In vivo Imagerie calcique d’ensembles neuronaux dans des réseaux de neurones sensoriels primaires dans des ganglions radiculaires dorsaux intacts

Le nombre de neurones surveillés à l’aide de cette méthode permet la collecte de données de réseau de neurones qui serait impossible avec des méthodes plus anciennes ou autres. Le principal avantage de cette technique est la capacité de surveiller près de 2 000 neurones sensoriels primaires à la fois, répondant directement aux stimuli appliqués à la patte postérieure. Cette procédure est particulièrement bien adaptée à l’étude des interventions thérapeutiques pour l’allodynie périphérique et l’hypersensibilité à la douleur.

Cette méthode peut être adaptée à l’étude des ganglions du trijumeau ou géniculés ou utilisée avec des capteurs génétiquement codés pour les molécules de signalisation de tension ou cellulaire, telles que l’AMP cyclique. Il faut de la pratique pour effectuer cette chirurgie. Vous pouvez pratiquer jusqu’à six ganglions de la racine dorsale sur un seul animal.

La démonstration de la procédure sera moi-même, avec l’aide de John Shannonhouse et de M. Ruben Gomez. Pour commencer, placez la souris sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle à 37 degrés Celsius. Localisez l’élargissement lombaire en palpant l’os pelvien de la souris.

Ensuite, rasez le dos de la souris au-dessus de la zone d’élargissement lombaire. À l’aide de ciseaux, faites une incision rectangulaire à trois côtés au-dessus de l’élargissement lombaire et pliez la peau avec une pince. Utilisez les ciseaux à dissection à ressort de 13 millimètres pour faire des incisions de trois à quatre millimètres sur le côté droit de la colonne vertébrale.

Utilisez des ciseaux pour couper la peau et les muscles sur les côtés afin d’exposer la colonne vertébrale. Ensuite, à l’aide de ciseaux de huit millimètres, coupez le muscle et le tissu conjonctif pour nettoyer le processus transversal du côté droit L5 DRG. Essayez de minimiser les saignements en utilisant du coton ou du Gelfoam pour absorber le sang.

Coupez le processus transversal L5 du côté droit à l’aide de rongeurs Friedman-Pearson ou de pinces fines fortes, en prenant soin de ne pas toucher le DRG. Ensuite, déplacez la souris et le coussin chauffant sur la scène personnalisée. Utilisez du ruban adhésif pour fixer l’animal et le coussin chauffant en place.

Placez le nez de l’animal dans le cône nasal pour une anesthésie continue à l’isoflurane. Fixez la patte postérieure droite en dehors de la scène pour faciliter l’application des stimuli. Fixez la colonne vertébrale en place avec les pinces de scène sur la peau sur les vertèbres ou l’os pelvien juste rostral et caudale au L5 DRG.

Ajustez les pinces et la platine pour rendre la surface du DRG aussi plane que possible. Ensuite, placez la platine sous le microscope de sorte que l’objectif soit directement huit millimètres au-dessus du DRG lorsqu’il est abaissé. Insérez le thermomètre rectal.

Connectez les lignes électriques au coussin chauffant et au thermomètre rectal. Connectez le cône de nez aux conduites de gaz isoflurane. Utilisez un microscope confocal vertical avec un objectif DIC 10x 0,4 et le logiciel associé pour l’imagerie.

Utilisez les paramètres du filtre FITC vert d’excitation à 495 nanomètres, d’émission à 519 nanomètres et de longueur d’onde de détection comprise entre 500 et 580 nanomètres. Au microscope, retrouvez la surface du DRG. Ajustez les pinces sur la scène afin que la surface DRG soit aussi plane que possible et que la surface maximale soit visualisée dans le plan focal.

Surveillez l’animal tout au long de la procédure pour maintenir l’anesthésie à l’isoflurane sans surdosage. Pour charger le protocole de balayage rapide du microscope, utilisez les paramètres typiques de taille voxel 2.496 par 2.496 par 16 microns, 512 x 512 pixels, 10 Z-stack de tranche optique, une unité Airy pour 32 micromètres, 1% de puissance laser de 488 nanomètres et cinq milliwatts, temps de pixel 1,52 microseconde, temps de ligne 0,91 millisecondes, temps d’image 465 millisecondes, vitesse de balayage LSM de huit, balayage bidirectionnel, gain du détecteur PMT 650 volts et gain numérique d’un. Faites une courte analyse en huit cycles du DRG en cliquant sur Démarrer l’expérience sous l’onglet Acquisition.

Créez un film en effectuant une projection orthogonale des numérisations à un balayage par image au fil du temps. Vérifiez manuellement la clarté de l’image et les artefacts d’imagerie, tels que les ondes de luminosité traversant le DRG. Ajustez la position de la pince et l’épaisseur de la section optique, puis répétez cette étape jusqu’à ce qu’un film clair et de haute qualité soit obtenu.

Ensuite, chargez le protocole de balayage haute résolution du microscope en utilisant les paramètres typiques de taille de voxel 1,248 par 1,248 par 14 microns, 1024 par 1024 pixels, six tranches optiques Z-stack, unité 1,2 Airy ou 39 micromètres, 5% de puissance laser de 488 nanomètres et 25 milliwatts, temps de pixel 2,06 microsecondes, temps de ligne 4,95 millisecondes, temps d’image 5,06 secondes, vitesse de numérisation LSM de six, balayage bidirectionnel, gain du détecteur PMT à 650 volts et gain numérique d’un. Cliquez sur le bouton Démarrer l’expérience sous l’onglet Acquisition pour créer une image haute résolution du DRG. Chargez le protocole de balayage rapide du microscope et enregistrez l’activité spontanée dans le DRG pendant 80 cycles.

Générez un film de projection orthogonal et vérifiez que l’image est de qualité suffisante pour l’analyse. Pour appliquer des stimuli, réglez le microscope pour effectuer 15 à 20 scans. Attendez que les analyses soient terminées de une à cinq pour produire la ligne de base.

Appliquez le stimulus pendant les scans six à 10. Attendez au moins cinq minutes après chaque stimulus avant d’appliquer le suivant pour éviter la désensibilisation. Pour une presse mécanique, tenez la pince de l’algomètre avec la patte entre les palettes sans toucher la patte.

Pincez la patte immédiatement après la fin de l’analyse cinq et arrêtez-la immédiatement après l’analyse 10. Surveillez la force de la presse à l’aide d’un algomètre et assurez-vous qu’elle ne dépasse pas 10 g au-dessus de la force souhaitée. Pour les stimuli thermiques, chauffez un bécher d’eau juste au-dessus de la température désirée.

Lorsque l’eau est à la bonne température, appliquez le stimulus immédiatement après le balayage cinq en immergeant la patte dans l’eau. Retirez le bécher immédiatement après le balayage 10. L’exposition chirurgicale L5 DRG suivie d’une microscopie confocale a permis d’imager jusqu’à 1 800 neurones à la fois à l’aide de souris Pirt-GCaMP3.

Des neurones sensoriels primaires ont été observés dans un ensemble au niveau de la population pour les transitoires spontanés de calcium en l’absence de stimuli et en réponse à des stimuli dans leur contexte physiologique normal. Des stimuli forts ou une chaleur nocive augmentaient les réponses au calcium. Par rapport au pressage avec 100 g, le pressage avec 300 g a augmenté le nombre de neurones produisant des transitoires de calcium et l’aire delta F par F0 sous la courbe.

La chaleur chaude dans une plage de température non nocive de 21 et 45 degrés Celsius a augmenté le nombre de neurones produisant des transitoires de calcium et la zone delta F par F0 sous la courbe. Les températures non nocives ont activé un plus petit nombre de neurones produisant des transitoires par rapport à un stimulus thermique nocif à 57 degrés Celsius. De plus, les neurones de plus petit et moyen diamètre produisaient spontanément du calcium transitoire et sous tous les stimuli, mais les neurones de plus grand diamètre ne produisaient que des transitoires de calcium en réponse au stimulus de pression de 300 g.

Le DRG doit être de niveau et d’épaisseur de tranche optique optimale. Il devrait être tel que vous puissiez détecter le nombre maximum de cellules et qu’il n’y ait pas d’ondulation dans le film. Cette technique a été utilisée pour analyser les modalités sensorielles au niveau de la population pour la somatosensation et le goût et pour étudier les neurones adjacents s’activant par paires ou en grappes synchronisées contribuant à la douleur chronique et neuropathique.