Criblage de la structure de l’ARN avec le profilage mutationnel du sulfate de diméthyle avec séquençage in vitro et dans les cellules

DMS-MaP est une méthode basée sur le séquençage qui nous permet d’obtenir un instantané de la structure de l’ARN et d’apprendre comment elle change dans différentes conditions. Contrairement aux méthodes conventionnelles de détermination de la structure, comme la cristallographie et la microscopie électronique, le DMS-MaP peut être utilisé dans les cellules et les ensembles de structures d’ARN déconvoluées. Comme la structure de l’ARN a des implications dans une multitude de phénomènes biologiques, notre méthode pourrait fournir des informations mécanistes dans presque tous les domaines de la recherche biologique.

Commencez par transférer 89 microlitres du tampon de repliement dans un tube désigné de 1,5 millilitre pour chaque réaction ayant un volume final de 100 microlitres. Préchauffez le tube à 37 degrés Celsius dans un thermoshaker placé sous une hotte chimique. Ajoutez 10 microlitres d’eau sans nucléase dans un tube de PCR et transférez-y un à 10 picomoles d’ARN.

Incuber dans un thermocycleur à 95 degrés Celsius pendant une minute pour dénaturer l’ARN. Et puis placez immédiatement le tube sur un bloc de glace pour éviter le mauvais repliement de l’ARN. Maintenant, pour remodeler l’ARN, ajoutez l’échantillon au tube désigné contenant le tampon de repliement à 37 degrés Celsius et mélangez-le bien avant de l’incuber pendant 10 à 20 minutes.

Ensuite, ajoutez un microlitre de sulfate de diméthyle à 100%, ou DMS, ayant une concentration de 10,5 molaires dans le tube contenant l’échantillon d’ARN, et incuber le mélange réactionnel pendant cinq minutes tout en l’agitant à 800 à 1 400 rotations par minute. Après la réaction de cinq minutes, éteignez-le avec 60 microlitres de bêta-mercaptoéthanol à 100% et mélangez-le bien avant de vorter et de placer immédiatement l’ARN sur la glace. Ensuite, nettoyez l’ARN et éluez-le dans 10 microlitres d’eau sans nucléase.

Quantifier l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre. Enfin, stockez l’ARN modifié à moins 80 degrés Celsius. Après avoir ajouté le mélange réactionnel dans le tube PCR, transférer au moins 100 nanogrammes de l’ARN modifié élué dans 10 microlitres d’eau exempte de nucléases dans le tube PCR.

Incuber le mélange à 57 degrés Celsius pendant 30 minutes à 1,5 heure dans un thermocycleur. 30 minutes suffisent pour fabriquer un produit contenant 500 nucléotides. Ensuite, ajoutez-y un microlitre d’hydroxyde de sodium à quatre molaires, mélangez bien à la pipette et incuber à 95 degrés Celsius pendant trois minutes pour dégrader l’ARN et libérer le TGIRT de l’ADN complémentaire.

En utilisant une approche basée sur les colonnes pour enlever les amorces, nettoyez l’ADN complémentaire. Et effectuer la PCR pour l’amplifier. Vérifiez le succès de la PCR en faisant passer deux microlitres du produit PCR sur un gel d’agarose avant de procéder à la préparation de la bibliothèque.

Ensuite, quantifier les fragments extraits à l’aide d’un spectrophotomètre avant d’indexer les fragments pour le séquençage. Transférer les cellules infectées par le virus cultivées au stade d’infection souhaité dans une hotte dédiée et appropriée ayant le niveau de biosécurité requis. Ajouter 2,5% de volume de DMS au milieu de culture contenant les cellules et sceller le récipient avec un parafilm.

Incuber immédiatement le récipient à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l’incubation, extraire soigneusement la pipette et jeter le milieu contenant du DMS dans les déchets chimiques appropriés. Ensuite, ajoutez doucement 10 millilitres de tampon stop dans les cellules, grattez les cellules et transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres.

Enduire les cellules en centrifugeant le tube pendant trois minutes à 3 000 g. Retirez le surnageant et lavez la pastille de cellule deux fois avec 10 millilitres de PBS. Retirez soigneusement le PBS résiduel autant que possible après le lavage.

Dissoudre la pastille dans une quantité appropriée de réactif d’isolement d’ARN pour effectuer l’extraction de l’ARN. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de chloroforme à un millilitre de cellules homogénéisées dans le réactif d’isolement d’ARN et faites-le tourbillonner pendant 15 à 20 secondes jusqu’à ce que la solution cellulaire devienne rose vif. Attendez que la séparation de phase ait eu lieu, ce qui est indiqué par la phase lipidique rose qui se dépose en bas.

Faites tourner le tube à une vitesse d’environ 20 000 g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius avant de transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube. Nettoyez l’ARN et éluez dans un volume suffisant d’eau exempte de nucléase. Ensuite, après avoir effectué la déplétion de l’ARN ribosomique en utilisant l’approche préférée, éluez l’ARN dans un volume adéquat d’eau exempte de nucléase et quantifiez-le à l’aide d’un spectrophotomètre.

L’ARN purifié peut être réutilisé en RT-PCR. En utilisant le serveur Web mentionné, les données DMS-MaP peuvent être facilement analysées. Les lectures sont mappées à une référence et les mutations par base sont comptées.

Les fichiers de moyenne de population qui en résultent peuvent être utilisés comme contraintes dans des logiciels de prédiction de structure d’ARN bien connus. Les structures d’énergie libre minimale qui en résultent peuvent être visualisées à l’aide d’un logiciel comme VARNA. À l’heure actuelle, seule la version stable de DREAM peut déconvoluer les ensembles de structures d’ARN.

Cependant, des travaux visant à rendre cette fonctionnalité plus accessible à l’ensemble de la communauté sont en cours. La transcription in vitro du fragment gBlock allongé par fixation d’un promoteur de polymérase T7 a généré l’ARN d’intérêt, apparaissant comme une seule bande à 300 nucléotides sur un gel d’agarose à 1%. Le succès de la RT-PCR spécifique au gène réalisée sur l’ARN modifié par le DMS a été indiqué par une seule bande à 300 paires de bases sur un gel d’agarose à 2%.

Le fragment indexé est apparu environ 150 paires de bases plus haut que prévu. Le traitement DMS a été effectué sur des cellules HCT-8 présentant un effet cytopathique quatre jours après l’infection par le virus. L’ARN total extrait est apparu sur le gel d’agarose sous la forme de deux bandes brillantes, représentant les sous-unités 40S et 60S.

Après l’épuisement de l’ARN ribosomique, les deux bandes brillantes ont disparu, laissant un frottis dans la voie correspondante. Après la préparation de la bibliothèque, les échantillons avaient des distributions de taille variables et apparaissaient sous forme de frottis. La bande a été excisée entre 200 et 500 nucléotides, et les dimères adaptateurs ont été séparés.

Le modèle de structure du génome du SARS-CoV-2 a montré que les bases à conformation ouverte ont une réactivité plus élevée que celles engagées dans l’appariement de bases. Le profil de réactivité des bases indiquait que l’uracile et la guanine avaient de faibles valeurs de réactivité et n’étaient pas modifiées par le DMS. Avec notre méthode, nous sommes en mesure de prédire les structures dans les cellules de manière à haut débit sans contraintes de taille.

Les mesures de contrôle sont très importantes, car elles donnent un aperçu de la précision des prédictions de structure. Pour vérifier davantage l’exactitude de la prédiction, d’autres expériences qui perturbent ou modifient la structure doivent être menées.