Microscopie à force atomique en mode contact en tant que technique rapide d’observation morphologique et d’analyse des dommages cellulaires bactériens
30 juin 2023
Ici, nous présentons l’application de la microscopie à force atomique (AFM) comme une méthode simple et rapide pour la caractérisation bactérienne et analysons des détails tels que la taille et la forme bactériennes, les biofilms de culture bactérienne et l’activité des nanoparticules en tant que bactéricides.
Ce protocole montre l’utilisation de la microscopie à force atomique en mode contact pour observer les changements dans la morphologie cellulaire dus à une maladie ou à un traitement spécifique. Il est fortement recommandé d’utiliser des récipients scellés pour cette procédure afin d’éviter la contamination et d’analyser l’échantillon fixe dès que possible pour éviter le vieillissement. Commencez par fixer les échantillons sur la lame en passant doucement la lame sur une flamme plusieurs fois jusqu’à ce que l’échantillon soit sec.
Placez les échantillons fixes dans une boîte de Petri et transportez-les vers l’équipement de microscope à force atomique pour observation. Ensuite, allumez l’ordinateur et le microscope à force atomique. Sélectionnez ensuite le mode de contact, les sondes ContAI-G et les options de pente automatique dans le logiciel.
Définissez les valeurs par défaut pour le contrôleur Z en réglant le point de consigne à 20 nanomètres, le gain P à 10 000, le gain I à 1 000, le gain D à zéro et la tension de pointe à zéro millivolts. À l’aide de la tête de plage de balayage de 70 micromètres, placez les échantillons en mode de contact AFM. Obtenez une vue rapide de la surface de la zone sous la sonde à l’aide d’une caméra montée sur deux objectifs intégrés dans la tête de numérisation.
Maintenant, choisissez la zone souhaitée en la déplaçant manuellement dans le plan XY. Laissez la sonde s’approcher électroniquement de la surface de l’échantillon jusqu’à ce que le contact soit atteint. Ajustez électroniquement le plan de mesure XY du scanner et de la surface de l’échantillon en réduisant la direction de la pente XY.
Définissez les paramètres standard du logiciel sur une ligne par seconde et 256 points par ligne. Ensuite, effectuez une plage de balayage complète d’une zone de 70 par 70 micromètres. Sélectionnez la zone plus petite à l’aide de l’outil de zoom.
Sélectionnez une nouvelle zone de l’échantillon en rétractant électroniquement le porte-à-faux et en déplaçant l’échantillon le long du plan XY. Effectuez ensuite une nouvelle analyse comme démontré précédemment. Ensuite, utilisez le nivellement ligne par ligne dans le menu Outils de l’image dans la sélection de filtre pour effectuer le traitement des données.
Optimisez la hauteur maximale et minimale dans la barre de couleur pour obtenir la meilleure résolution d’image. Enfin, effectuez l’analyse d’image à l’aide du menu d’analyse. Sélectionnez les points initiaux et finaux avec l’outil souhaité pour déterminer la longueur et la distance.
L’analyse microscopique à force atomique des cultures bactériennes a montré que les cultures de Staphylococcus aureus étaient distribuées par zones avec des agrégats de cocci. L’augmentation des échelles a montré qu’il y avait une meilleure appréciation de la distribution de la population et de la morphologie des cocci. Les images en mode contact AFM ont permis de déterminer la taille des cocci qui présentaient une largeur moyenne de 1,25 micromètre.
Pseudomonas hunanensis a montré une distribution homogène sur toute la surface de support en verre formant une monocouche adhérente. Les cultures étaient en forme de bâtonnets avec une longueur de 1,9 micromètre et une largeur de 0,9 micromètre. L’exposition à la micro-dilution de nanoparticules d’oxyde de magnésium de Staphylococcus aureus a entraîné la perte d’une surface lisse et de contours homogènes en raison d’une grave détérioration de la structure cellulaire.
La formation de vésicules et la libération de matériel cytosolique ont été observées dans des cultures à des concentrations plus élevées que le CMI. Des résultats similaires ont été obtenus dans des cultures d’E. coli, les témoins montrant des surfaces lisses mettant en évidence sa forme homogène en forme de bâtonnet. La structure a complètement disparu à 1 000 ppm d’exposition aux nanoparticules avec seulement des silhouettes distinguables.
Il est important d’effectuer correctement la fixation des échantillons car elle est essentielle pour une analyse plus approfondie. Le filtre d’image permet de fournir une bonne résolution d’image et des détails d’échantillonnage. En utilisant la méthode de fixation, des modes sans contact AFM pourraient être appliqués, ce qui peut être utile dans l’étude des propriétés mécaniques.
Cette méthodologie pourrait être un outil peu coûteux et utile pour la recherche médicale et microbiologique axée sur l’analyse des dommages cellulaires bactériens.
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Aperçu
Cette étude utilise la microscopie à force atomique (AFM) pour une caractérisation bactérienne détaillée, en se concentrant sur la taille bactérienne, la forme, les biofilms de culture et les effets bactéricides des nanoparticules. Le protocole met l'accent sur une préparation minutieuse des échantillons et des techniques d'imagerie spécifiques pour observer les changements morphologiques dans les cellules bactériennes.
Composants clés de l'étude
Domaine de recherche
- Microbiologie
- Caractérisation bactérienne
- Recherche sur les nanoparticules
Contexte
- La microscopie à force atomique est un outil important pour observer la morphologie bactérienne.
- Comprendre la formation des biofilms bactériens et la réponse aux bactéricides aide dans la recherche médicale.
- La préparation des échantillons est essentielle pour une imagerie et une analyse précises.
Méthodes utilisées
- Microscopie à force atomique en mode de contact
- Cultures de Staphylococcus aureus et Pseudomonas hunanensis
- Essais d'exposition aux nanoparticules
Résultats principaux
- L'analyse AFM a révélé la taille et la distribution des cellules bactériennes, Staphylococcus aureus affichant une largeur moyenne de 1,25 micromètre.
- Des concentrations accrues de nanoparticules d'oxyde de magnésium ont conduit à des changements morphologiques significatifs dans les cellules bactériennes.
- L'étude démontre l'efficacité de l'AFM pour analyser l'intégrité structurelle bactérienne.
Conclusions
- Cette méthodologie souligne l'utilité de l'AFM en microbiologie, particulièrement dans l'évaluation des dommages bactériens.
- Les résultats contribuent à la compréhension plus large des réponses bactériennes aux traitements.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Contact mode atomic force microscopy (AFM) enables rapid, high-resolution morphological assessment of bacterial cells, supporting early-stage evaluation of antimicrobial interventions. This technique provides actionable 3D topography and cell damage data without the complexity or cost of electron microscopy, facilitating efficient screening of nanoparticle effects on bacterial integrity. AFM's operational simplicity and quantitative outputs position it as a valuable tool for mechanistic de-risking and target validation in anti-infective discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of bacterial cell morphology and structural changes following compound exposure.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying cell damage and morphological disruption at the nanoscale.
- Facilitates rapid hypothesis testing regarding antimicrobial mechanisms of action.
Screening & Assay Development
- Provides reproducible, quantitative topographical data for assay standardization and validation.
- Accelerates screening of nanoparticle or compound libraries for bactericidal effects.
- Delivers high-content imaging outputs suitable for downstream comparative analytics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns morphological readouts with translational biomarkers of bacterial cell integrity.
- Enables continuity from in vitro discovery to preclinical validation of antimicrobial candidates.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust evidence of cellular impact.
Pipeline & Workflow Integration
AFM contact mode integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling early, quantitative assessment of bacterial cell damage and morphology in response to candidate interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven evaluation of antimicrobial mechanisms and cellular targets.
- Screening: Delivers standardized, reproducible imaging data for compound triage and prioritization.
- Analytics: Provides quantitative measurements of cell size, surface integrity, and morphological disruption.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with preclinical models by aligning morphological endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, cost-effective platform for repeated use across diverse bacterial strains and compound classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in antimicrobial efficacy and mechanism-of-action studies.
- Operational Value: Reduces time and cost compared to electron microscopy while maintaining high-resolution outputs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing robust, quantitative evidence of cellular impact.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antimicrobial candidates based on direct morphological evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation and sample preparation to ensure data quality.
- Needs access to AFM instrumentation with contact mode capability and appropriate probes.
- Demands standardized protocols for sample fixing and imaging to ensure reproducibility across teams.
- Adaptable to various bacterial strains and nanoparticle types with protocol optimization.
- Sample aging and contamination must be minimized to preserve morphological integrity for analysis.
