgrammes d’ARNm total soient présents dans 100 microlitres du volume d’injection de la veine caudale. Remplissez une seringue à insuline de calibre 29 avec 100 microlitres d’ARNm-LNP ou 100 microlitres de PBS et retirez toutes les bulles de la seringue.

Insérez l’aiguille avec le biseau vers le haut dans la veine latérale de la queue de la souris et injectez lentement les 100 microlitres d’ARNm-LNP ou de PBS. Six heures après l’injection, préparez une solution mère de 15 milligrammes par millilitre de sel de potassium de D-luciférine dans du PBS stérile. Dans le logiciel d’imagerie du système d’imagerie in vivo, ou IVIS, cochez la case à côté de la luminescence avant d’appuyer sur initialiser pour préparer l’instrument à l’acquisition des données.

Ensuite, administrez 200 microlitres de D-luciférine par voie intrapéritonéale aux souris précédemment traitées et attendez 10 minutes pendant que le signal de la luciférase se stabilise avant d’anesthésier les souris. Transférez les souris anesthésiées dans les cônes nasaux à l’intérieur du système d’imagerie in vivo, en vous assurant qu’elles sont sur le dos avec leur abdomen exposé, avant de fermer la porte de la chambre. Dans le logiciel d’imagerie, assurez-vous que le champ de vision correct est sélectionné et réglez le temps d’exposition sur auto, cliquez sur le bouton d’acquisition dans le logiciel pour obtenir des images de bioluminescence.

L’efficacité d’encapsulation des ARNm-LNP a été déterminée à 92,3 % à l’aide du test de fluorescence modifié et de l’équation illustrés ici. Une augmentation de la bioluminescence a été observée lors du traitement de 5 000 cellules HepG2 avec des doses croissantes d’ARNm-LNP. L’expression de la luciférase a été facilement détectée à la dose la plus faible de cette étude, soit cinq nanogrammes par puits.

Un fort signal de bioluminescence a été observé dans la partie supérieure de l’abdomen des souris traitées avec des LNP formulés. Des régions d’intérêt ont été dessinées autour des signaux hépatiques pour calculer le flux luminescent total. Le flux luminescent total était d’environ cinq fois 10 jusqu’au 9ème.

Maintenez toujours le rapport lipide/acide nucléique ionisable lors de la formulation des LNP. Chaque volume de la phase organique doit contenir des lipides ionisables correspondant à l’ARNm dans trois volumes de la phase aqueuse.