Système de détection de virus à ADN basé sur RPA-CRISPR/Cas12a-SPM et Deep Learning
10 mai 2024
Nous présentons un protocole qui combine l’amplification de la polymérase recombinase avec un système CRISPR/Cas12a pour la détection de traces de virus à ADN et construisons une microscopie portable pour smartphone avec une classification assistée par l’intelligence artificielle pour la détection des virus à ADN au point de service.
Notre protocole introduit un système de détection rapide et très sensible pour le virus de la grenouille 3. De manière significative, cette méthode permet la détection des virus à ADN au point de service, jouant un rôle crucial dans la prévention de l’apparition de maladies pandémiques. Le principal avantage de cette technique réside dans son intégration de la RPA avec le système CRISPR/Cas12a, complétée par un microscope portable basé sur un smartphone et une classification par IA.
Cette intégration améliore considérablement l’efficacité et la précision de la détection tout en réduisant les erreurs attribuées aux facteurs humains. Pour commencer, ajoutez les quatre enzymes RPA clés dans le tampon de réaction. Ajoutez ensuite les apprêts préconçus au mélange.
Mélangez soigneusement le mélange. Ajoutez un microlitre de l’ADN cible obtenu à partir du virus de la grenouille 3 à chaque réaction RPA, et vortex pour bien mélanger. Ensuite, pipetez sept microlitres de chlorure de magnésium de 100 millimolaires pour initier la réaction.
Incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour terminer le dosage. Préparez la protéine CAS12a de la bactérie Lachnospiraceae avec l’ARN CRISPR pour former des complexes fonctionnels. Mélangez la protéine bactérienne et 10 tampons de réaction CRISPR/Cas12a.
Ajoutez maintenant une sonde rapporteure d’ADN simple brin nanomolaire de 500 nanomolaires. Ajoutez un microlitre de produit de réaction RPA au mélange de réaction d’ARN CRISPR/Cas12a. Incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Mesurez les signaux fluorescents à l’aide d’un lecteur de microplaques. Pour la détection avec un microscope sur smartphone, commencez par pipeter le mélange réactionnel préparé sur une lame de verre retraitée. Ensuite, couvrez-le d’une lamelle avant l’incubation.
Placez la lame sur la platine du microscope du smartphone et ajustez la distance focale et la clarté. Capturez une image pour mesurer les signaux fluorescents. Utilisez ImageJ pour mesurer la valeur de gris moyenne de chaque image et l’écart-type de la valeur de gris moyenne dans un groupe de concentration.
Adoptez le modèle d’apprentissage profond AlexNet 33 pour la classification. Utilisez maintenant Python pour remodeler les images d’entrée en 224 par 224 par trois canaux. Enfin, utilisez un réseau de base pré-entraîné avec un ensemble de données ImageNet pour extraire les caractéristiques de l’image.
La sixième paire d’amorces a fourni l’efficacité d’amplification maximale et a été sélectionnée. L’ARN-3 de CRISPR s’est avéré être le plus efficace pour le clivage collatéral. L’utilisation d’un système de détection développé avec des amorces RPA sélectionnées et de l’ARN CRISPR a entraîné des différences significatives entre le FV3 10 aM et le contrôle.
Le point le plus important à retenir est l’étape spécifique de détection CAS 12a. L’ARN CRISPR de la réaction peut être modifié ou reconçu pour cibler d’autres virus à ADN en fonction de la détection CAS 12a. La méthode proposée peut aider à l’évaluation préliminaire de la quantité du virus cible.
Sur cette base, d’autres méthodes comme la qPCR peuvent être utilisées pour obtenir une charge virale plus précise. Cette technique constitue une tentative préliminaire de détection portable des virus à ADN. En ce qui concerne le virus de la grenouille 3 utilisé dans ce protocole, une détection précoce peut entraîner des mesures de protection efficaces, réduisant ainsi les pertes dans l’industrie de l’élevage.
Aperçu
Cette étude présente un système de détection rapide et sensible du virus de la grenouille 3, en mettant l'accent sur l'intégration de l'amplification par polymérase recombinase (RPA) avec le système CRISPR/Cas12a afin de permettre la détection de virus à ADN au point d'intervention. Cette méthode innovante vise à améliorer la précision et l'efficacité de la détection, ce qui est crucial pour prévenir d'éventuelles épidémies pandémiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Biologie moléculaire
- Détection des agents pathogènes
- Diagnostic au point d’intervention
Contexte
- L'importance d'une détection rapide des virus pour prévenir les pandémies.
- L'intégration de méthodologies avancées telles que la RPA et la technologie CRISPR.
- Le rôle des systèmes portables dans les évaluations diagnostiques sur le terrain.
Méthodes utilisées
- Amplification par polymérase recombinase (RPA)
- Système CRISPR/Cas12a
- Microscopie basée sur smartphone avec classification assistée par intelligence artificielle
Résultats principaux
- Différenciation significative entre les échantillons de FV3 à 10 aM et les échantillons témoins.
- Amélioration de la précision de détection grâce à l'utilisation d'amorces spécifiques et d'ARN CRISPR.
- Potentiel d'adaptation de la méthode à d'autres virus à ADN par modification de l'ARN CRISPR.
Conclusions
- L'étude démontre une méthode de détection portable efficace pour les virus à ADN.
- Cette approche est pertinente pour des mesures de protection rapides dans l'industrie de l'élevage, illustrant son importance dans la recherche biologique et la santé publique.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Les systèmes rapides et portables de détection des virus à ADN sont essentiels pour une intervention précoce et un confinement efficace, tant en recherche qu’en milieu biopharmaceutique appliqué. L’intégration de la RPA-CRISPR/Cas12a avec la microscopie basée sur smartphone et l’apprentissage profond permet une détection sensible et spécifique à la séquence directement sur le terrain, réduisant ainsi la dépendance vis-à-vis des laboratoires centralisés. Cette approche favorise une prise de décision accélérée et une atténuation des risques tout au long des filières de découverte et de recherche translationnelle.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet une interrogation rapide des cibles d'ADN viral pour l'analyse mécanistique et la réduction des risques.
- Permet la validation fonctionnelle des réactifs de détection et des ARN guides du système CRISPR.
- Facilite le tri précoce des systèmes de détection candidats en vue de l'avancement du portefeuille.
Développement de criblages et de tests
- Offre une lecture normalisée et quantitative pour l'optimisation et la validation des tests.
- Permet des protocoles de détection reproductibles et évolutifs, adaptés au criblage à haut débit.
- Prend en charge une comparaison rigoureuse de l'efficacité des amorces et de l'ARN CRISPR pour l'amélioration des tests.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur les stratégies translationnelles de biomarqueurs en permettant la détection virale sur le terrain.
- Assure la continuité entre la découverte et la validation préclinique grâce à des résultats portables et quantitatifs.
- Réduit le risque biologique en permettant une détection et une intervention rapides dans des modèles pertinents.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce système fait le lien entre la découverte précoce, le développement de tests et la recherche translationnelle en offrant une plateforme de détection portable et quantitative, adaptable à de nombreux virus à ADN.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification des hypothèses et la validation des cibles grâce à une détection spécifique à la séquence.
- Écrantage : Fournit des signaux fluorescents reproductibles et quantitatifs pour la standardisation des tests.
- Analytique : Intègre une classification basée sur l'apprentissage profond pour une interprétation objective des résultats avec une forte confiance.
- Recherche translationnelle : Permet une détection rapide, prête à l'emploi sur le terrain, soutenant les études précliniques et les recherches sur les biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme modulaire adaptable à de nouvelles cibles virales par la conception de nouveaux ARN guides CRISPR.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la détection virale.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation, la reproductibilité et l'évolutivité des protocoles de détection.
- Valeur stratégique : Accélère les décisions d'aller/arrêt et réduit les risques biologiques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque et l'avancement rapide des technologies de détection.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Requiert une expertise en biologie moléculaire et en conception de tests CRISPR.
- Nécessite un accès à des dispositifs d'imagerie portables et à une infrastructure informatique pour l'analyse par intelligence artificielle.
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles de test et de l'interprétation des données.
- Adaptable à divers virus à ADN en modifiant les séquences d'ARN CRISPR.
- Dépend d'une validation préalable avant déploiement dans divers contextes sur le terrain.
Foire aux questions en biopharmacie
Chapters in this video
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Introduction
0:40
Combining Recombinase Polymerase Amplification (RPA) and CRISPR/Cas12a Systems for the Detection of DNA Viruses
1:20
CRISPR/Cas12a Detection With/Without Smartphone Microscopy (SPM)
2:23
Data Augmentation and Transfer Learning
2:58
Results: AI-Detection of DNA Virus Using RPA-CRISPR/Cas12a-SPM
3:26
Conclusion
