Name: Immunoprécipitation de la chromatine dans le système modèle cnidaire Exaiptasia diaphana (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Découvrez l'immunoprécipitation de la chromatine optimisée pour Exaiptasia diaphana, un modèle cnidaire. Ce protocole X-ChIP cible H3K4me3 pour étudier les interactions protéine-ADN et la régulation épigénétique.

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En suivant le protocole ci-dessus, l’ADN obtenu a été utilisé avec succès pour ChIP-qPCR et ChIP-Seq. Le même profil général de pic pour H3K4me3 précédemment signalé chez d’autres organismes 26,27,28 a été obtenu ici, avec le pic le plus élevé autour du MES et un enrichissement élevé aux sites attendus dans la ChIP-qPCR. Le nombre relativement élevé de lectures multiply mappées dans les données ChIP-Seq pourrait avoir été causé par des doublons de PCR. Le nombre de lectures cartographiées de manière unique pourrait être augmenté en modifiant le protocole de préparation de la banque d’ADN afin de réduire les doublons de PCR. Il existe plusieurs méthodes de normalisation pour les données ChIP-qPCR, le pourcentage de la méthode d’entrée présenté ici étant le plus couramment utilisé. Cette méthode normalise l’IP et les échantillons fictifs directement à l’entrée, avec l’inconvénient que l’entrée est traitée différemment de l’IP et des échantillons fictifs pendant le ChIP, ce qui peut introduire des erreurs. La méthode alternative d’enrichissement du pli normalise le signal de l’IP en fonction du signal du simulacre en utilisant les mêmes jeux d’amorces, donnant ainsi un rapport signal/arrière-plan. Cependant, l’intensité du signal de l’échantillon fictif peut varier fortement, ce qui, à son tour, a des effets importants sur les données. Une discussion détaillée de la ChIP-qPCR et de la normalisation des données peut être trouvée dans Haring et al.29.
Un ajustement majeur de la méthode présentée ci-dessus par rapport aux protocoles ChIP courants est le temps de réticulation beaucoup plus long, d’environ 15 minutes pour les protéines histones à une incubation d’une nuit. L’objectif principal de cet ajustement est de faciliter la pénétration du formaldéhyde fixateur à travers la couche de mucus dans les tissus plus profonds d’E. diaphana afin de préserver les interactions protéine-ADN à l’intérieur du noyau. L’optimisation de cette étape est essentielle pour assurer une réticulation suffisante pour préserver les interactions protéine-ADN sans réticulation au point que le cisaillement de la chromatine par sonication devienne inefficace. L’ajout de détergents tels que le SDS peut également augmenter l’efficacité de la sonication29. De plus, une longue incubation avec du formaldéhyde a facilité l’étape d’homogénéisation et a permis d’obtenir un échantillon plus finement et uniformément broyé par rapport aux anémones fraîches ou congelées qui ont été homogénéisées avant l’étape de réticulation. Les plages recommandées de longueurs de fragments varient entre 100 pb et 1 000 pb,29,30 et peuvent dépendre de la protéine cible. Il est essentiel que chaque utilisateur optimise les conditions de sonication pour atteindre la longueur de fragment souhaitée avec le moins de puissance de sonication possible, car une sonication excessive peut dénaturer les protéines et, par conséquent, avoir un impact sur l’IP31. Une autre limite de la ChIP est la quantité de matériau requise, qui affecte particulièrement les organismes relativement petits tels que les anémones ; Ce problème a été résolu en réduisant la perte d’échantillon entre les étapes. Après avoir homogénéisé l’échantillon, il a été lysé immédiatement, omettant ainsi plusieurs étapes courantes de préparation des noyaux. Le pool d’échantillons obtenu à partir de 20 anémones contenait généralement suffisamment de chromatine pour trois IP et des contrôles fictifs et d’entrée. La quantité de matériel de départ (c’est-à-dire le nombre d’anémones) pourrait être encore réduite à l’avenir, en particulier lors de l’exécution d’une ChIP avec une seule protéine cible. En fonction de la méthode en aval prévue, les contrôles doivent être ajustés ; pour ChIP-qPCR, il faut considérer qu’il inclut des contrôles supplémentaires29, tandis que pour ChIP-seq, le mock peut être omis en faveur d’un contrôle d’entrée.
Bien que la validation des anticorps ne relève pas du champ d’application de ce protocole et n’ait donc été que brièvement abordée ici, il s’agit d’une étape critique avant la réalisation de la ChIP. En particulier lors de l’utilisation d’anticorps commerciaux sur des espèces d’invertébrés, la disponibilité d’anticorps spécifiques pour les cibles souhaitées peut être une limitation. Dans un premier temps, la séquence N-terminale de la queue H3 d’E. diaphana et d’autres organismes modèles, y compris le poisson-zèbre et les souris, a été comparée et s’est avérée très conservée12. La spécificité de l’anticorps a ensuite été testée à l’aide de l’immunofluorescence, qui a co-localisé les signaux de l’acide nucléique et de l’anticorps. Le profil de pic de H3K4me3 autour du TSS obtenu à partir des données de séquençage donne une confiance supplémentaire quant à la spécificité de l’anticorps.
Une autre considération concernant la spécificité des anticorps est la possibilité de toute interaction avec les dinoflagellés symbiotiques que E. diaphana, ainsi que de nombreux autres anthozoaires, hébergent dans leurs cellules. L’analyse du transcriptome chez les dinoflagellés des genres Lingulodinium32 et Symbiodinium33 a révélé la présence de gènes codant pour les histones, y compris l’histone H3 centrale et plusieurs variantes H3 à de faibles niveaux d’expression, et l’étendue de la conservation fonctionnelle du code des histones n’est pas claire34. Marinov et Lynch34 ont comparé la conservation de la séquence des queues N-terminales de la variante H3 au sein et entre les espèces de dinoflagellés, et les espèces de Symbiodiniaceae ont montré une forte divergence autour de la lysine 4 dans la séquence de la queue, en particulier si l’on considère la congruence des acides aminés adjacents à la lysine 4 comme facteur. Il a également été démontré que cette région diverge d’autres espèces modèles telles que Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster et Saccharomyces cerevisiae, qui correspondent à la séquence d’E . diaphana12. Par conséquent, le risque d’interaction involontaire de l’anticorps contre H3K4me3 avec le dinoflagellé H3 est faible. De plus, les séquences ne sont alignées que sur le génome d’E. diaphana , et les amorces qPCR doivent être spécifiques aux séquences d’E. diaphana , fournissant une couche supplémentaire de filtration de toute séquence précipitée involontairement.
Le protocole ChIP présenté produit suffisamment d’ADN pour la qPCR ainsi que pour le séquençage de prochaine génération, et bien qu’une optimisation individuelle par chaque utilisateur soit probablement nécessaire, il fournit un point de départ pour l’étude accrue des interactions protéine-ADN chez les cnidaires benthiques, peut-être dans le contexte de la symbiose et des changements environnementaux.

Le rapport 2022 du Groupe d’experts intergouvernemental sur l’évolution du climat (GIEC) souligne que, malgré les efforts croissants de sensibilisation et d’atténuation, des vagues de chaleur marines de plus en plus intenses et fréquentes exposent les récifs coralliens à un risque élevé de blanchissement généralisé et de mortalité massive au cours des prochaines décennies1. Afin d’éclairer les efforts de conservation et de restauration des récifs coralliens, les effets actuels et prévus des conditions environnementales changeantes sur les cnidaires benthiques sont étudiés à plusieurs niveaux biologiques afin de comprendre les mécanismes sous-jacents de réponse et de résilience2.
La disponibilité d’outils d’investigation applicables aux cnidaires benthiques est cruciale pour relever ce défi, et le développement de ces outils nécessite un effort actif de transfert des connaissances et des technologies établies dans d’autres domaines aux organismes marins3. Les obstacles au travail avec de nombreuses espèces de coraux sont en partie atténués par l’utilisation de systèmes modèles, tels que l’anémone de mer Exaiptasia diaphana (communément appelée Aiptasia)4. Ces anémones de mer à croissance rapide, symbiotiques facultatives, sont relativement faciles à garder dans des conditions de laboratoire, se reproduisent à la fois sexuellement et asexuellement, et n’ont pas le squelette de carbonate de calcium5. Le génomede référence 5 en libre accès d’E. diaphana facilite l’utilisation de méthodes épigénétiques nécessitant un séquençage. Cependant, des caractéristiques telles qu’une teneur élevée en eau, une production de mucus et de faibles quantités de tissus par individu constituent des défis pour l’établissement de protocoles reproductibles, freinant ainsi la recherche épigénétique sur E. diaphana et d’autres cnidaires présentant des caractéristiques similaires.
Les modifications épigénétiques peuvent modifier le phénotype sans modifier la séquence nucléotidique génomique d’un organisme en régulant les processus associés à la chromatine6. La régulation épigénétique des cnidaires est principalement étudiée dans les contextes de l’histoire évolutive et du développement 7,8,9,10, de l’établissement et du maintien de la symbiose 11,12,13 et de la réponse aux changements environnementaux 14,15. Plus précisément, des variations dans les modèles de méthylation de l’ADN, qui, dans la plupart des cas, impliquent l’ajout d’un groupe méthyle à une base cytosine, ont été observées en réponse à des conditions environnementales changeantes telles que le réchauffement13 et l’acidification des océans16. Il a également été démontré que les modèles de méthylation de l’ADN sont héréditaires d’une génération à l’autre, ce qui met l’accent sur le rôle de l’épigénétique dans l’acclimatation des coraux aux facteurs de stressenvironnementaux17. Par rapport à la méthylation de l’ADN, il y a eu relativement peu d’études sur d’autres régulateurs épigénétiques importants, tels que les ARN non codants11,18,19, les facteurs de transcription 9,10 ou les modifications post-traductionnelles des histones (PTM) chez les cnidaires20. L’étude des protéines associées à l’ADN est particulièrement exigeante car les méthodes disponibles nécessitent l’accès à un génome de référence de l’organisme à l’étude et sont coûteuses en raison de la grande taille des échantillons et des anticorps à haute spécificiténécessaires3. Avec une grande variété de groupes chimiques qui forment des PTM au niveau de résidus d’histones spécifiques, la compréhension des paysages de modification de la chromatine chez les cnidaires, en particulier dans le contexte de stress environnementaux imminents, reste un grand défi.
L’objectif de ce travail est de faire progresser l’étude des PTM d’histones, des variants d’histones et d’autres protéines associées à la chromatine chez les cnidaires en présentant un protocole optimisé d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour le modèle de corail E. diaphana (protocole original de Bodega et al.21). La ChIP peut être combinée à la PCR quantitative pour caractériser les interactions protéine-ADN spécifiques au locus ou au séquençage de nouvelle génération (NGS) pour cartographier ces interactions dans l’ensemble du génome. En général, les protéines et l’ADN sont réticulés de manière réversible, de sorte que la protéine d’intérêt (POI) reste liée au même locus qu’elle est associée in vivo. Alors que la méthode de réticulation couramment utilisée dans le système modèle de mammifère est généralement maintenue à 15 minutes ou moins à température ambiante, l’approche de réticulation a été optimisée pour permettre au formaldéhyde de pénétrer plus efficacement à travers le mucus produit par E. diaphana . Le tissu est ensuite congelé dans de l’azote liquide, homogénéisé et lysé pour extraire les noyaux des cellules. La perte de matière dans ces étapes est évitée en utilisant un seul tampon de lyse, puis en passant directement à la sonication, qui fragmente la chromatine en fragments de ~300 pb de long. Ces fragments sont incubés avec un anticorps spécifique au POI jusqu’à une précision de l’ordre du PTM. L’immunocomplexe anticorps-protéine-ADN est précipité à l’aide de billes magnétiques qui se lient aux anticorps primaires, ne sélectionnant ainsi que les segments d’ADN associés au POI. Après l’inversion de réticulation et le nettoyage du précipité, les segments d’ADN obtenus peuvent être utilisés pour la qPCR ou la construction d’une bibliothèque d’ADN pour le séquençage afin de cartographier les segments à un génome de référence et, ainsi, d’identifier les loci auxquels le POI est associé. Vous trouverez plus de détails sur les considérations relatives à chaque étape dans Jordán-Pla et Visa22.

<table><tbody><tr><td>1 kb Plus DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10787018</td><td></td></tr><tr><td>100 % éthanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubes</td><td></td><td></td><td></td>faucon</tr><tr><td>16 % solution de formaldéhyde (w/v), sans méthanol</td><td>Thermo scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr>Tube <td></td><td></td><td></td>de<td>5 mL</td></tr><tr><td>Tubes 5PRIME Phase Lock</td><td>Quantabio</td><td>2302820</td> Phase <td>lock gel - aiguille légère</td></tr><tr><td>AGANI 25 G</td><td>Terumo</td><td>AN*2516R1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie</td><td></td><td></td><td>open source, disponible à partir de https://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml</td></tr><tr><td>Branson sonifier 250</td><td>Branson</td><td></td><td>Sonicator&nbsp ;</td></tr><tr><td>Centrifugeuse&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>5430 R</td><td>Avec rotors pour tubes de 15 mL et 1,5 mL</td></tr><tr><td>Anticorps de qualité ChIP (ici anticorps polyclonal H3K4me3)</td><td>Diagenode</td><td>C15410003</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail complet d’inhibiteur de protéase sans EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>2 comprimés/mL d’eau pour 100x stock</td></tr><tr><td>Verre de couverture</td><td>vwr</td><td>48393 194</td><td></td></tr><tr><td>Spatule jetable</td><td>vwr</td><td>80081-188</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purification de l’ADN (ici QIAGEN QIAquick PCR purification kit)</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Broyeur de tissus Dounce</td><td>Pilon étanche</td><td>Wheaton</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) 1x</td><td>gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>324626</td><td></td></tr><tr>Système <td></td><td></td><td></td><td>d’électrophorèse</td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FASTQC v0.11.9</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Gel Doc EZ Système de documentation</td><td>Bio-Rad</td><td>1708270</td><td>Système d’imagerie Gel</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>Injekt-F Seringue à tuberculine 1 mL</td><td>B. Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide linéaire (5 mg/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9520</td><td></td></tr><tr>Tube <td></td><td></td><td></td><td>à faible rétention de 1,5 mL</td></tr><tr><td>Rack</td><td></td><td></td> de séparation magnétique <td>pour tubes de 1,5 mL</td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lame</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de microscopeModel-based Analysis of ChIP-Seq (MACS)</td><td></td><td></td><td>open source</td></tr><tr><td>Mortier et pilon, porcelaine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c spectrophotomètre</td><td>Thermo scientific&nbsp ;</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroylsarcosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61739</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur à eau</td><td></td><td></td><td></td>sans nucléases</tr><tr><td>Phénol :Chloroforme :Alcool isoamylique Mélange (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K (20 mg/mL)</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>Purple Colorant de chargement 6x</td><td>New England BioLabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimètre Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase Cocktail Enzyme Mix</td><td>Invitrogen</td><td>AM2286</td><td>RNase A = 500 U/mL, RNase T1 = 20000 U/mL</td></tr><tr><td>Acétate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Désoxycholate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>TAE buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5384000012</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>solution Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4 %)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>Danger : peut causer le cancer. Suspecté de nuire à la fertilité ou à l’enfant à naître</td></tr><tr><td>Rotateur de tube SB3</td><td>Stuart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure SDS Solution, 10 %</td><td>Invitrogen</td><td>15553027</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à</td><td></td><td></td><td></td> vide</tr></tbody></table>

immunoprécipitation de la chromatine dans le système modèle cnidaire exaiptasia diaphana

Chromatin Immunoprecipitation in the Cnidarian Model System Exaiptasia diaphana

Les modifications post-traductionnelles des histones (PTM) et d’autres modifications épigénétiques régulent l’accessibilité de la chromatine des gènes à la machinerie transcriptionnelle, affectant ainsi la capacité d’un organisme à répondre aux stimuli environnementaux. L’immunoprécipitation de la chromatine couplée au séquençage à haut débit (ChIP-seq) a été largement utilisée pour identifier et cartographier les interactions protéine-ADN dans les domaines de l’épigénétique et de la régulation des gènes. Cependant, le domaine de l’épigénétique des cnidaires est entravé par un manque de protocoles applicables, en partie à cause des caractéristiques uniques d’organismes modèles tels que l’anémone de mer symbiotique Exaiptasia diaphana, dont la teneur élevée en eau et les quantités de mucus obstruent les méthodes moléculaires. Ici, une procédure ChIP spécialisée est présentée, qui facilite l’étude des interactions protéine-ADN dans la régulation du gène E. diaphana . Les étapes de réticulation et d’extraction de la chromatine ont été optimisées pour une immunoprécipitation efficace, puis validées par la réalisation de ChIP à l’aide d’un anticorps contre la marque d’histone H3K4me3. Par la suite, la spécificité et l’efficacité du test ChIP ont été confirmées en mesurant l’occupation relative de H3K4me3 autour de plusieurs loci génétiques activés constitutivement à l’aide de la PCR quantitative et par séquençage de nouvelle génération pour l’analyse à l’échelle du génome. Ce protocole ChIP optimisé pour l’anémone de mer symbiotique E. diaphana facilite l’étude des interactions protéine-ADN impliquées dans les réponses de l’organisme aux changements environnementaux qui affectent les cnidaires symbiotiques, tels que les coraux.

Selon le protocole ci-dessus, l’ADN associé à la triméthylation de l’histone 3 lysine 4 (H3K4me3) a été immunoprécipité. L’anticorps de grade ChIP-seq a déjà été utilisé sur l’anémone de mer Nematostella vectensis7 et a été validé ici par la coloration immunofluorescente de coupes de tissus d’E. diaphana (Figure 3). Bien que le rendement en ADN dépende de la quantité de matière d’entrée, il était régulièrement d’environ 100 ng/μL. Les fragments d’ADN obtenus ont été analysés par séquençage et qPCR (liste des amorces dans le fichier supplémentaire 1).
Une profondeur de séquençage de 40 millions de lectures a donné ~17,6 millions de lectures cartographiées de manière unique. Après des contrôles de qualité, les lectures brutes ont été coupées et cartographiées sur le génome d’E. diaphana à l’aide de Bowtie24 (voir le tableau des matériaux). L’analyse modélisée des données ChIP-Seq avec MACS (voir Tableau des matériaux) a permis d’identifier un total de 19 107 pics25. Comme prévu pour H3K4me3, la plupart des pics étaient situés près du site de début transcriptionnel (TSS), et la fréquence du comptage des pics a fortement diminué des deux côtés du TSS, mais surtout vers le corps du gène (Figure 4).
Trois gènes avec des pics élevés autour de leurs TSS ont été identifiés à partir des données de séquençage, et les amorces qPCR ont été conçues pour cibler plusieurs loci de pics élevés dans ces gènes. Les données qPCR ont été normalisées à l’aide de la méthode du pourcentage d’entrée (figure 5). Un enrichissement élevé en H3K4me3 par rapport aux témoins d’entrée et simulés a été observé. Le pourcentage d’entrée variait entre 2,7 % et 10,7 %, avec des différences d’enrichissement observées entre les gènes et entre les différents loci au sein d’un même gène.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64817/64817fig03v2.jpg"> Figure 3 : Coloration immunofluorescente de H3K4me3. Une coupe de tissu d’E. diaphana a été colorée avec (A) une coloration bleue à l’acide nucléique Hoechst et (B) un anticorps secondaire jaune marqué au fluorophore contre l’anticorps primaire contre H3K4me3. (C) Un chevauchement de A et B montrant une co-localisation dans le noyau. Barre d’échelle = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64817/64817fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64817/64817fig4v2.jpg"> Figure 4 : Fréquence de comptage des pics élevée autour du site de départ transcriptionnel. La distribution de la fréquence de comptage des pics de modification de H3K4me3 s’étendant en amont (−) et en aval (+) 2 000 pb autour du site de début transcriptionnel (TSS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64817/64817fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64817/64817fig05.jpg"> Figure 5 : H3K4me3 ChIP-qPCR chez Exaiptasia diaphana. Les résultats sont représentés en pourcentage (%) des entrées. Les locus situés près du site de départ transcriptionnel des gènes respectifs (AIPGENE12312, AIPGENE26042 et AIPGENE5950) ont été choisis pour la ChIP-qPCR. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type entre les répétitions, n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64817/64817fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Fichier supplémentaire 1 : Liste des amorces utilisées pour la qPCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64817/ChIP_JoVE_SupplementalFile1.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Un test d’immunoprécipitation de la chromatine (X-ChIP) contre la marque d’histone H3K4me3 pour l’organisme modèle Exaiptasia diaphana est présenté. La spécificité et l’efficacité du test sont confirmées par la PCR quantitative et le séquençage de nouvelle génération. Ce protocole permet d’étudier davantage les interactions protéine-ADN chez l’anémone de mer E. diaphana.

Immunoprécipitation de la chromatine dans le système modèle cnidaire Exaiptasia diaphana

Histone post-translational modifications (PTMs) and other epigenetic modifications regulate the chromatin accessibility of genes to the transcriptional ...

L’établissement d’un protocole ChIP-seq chez Aiptasia est la première étape dans l’étude des repères épigénétiques chez les cnidaires symbiotiques et de la manière dont ceux-ci peuvent réguler l’interaction d’un organisme avec son environnement. Le protocole est optimisé pour répondre aux caractéristiques difficiles des cnidaires, telles qu’une production élevée de mucus et un rapport eau/tissu élevé, en augmentant le temps de réticulation et en minimisant la perte de tissus. Récupérez les anémones dans un tube de 15 millilitres et laissez-les se déposer au fond du tube.Vous pouvez également les faire tourner dans une centrifugeuse à température ambiante pendant quelques secondes, jusqu’à 3 500 g. Ensuite, retirez l’excès d’eau de mer à l’aide d’une pompe à vide. Lavez les anémones en les suspendant dans le DPBS.Et retirez le DPBS après le lavage. À l’aide d’une pince à épiler ou d’une spatule en plastique, transférez les anémones, sans le tampon superflu, dans le tampon de réticulation à 0,5 %. Incuber pendant une heure sur un rotateur à une vitesse de 12 rotations par minute et quatre degrés Celsius.Après l’incubation, retirez le tampon de réticulation à 0,5 % du tube contenant les anémones. Remplissez le tube avec le tampon de réticulation à 1 %. Et incubez-le sur un rotateur pendant la nuit à 12 rotations par minute et quatre degrés Celsius.Le lendemain, après avoir retiré le tampon de réticulation à 1 %, éteignez la réaction de réticulation en suspendant les anémones dans le tampon de trempe et en incubant la suspension sur un rotateur pendant 20 minutes à 12 rotations par minute et quatre degrés Celsius. Ensuite, retirez le tampon de trempe et lavez les anémones deux fois dans DPBS. Décanter le DPBS.Et videz les anémones sur un mouchoir en papier pour enlever le plus de liquide possible. Versez un peu d’azote liquide dans le mortier et transférez les anémones à l’aide d’une pince à épiler. À l’aide du pilon, commencez par briser soigneusement les tissus.Continuez à faire l’appoint d’azote liquide, au besoin, pour éviter le dégivrage. Continuez à broyer jusqu’à ce que l’échantillon devienne une poudre fine. À l’aide d’une spatule, prélevez l’échantillon et transférez-le dans le tampon de lyse, en vous assurant que l’échantillon se dissout dans le tampon.Laissez reposer l’échantillon sur de la glace pendant une minute avant de le mélanger par inversion. Ensuite, après avoir lavé un broyeur de mouchoirs avec un tampon de lyse, transférez l’échantillon et dénoncez-le 20 à 30 fois avec un pilon étanche. Transférez l’échantillon dans le tube.Et incubez-le pendant la nuit sur un rotateur à 14 rotations par minute et quatre degrés Celsius. Placez l’échantillon dans le sonciateur avec l’aiguille à un centimètre au-dessus du fond du tube et sans toucher les parois. Démarrez le sonciateur et assurez-vous qu’il n’y a pas de mousse produite dans l’échantillon.Augmentez lentement la puissance de sortie à deux et laissez agir pendant deux minutes supplémentaires. Après cela, éteignez le sonciateur, remettez la puissance de sortie à zéro et laissez l’échantillon se reposer et refroidir pendant deux minutes. En fonction du volume de l’échantillon et du nombre d’immunoprécipitations prévues, augmentez le volume total de l’échantillon en ajoutant 10 % de Triton X-100 et 100X Cocktail d’inhibiteurs de protéase, ou PIC, à des concentrations finales de 1 % et 1X respectivement.Transférez le volume de chaque IP dans un tube séparé, à faible rétention, de 1,5 millilitre pour l’immunoprécipitation de la chromatine, ou ChIP, suivi d’une PCR quantitative, ou qPCR. Placez le volume équivalent de l’échantillon dans un autre tube de 1,5 millilitre comme témoin fictif. Prenez 10% du volume des IP comme contrôle d’entrée et stockez-le à moins 20 degrés Celsius.Ajoutez quatre microgrammes d’anticorps histone 3 lysine 4 triméthylation, ou H3K4 triméthylation, à chaque IP, mais pas au simulacre. Incuber les réactions IP et le simulacre sur le rotateur de tube pendant la nuit à 12 rotations par minute et quatre degrés Celsius. Coupez la pointe d’une pointe de pipette pour augmenter son diamètre.Et transférez 50 microlitres de billes magnétiques dans des tubes séparés, un tube par IP et un pour le simulacre. Ajoutez un millilitre de solution de blocage dans chaque tube. Et incubez-les sur un rotateur pendant 30 minutes, comme précédemment.À l’aide d’une pipette, retirer et jeter le surnageant de solution de blocage et rincer les billes de la paroi avec l’IP ou la réaction fictive. Remettez le mélange dans les tubes à faible rétention respectifs contenant les échantillons. Incuber tous les tubes, comme précédemment, pendant trois heures.Après l’incubation, placez les IP et mock sur le support magnétique et attendez environ 10 à 20 secondes pour que les aimants se séparent. Jetez le surnageant et ajoutez un millilitre de tampon de lavage à faible teneur en sel. Après avoir incubé les tubes, comme précédemment, pendant cinq minutes, remettez-les sur la grille magnétique.Retirez le tampon de lavage à faible teneur en sel. Ajoutez un millilitre de tampon de lavage avec beaucoup de sel et incubez pendant cinq minutes de plus. Retirez et jetez le surnageant à l’aide d’une pipette et lavez-le avec un millilitre de tampon de sel TE.Répétez le lavage une fois de plus et rincez toutes les perles du capuchon du tube. Après avoir jeté le deuxième tampon de sel TE, ajoutez 210 microlitres de tampon d’élution à chaque réaction. Suspendez les billes magnétiques et éluez à 65 degrés Celsius, en secouant à 700 rotations par minute pendant 15 minutes.Placez les réactions sur le support magnétique, collectez l’éluant et placez-le dans un tube frais de 1,5 millilitre. Ensuite, retirez l’entrée du congélateur et ajoutez un tampon d’élution à un volume total de 420 microlitres. Inversez la réticulation de tous les éluants et de l’entrée en les incubant à 65 degrés Celsius et 700 rotations par minute pendant la nuit.Pour la digestion de l’ARN, ajoutez 10 microlitres de cocktail RNase et incubez à 42 degrés Celsius et 700 rotations par minute pendant 30 minutes. Pour la digestion des protéines, ajoutez huit microlitres de protéinase K et incubez à 55 degrés Celsius et 700 rotations par minute pendant une heure. Sous une hotte, ajoutez un échantillon et le même volume de mélange phénol-chloroforme-alcool isoamylique dans chaque tube de gel à verrouillage de phase.Secouez vigoureusement les tubes et agitez-les brièvement, jusqu’à ce qu’ils forment une couche blanche mousseuse. Essorer pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et 20 000 g. Vérifiez que la phase aqueuse est claire.Transférez la phase aqueuse dans un tube frais à l’aide d’une pipette. Ajoutez 100 % d’éthanol, soit l’équivalent de deux fois le volume de l’échantillon, et agitez. Incuber à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit, ou à moins 80 degrés Celsius pendant 30 minutes.Granulez l’ADN en faisant tourner les échantillons pendant 30 minutes à 15 000 g. Décantez soigneusement le surnageant et lavez les granulés avec un millilitre d’éthanol à 70 %. Tournez à vitesse maximale pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Décanter soigneusement avant de retirer tout l’éthanol par pipetage. Remettez les granulés en suspension dans 30 microlitres d’eau sans nucléases. L’ADN, associé à la triméthylation de l’histone 3 lysine 4, ou H3K4, a été immunoprécipité et les coupes de tissu d’E. diaphana ont été colorées par coloration immunofluorescente.Les fragments d’ADN obtenus ont été analysés par séquençage et qPCR. L’analyse modélisée des données ChIP-seq a permis d’identifier 19 107 pics. Comme prévu pour la triméthylation de H3K4, la plupart des pics étaient situés près du site de début transcriptionnel, ou TSS, et la fréquence du nombre de pics a fortement diminué des deux côtés du TSS, en particulier vers le corps du gène.Les amorces de qPCR ont été conçues pour cibler plusieurs loci près du TSS respectif de trois gènes. Un enrichissement élevé de la triméthylation de H3K4 par rapport aux témoins d’entrée et simulés a été observé. Le pourcentage d’entrée variait entre 2,7 et 10,7 %, l’enrichissement différant selon les gènes et les loci au sein d’un même gène.Espérons qu’une compréhension de la régulation épigénétique des cnidaires en réponse aux changements environnementaux causés par la crise climatique pourrait éclairer les efforts de conservation et de restauration des récifs coralliens.

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Genetics

Génétique

Source : Mendez, F. M. et al., Immunoprécipitation native de la chromatine à l’aide de neurosphères de tumeurs cérébrales murines. J. Vis. Exp. (2018). Cette vidéo démontre l’isolement de complexes protéine-ADN à partir de cellules de la neurosphère dérivées d’une tumeur cérébrale de souris à l’aide de l’immunoprécipitation native de la chromatine. Il détaille les étapes de préparation de la chromatine, d’immunoprécipitation, de lavage et de digestion des protéines afin de libérer l’ADN pour...

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