Name: Quantification en temps réel des effets du TnpB associé à la famille IS200/IS605 sur l’activité des transposons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 4 s
Description: Découvrez l'imagerie en temps réel pour quantifier l'activité transposon par TnpB dans Escherichia coli. Cette méthode simple et peu coûteuse permet d'analyser la dynamique mutationnelle cellulaire vivante.

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Le soutien financier pour cette recherche a été fourni par des fonds de démarrage de l’Université de Californie.

1. Préparation de cultures bactériennes
<ol><li>Cultiver la souche MG1655 d’E. coli avec des constructions de transposons plasmidiques (décrites précédemment dans Kim et coll.8) pendant une nuit dans LB avec les antibiotiques appropriés (25 μg/mL de kanamycine, voir le tableau des matériaux) à 37 °C. REMARQUE : Les séquences des constructions utilisées et les séquences associées sont disponibles sous les numéros d’acquisition GenBank20 OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 et OP717085.</li>
	<li>Pour obtenir une croissance exponentielle à l’état d’équilibre, diluer les cultures ≥100 fois dans le milieu M63 (100 mM KH2 PO 4, 1 mM MgSO 4, 1,8 μM FeSO 4, 15 mM [NH 4]2SO 4, 0,5 μg/mL de thiamine [vitamine B1]) complétées par une source de carbone (0,5 % p/v de glucose ici) et des antibiotiques appropriés (voir Tableau des matériaux).</li>
	<li>Cultiver des cultures à 37 °C jusqu’à ce que la densité optique à 600 nm (OD600) atteigne ~0,2. Les cultures sont prêtes à l’emploi.</li>
</ol>2. Préparation des diapositives
<ol><li>Préparez une lame en faisant bouillir du M63 avec 0,5 % p/v de glucose et 1,5 % p/v d’agarose au micro-ondes pour faire fondre l’agarose et s’assurer qu’elle est complètement fondue et bien mélangée.</li>
	<li>Laisser refroidir le mélange à ~55 °C avant d’ajouter des antibiotiques et des inducteurs (25 μg/mL de kanamycine et 10 ng/μL d’anhydrotétracycline [aTc], voir le tableau des matières).</li>
	<li>Placez une lame de microscope sur l’établi. Empilez deux autres diapositives perpendiculaires à la première et placez-en une autre sur le dessus, parallèlement à la glissière inférieure. Assurez-vous qu’il y a un espace égal à une épaisseur de lame entre les diapositives inférieure et supérieure. Pipeter ~1 mL du mélange d’agarose M63 dans cet espace entre les lames lentement pour créer un petit carré de gel.</li>
	<li>Une fois que le gel s’est solidifié (~10-15 min), faites glisser la lame supérieure pour l’enlever. Coupez le tampon d’agarose avec une lame de rasoir ou un couteau. Ensuite, pipeter 2,5 μL de la culture (étape 1.3) et mettre la lamelle de couverture sur le dessus.</li>
	<li>Scellez l’espace entre la glissière et la lamelle de couverture avec de l’époxy (voir le tableau des matériaux). Laisser sécher l’époxy et déposer les cellules sur le tampon d’agarose pendant au moins 1 h à 37 °C.</li>
</ol>3. Microscopie à fluorescence timelapse
<ol><li>Placer l’échantillon préparé (étape 1.3) sur un microscope à fluorescence (voir le tableau des matériaux) dans un environnement chauffé et maintenu à 37 °C.<ol><li>Réglez les temps d’exposition appropriés pour l’appareil photo utilisé pour l’acquisition d’images. Ajustez l’intensité de l’éclairage pour minimiser le photoblanchiment. REMARQUE : Un temps d’exposition de 2 s pour chaque longueur d’onde a été utilisé pour la présente étude.</li>
		<li>Pour chaque longueur d’onde, trouvez un champ de vision (FOV) contenant une fluorescence minimale. Acquérir des images à utiliser pendant l’analyse pour la soustraction d’arrière-plan.</li>
	</ol></li>
	<li>Configurez un protocole pour acquérir des images dans une grille à différentes longueurs d’onde et à intervalles de temps réguliers.<ol><li>Encodez la photographie timelapse dans le protocole. Réglez la fréquence d’acquisition sur l’intervalle de temps souhaité (20 min ici) et la durée totale du timelapse sur la durée souhaitée (24 h).</li>
		<li>Coder les longueurs d’onde appropriées dans le protocole (selon la construction utilisée). NOTE: Le pic d’excitation mCherry est à 587 nm et le pic d’émission à 610 nm21; mVénus est à 515 nm et 527 nm12, tandis que mCerulean3 est à 433 nm et 475 nm11.</li>
		<li>Définissez la taille de la grille à capturer entre le nombre souhaité de FOV. REMARQUE: Les données représentatives présentées ici utilisaient des FOV de 8 x 8.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Analyse d’images
<ol><li>Effectuez une soustraction d’arrière-plan sur chaque couche de couleur en utilisant les images d’arrière-plan respectives acquises à l’étape 3.1.2. Pour toutes les étapes d’analyse, nous utilisons des modules standard dans la plate-forme open-source Fiji22 (voir Tableau des matériaux).</li>
	<li>Approximez la population totale à chaque moment en seuillant le canal céruléen et en divisant la zone seuil par la surface cellulaire moyenne.</li>
	<li>Pour compter les événements d’excision uniques, prenez la dérivée temporelle du canal mCerulean3. Pour ce faire, soustrayez des images successives dans le canal mCerulean3. Les événements d’excision seront détectés dans la dérivée temporelle comme un éclair lumineux de fluorescence.<ol><li>Seuil de la pile d’événements d’excision pour éliminer la fluorescence indésirable. Notez que ce processus entraînera le seuil d’une partie des excisions elles-mêmes. Pour résoudre ce problème, dilatez les images pour restaurer les excisions à leur taille d’origine. REMARQUE : Des analyses utilisant des techniques similaires de seuillage et d’analyse d’images peuvent également être effectuées sur les autres canaux de fluorescence (p. ex., corréler les événements d’excision avec les niveaux de transsase TnpA [fluorescence jaune de Vénus] et TnpB [fluorescence rouge mCherry].</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Cowley, M., Oakey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+elements+re-wire+and+fine-tune+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome.</a> PLoS Genetics. 9 (1), 1003234(2013).</li>
<li>Schneider, D., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+insertion+sequence+elements+during+experimental+evolution+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria.</a> Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).</li>
<li>Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+elements+as+mutator+genes+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transposable elements as mutator genes in evolution.</a> Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).</li>
<li>Coufal, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+retrotransposition+in+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">L1 retrotransposition in human neural progenitor cells.</a> Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).</li>
<li>Kano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+retrotransposition+occurs+mainly+in+embryogenesis+and+creates+somatic+mosaicism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism.</a> Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).</li>
<li>Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINE+dancing+in+the+human+genome%3A+transposable+elements+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease.</a> Genome Medicine. 1 (10), 97(2009).</li>
<li>Goodier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposition+in+tumors+and+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Retrotransposition in tumors and brains.</a> Mobile DNA. 5, 11(2014).</li>
<li>Kim, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+transposable+element+activity+in+individual+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Real-time transposable element activity in individual live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).</li>
<li>Lutz, R., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+and+tight+regulation+of+transcriptional+units+in+Escherichia+coli+via+the+LacR%2FO%2C+the+TetR%2FO+and+AraC%2FI1-I2+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements.</a> Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).</li>
<li>Calos, M. P., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+sequence+change+resulting+from+the+IQ1+mutation%2C+which+greatly+increases+promoter+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics+MGG%22%5BJournal%5D)">The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength.</a> Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).</li>
<li>Markwardt, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cerulean+fluorescent+protein+with+enhanced+brightness+and+reduced+reversible+photoswitching%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching.</a> PLoS One. 6 (3), 17896(2011).</li>
<li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).</li>
<li>Kersulyte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+element+ISHp608+of+Helicobacter+pylori%3A+nonrandom+geographic+distribution%2C+functional+organization%2C+and+insertion+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity.</a> Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).</li>
<li>Shmakov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+evolution+of+class+2+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).</li>
<li>Bao, W., Jurka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologues+of+bacterial+TnpB_IS605+are+widespread+in+diverse+eukaryotic+transposable+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements.</a> Mobile DNA. 4 (1), 12(2013).</li>
<li>Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+insertion+sequences%3A+their+genomic+impact+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).</li>
<li>Altae-Tran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widespread+IS200%2FIS605+transposon+family+encodes+diverse+programmable+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases.</a> Science. 374 (6563), 57-65 (2021).</li>
<li>Karvelis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-associated+TnpB+is+a+programmable+RNA-guided+DNA+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease.</a> Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).</li>
<li>Kaur, D., Kuhlman, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IS200%2FIS605+family-associated+TnpB+increases+transposon+activity+and+retention%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Benson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenBank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">GenBank.</a> Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Ton-Hoang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Stranded+DNA+transposition+is+coupled+to+host+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication.</a> Cell. 142 (3), 398-408 (2010).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

La méthode unique présentée ici pour l’imagerie en temps réel de l’activité des éléments transposables dans les cellules vivantes est un test sensible qui peut détecter directement la transposition dans les cellules vivantes et en temps réel et corréler cette activité avec l’expression de protéines accessoires. Bien que le débit soit inférieur à ce qui peut être accompli par des méthodes en vrac, cette méthode permet d’obtenir des mesures détaillées de l’activité TE et de l’expression des protéines dans les cellules viva...

Les éléments transposables (ET) sont des éléments génétiques qui se mobilisent au sein de leur génome hôte par excision ou catalysent la copie suivie d’une réintégration génomique. Les ET existent dans tous les domaines de la vie, et la transposition restructure le génome de l’hôte, mutant les régions codantes et de contrôle1. Cela génère des mutations et une diversité qui jouent un rôle important dans l’évolution2,3, le développement 4,5, et plusieurs maladies humaines6, dont le cancer7.
En utilisant de nouvelles constructions génétiques qui couplent des aspects de l’activité de transposition à des rapporteurs fluorescents, nos travaux antérieurs ont décrit le développement d’un système expérimental basé sur la bactérie TE IS608, un représentant de la famille répandue IS200/IS605 des TE, qui permet la visualisation en temps réel de la transposition dans les cellules vivantes individuelles8 (Figure 1). Le système TE est illustré à la figure 1A. Le TE comprend la séquence codante de la transposase, tnpA, flanquée de répétitions palindromiques imparfaites (IP) à l’extrémité gauche (LE) et à l’extrémité droite (RE), qui sont les sites de reconnaissance et d’excision de TnpA. Le tnpA est exprimé à l’aide du promoteur PLTetO1, qui est réprimé par le répresseur du têt et est inductible par l’anhydrotétracycline (aTc)9. Le TE divise les séquences -10 et -35 d’un promoteur constitutif PlacIQ1 10 pour le rapporteur bleu mCerulean311. Comme le montre la figure 1C, lorsque la production de tnpA est induite, le TE peut être excisé, conduisant à une reconstitution du promoteur. La cellule produite exprime mCerulean3 et devient bleue. L’extrémité N de TnpA est fusionnée avec le rapporteur jaune Vénus12, permettant de mesurer les niveaux de TnpA par fluorescence jaune.
IS608 et d’autres membres de la famille de transposons IS200/IS605 codent également généralement pour un deuxième gène de la fonction jusqu’ici inconnue, le tnpB13. Les protéines TnpB sont une famille de nucléases extrêmement abondantes mais imparfaitement caractérisées codées par plusieurs TEs14,15 bactériennes et archées, qui sont souvent constituées uniquement de tnpB16. De plus, des études récentes ont renouvelé l’intérêt pour le TnpB en constatant que le TnpB fonctionne comme une endonucléase programmable guidée par ARN de type CRISPR / Cas-like qui produira des cassures d’ADNds ou d’ADNss dans diverses conditions17,18. Cependant, on ne sait toujours pas quel rôle le TnpB peut jouer dans la régulation de la transposition. Pour effectuer une visualisation en temps réel des effets de TnpB sur la transposition IS608, une version du transposon, incluant la région codante de TnpB avec une fusion N-terminale à la protéine fluorescente rouge mCherry, a été créée.
En complément d’études plus détaillées au niveau du vrac réalisées par le laboratoire Kuhlman19, il est montré ici comment l’imagerie en temps réel de l’activité des transposons peut révéler quantitativement l’impact de TnpB ou de toute autre protéine accessoire sur la dynamique de transposition. En fusionnant TnpB en mCherry, les événements de transposition individuels sont identifiés par fluorescence bleue et corrélés avec les niveaux d’expression de TnpA (fluorescence jaune) et TnpB (fluorescence rouge).

<table><tbody><tr><td>2 tonnes d’époxy transparent</td><td>Devcon</td><td>31345</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5066</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AX1385-1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate d’anhydrotétracycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td></td></tr><tr><td>Laser à argon</td><td>Melles Griot</td><td>35-IMA-840-015</td><td></td></tr><tr><td>Bleu Filtre Cube</td><td>Chroma</td><td>Ex : Z457/10X, Em : ET485/30M</td><td></td></tr><tr><td>D(+)Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E Microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf epTIPS abandonné Boîtes et plateaux de recharge, volume : 0,1 à 10 & micro ; L, Longueur : 3,4 cm, 1,33 po, PP (polypropylène)</td><td>Eppendorf North America Biotools</td><td>22491504</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf epTIPS Boîtes et plateaux de recharge, Volume : 50 à 1000 & micro ; L, Longueur : 7,1 cm, 2,79 po, PP (polypropylène)</td><td>Eppendorf North America Biotools</td><td>22491555</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate ferreux Acs 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>706834</td><td></td></tr><tr><td>Fidji Fidji</td><td></td><td></td><td>(imagej.net)</td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&nbsp ;LB Bouillon, Miller (granulé)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9723-2&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Glissière de protection en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de kanamycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1355006</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium Cert Ac</td><td>Fisher Scientific</td><td>XXM63SP3KG</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Heater</td><td>World Precision Instruments</td><td>96810-1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Fisher Scientific</td><td>17001H</td><td></td></tr><tr><td>ProScan III Stage</td><td>Prior</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rouge Filtre Cube Chroma</td><td>Ex</td><td> : ET560/40X, Em : ET645/75M</td><td></td></tr><tr><td>Sapphire 561 LP Laser</td><td>Coherent 1170412</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide, Microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>125535B</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de thiamine</td><td>Sigma-Aldrich (SIAL)</td><td>T1270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ti-LU4 Laser Launch</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jaune Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>Ex : Z514/10X, Em : ET535/30M</td><td></td></tr></tbody></table>

quantification en temps réel des effets du tnpb associé à la famille is200/is605 sur l’activité des transposons

Real-Time Quantification of the Effects of IS200/IS605 Family-Associated TnpB on Transposon Activity

Ici, un protocole est décrit pour effectuer une imagerie en direct et en temps réel de l’activité des éléments transposables dans les cellules bactériennes vivantes à l’aide d’une suite de rapporteurs fluorescents couplés à la transposition. En particulier, il démontre comment l’imagerie en temps réel peut être utilisée pour évaluer les effets de la protéine accessoire TnpB sur l’activité de l’élément transposable IS608, membre de la famille des éléments transposables IS200/IS605. La famille IS200/IS605 d’éléments transposables sont des éléments mobiles abondants liés à l’un des gènes les plus innombrables trouvés dans la nature, tnpB. Les homologies de séquence suggèrent que la protéine TnpB pourrait être un précurseur évolutif des systèmes CRISPR/Cas9. De plus, le TnpB a suscité un regain d’intérêt, ayant été montré comme une endonucléase d’ADN guidée par l’ARN de type Cas. Les effets de TnpB sur les taux de transposition de l’IS608 sont quantifiés, et il est démontré que l’expression de TnpB de l’IS608 entraîne une augmentation ~5x de l’activité du transposon par rapport aux cellules dépourvues d’expression de TnpB.

Cette méthode de visualisation de l’activité des transposons dans les cellules vivantes par microscopie à fluorescence, tout en ayant un débit inférieur à celui des mesures de fluorescence en vrac, permet une visualisation directe de l’activité des transposons dans les cellules vivantes individuelles. Les événements d’excision de transposons entraînent la reconstitution du promoteur de mCerulean3 (Figure 1), permettant l’identification des cellules subissant une activité de transposon par fluorescence bleu vif (<strong c...

Un protocole est décrit pour effectuer une imagerie en temps réel en direct afin de quantifier comment la protéine accessoire TnpB affecte la dynamique de transposition dans les cellules vivantes individuelles d’Escherichia coli .

Quantification en temps réel des effets du TnpB associé à la famille IS200/IS605 sur l’activité des transposons

Here, a protocol is outlined to perform live, real-time imaging of transposable element activity in live bacterial cells using a suite of fluorescent ...

Ce protocole nous permet de quantifier les statistiques d’excision sur une base de cellule unique, au lieu d’examiner le comportement en vrac. À ce niveau, nous pouvons suivre le comportement des cellules individuelles au fil du temps, y compris leurs niveaux de TnpA et de TnpB pour les cellules qui s’excagent par rapport aux cellules qui ne le font pas, ce qui peut nous permettre, par exemple, de mesurer les effets des événements mutationnels identifiés sur le taux de croissance. Cette méthode est un moyen simple et peu coûteux de mesurer la dynamique mutationnelle des cellules vivantes.L’approche générale s’applique à tout système nécessitant une imagerie fluorescente de cellules vivantes. Préparez une lame en faisant bouillir M63 avec 0,5% de glucose et 1,5% d’agarose au micro-ondes pour faire fondre l’agarose. Assurez-vous que le milieu est complètement fondu et bien mélangé.Laissez le mélange refroidir à 55 degrés Celsius avant d’ajouter des antibiotiques et des inducteurs. Placez une lame de microscope sur l’établi. Empilez une lame perpendiculairement à la première.Assurez-vous qu’il y a un espace égal à une épaisseur de diapositive entre la lame inférieure et supérieure. Pipeter un millilitre du mélange d’agarose M63 dans l’espace entre la lame lentement pour créer un petit carré de gel. Une fois que le gel s’est solidifié, faites glisser la lame supérieure pour l’enlever.Coupez le tampon d’agarose avec une lame de rasoir ou un couteau. Ensuite, pipeter 2,5 microlitres de la culture bactérienne et mettre le couvercle sur le dessus. Scellez l’espace entre la glissière et le couvercle avec de l’époxy.Laissez l’époxy sécher et les cellules se déposer sur le tampon d’agarose pendant une heure à 37 degrés Celsius. Placez l’échantillon préparé sur un microscope à fluorescence dans un environnement chauffé et maintenu à 37 degrés Celsius. Pour chaque longueur d’onde, trouvez le champ de vision contenant une fluorescence minimale.Configurez un protocole pour acquérir des images dans une grille à différentes longueurs d’onde et à intervalles de temps réguliers. Les événements d’excision de transposons entraînent la reconstitution du promoteur de mCerulean3, permettant l’identification des cellules subissant une activité de transposon par fluorescence bleu vif. TnpB augmente le taux d’excision des transposons.Les cellules exprimant la protéine accessoire TnpB présentent des niveaux quatre à cinq fois plus élevés d’activité des transposons que les cellules TnpB négatives. Dans les cellules TnpB positives, les cellules subissant des événements d’excision de transposons ont des niveaux d’expression plus élevés de tnpB de cerise que la population générale. De plus, pour les cellules subissant des événements d’excision, les cellules TnpB-positives n’expriment que des niveaux légèrement plus élevés de TnpA-transposase veineuse que les cellules TnpB négatives, ce qui est supérieur à la fluorescence jaune de la population générale.L’endroit le plus probable pour lutter est dans la préparation de la culture cellulaire pour l’expérience. Vous devez vous assurer que les cellules sont cultivées à la phase exponentielle et que la lame est inoculée avec un nombre approprié de cellules. N’oubliez pas de faire attention aux bulles lorsque vous scellez la lame afin que le gel d’agarose ne sèche pas.

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Source : Kazi, M. I., et. al., Génération de banques d’insertion de transposons chez des bactéries à Gram négatif pour le séquençage à haut débit. J . Vis. Exp. (2020)Cette vidéo démontre la sélection, la quantification et la préservation de bactéries réceptrices à Gram négatif portant des insertions de transposons en fonction de la résistance à la kanamycine.

Isolement de bactéries à Gram négatif avec des insertions de transposons génomiques

Ici, nous décrivons un protocole en utilisant la mini-himar1 marin mutagenèse de transposon médiation pour générer une bibliothèque de mutants d'insertion à haute densité à l'écran, isoler et d'identifier de nouveaux régulateurs d'alginate dans le prototype Pseudomonas aeruginosa souche PAO1.

Identification de nouveaux gènes associés à la production d&#39;alginate dans<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Utilisation de Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagenèse Mariner Transposon médiation

Enterobacter sp. UEE grandit dans un milieu de sels glucose minimes. Les auxotrophes sont générées par le transformant avec un transposome qui se insère de manière aléatoire dans le génome de l'hôte. Les mutants sont trouvés par des répliques de milieu complexe à un milieu minimal. Gènes interrompus sont identifiés par le sauvetage des gènes et le séquençage.

Génération de Enterobacter Sp. UEE auxotrophes utilisant mutagénèse par transposon

Nous décrivons ici le flux de travail pour l’utilisation du système TetON afin d’obtenir une expression génique spécifique au tissu dans la nageoire caudale du poisson-zèbre adulte en régénération.

Utilisation du système de Teton pour étudier les mécanismes moléculaires de la régénération du poisson zèbre

Ici, la puissance d’une insertion aléatoire d’un élément d’ADN non codant, induite par le transposon a été utilisée pour résoudre sa position chromosomique optimale.

Détermination de l’emplacement chromosomique optimale pour un élément d’ADN chez Escherichia coli en utilisant une nouvelle approche induite par le Transposon

Présenté ici est une méthode simple pour créer une bibliothèque d’insertion haute densité transposon dans Escherichia coli ou Shigella flexneri utilisant la conjugaison bactérienne. Ce protocole permet la création d’une collection de centaines de milliers de mutants uniques chez les bactéries par l’insertion de génomique au hasard d’un transposon.

Création d’un Dense Transposon Insertion bibliothèque à l’aide de la conjugaison bactérienne dans les entérobactéries souches telles que Escherichia Coli et Shigella flexneri

Nous décrivons ici une technique qui associe une mutagenèse par transposon séquençage haut-débit pour identifier et quantifier des mutants de leptospires transposon dans les tissus après une contestation des hamsters. Ce protocole peut être utilisé à des mutants de l’écran de survie et de la diffusion chez les animaux et peut également être appliqué à des études in vitro .

Haut débit séquençage parallèle à la mesure de remise en forme de Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants durant Golden syrien Hamster Infection

Ce protocole décrit une méthode pour réaliser l’intégration stable d’un gène d’intérêt dans le génome humain par le système transcriptionnellement réglementé de la Belle au bois dormant . Préparation de l’intégration des vecteurs LENTIVIRAUX défectueux, la transduction in vitro des cellules humaines et l’analyse moléculaire sur les cellules transduits sont signalés.

Une méthode de Transposition efficace In Vitro par un système de beauté dormir transcriptionnellement réglementé empaquetée dans un vecteur Lentiviral défectueux de l’intégration

Nous décrivons une méthode pour générer des bibliothèques mutantes transposons saturantes chez les bactéries gramnégatives et la préparation subséquente des bibliothèques d’amiplicons d’ADN pour le séquençage à haut débit. À titre d’exemple, nous nous concentrons sur l’agent pathogène ESKAPE, Acinetobacter baumannii, mais ce protocole est accessible à un large éventail d’organismes gramnégatifs.

Génération de bibliothèques d’insertion transposon dans les bactéries gramnégatives pour le séquençage à haut débit

Il s’agit d’une méthode adaptée pour identifier les facteurs de colonisation des insectes candidats dans un symbiote bénéfique Burkholderia. L’hôte du coléoptère est infecté par une bibliothèque mutante aléatoire générée par mutagénèse par transposon, et la complexité de la bibliothèque après la colonisation est comparée à un témoin cultivé in vitro.

Le séquençage par insertion de transposons comme outil pour élucider les facteurs de colonisation bactérienne dans un symbiote Burkholderia gladioli de coléoptères Lagria villosa

Découvrez l'imagerie en temps réel pour quantifier l'activité transposon par TnpB dans Escherichia coli. Cette méthode simple et peu coûteuse permet d'analyser la dynamique mutationnelle cellulaire vivante.

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