Name: Surveillance bioluminescente de la survie du greffon dans un modèle de transfert adoptif du diabète auto-immun chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Découvrez une méthode de transplantation et d'imagerie bioluminescente des cellules NIT-1 chez la souris NOD-SCID pour étudier les mécanismes de protection contre les attaques auto-immunes dans le diabète de type 1.

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Nous remercions le Dr Erica P. Cai et le Dr Yuki Ishikawa d’avoir développé la méthode décrite dans ce protocole (voir réf. 11). La recherche dans les laboratoires de S.K. et de P.Y. est financée par des subventions des National Institutes of Health (NIH) (R01DK120445, P30DK036836), de FRDJ, du Harvard Stem Cell Institute et de la Fondation Beatson. T.S. a été soutenu par une bourse postdoctorale de l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales (NIDDK) (T32 DK007260-45), et K.B. a été soutenu en partie par une bourse de la Fondation Mary K. Iacocca.

<ol><li>Katsarou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes mellitus.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17016(2017).</li>
<li>Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+pancreatic+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Clinical pancreatic islet transplantation.</a> Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).</li>
<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
<li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li>
<li>Vertex Announces Positive Day 90 Data for the First Patient in the Phase 1_2 Clinical Trial Dosed With VX-880, a Novel Investigational Stem Cell-Derived Therapy for the Treatment of Type 1 Diabetes. Businesswire. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes">https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes</a> (2021).</li>
<li>Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+journey+of+islet+cell+transplantation+and+future+development%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">The journey of islet cell transplantation and future development.</a> Islets. 10 (2), 80-94 (2018).</li>
<li>Pearson, J. A., Wong, F. S., Wen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+the+Non+Obese+Diabetic+%28NOD%29+mouse+model+in+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">The importance of the Non Obese Diabetic (NOD) mouse model in autoimmune diabetes.</a> Journal of Autoimmunity. 66, 76-88 (2016).</li>
<li>Hamaguchi, K., Gaskins, R. H., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIT-1%2C+a+pancreatic+%CE%B2-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD%2FLt+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">NIT-1, a pancreatic β-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40 (7), 842-849 (1991).</li>
<li>Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+diabetes+into+immunodeficient+NOD-scid%2Fscid+mice%3A+Relative+contribution+of+CD4%2B+and+CD8%2B+T-cells+from+diabetogenic+versus+prediabetic+NOD.NON-Thy1a+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice: Relative contribution of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetogenic versus prediabetic NOD.NON-Thy1a donors.</a> Diabetes. 42 (1), 44-55 (1993).</li>
<li>Cai, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+in+vivo+CRISPR+screen+identifies+RNLS+as+a+target+for+beta+cell+protection+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Genome-scale in vivo CRISPR screen identifies RNLS as a target for beta cell protection in type 1 diabetes.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 934-945 (2020).</li>
<li>Parent, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+deletion+of+human+leukocyte+antigens+protects+stem+cell-derived+islets+from+immune+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Selective deletion of human leukocyte antigens protects stem cell-derived islets from immune rejection.</a> Cell Reports. 36 (7), 109538(2021).</li>
<li>Brehm, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+acute+xenogeneic+graft-versus-host+disease%2C+but+retention+of+T-cell+function+following+engraftment+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+NSG+mice+deficient+in+MHC+class+I+and+II+expression%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Lack of acute xenogeneic graft-versus-host disease, but retention of T-cell function following engraftment of human peripheral blood mononuclear cells in NSG mice deficient in MHC class I and II expression.</a> FASEB Journal. 33 (3), 3137-3151 (2019).</li>
<li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+type+1+diabetes+immunopathology+using+eye-transplanted+islets+in+NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of type 1 diabetes immunopathology using eye-transplanted islets in NOD mice.</a> Diabetologia. 62 (7), 1237-1250 (2019).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.

Le DT1 est une maladie dévastatrice pour laquelle il n’existe actuellement aucun remède. La thérapie de remplacement des cellules bêta offre un traitement prometteur pour les patients atteints de cette maladie, mais l’obstacle critique à cette stratégie est le potentiel d’attaque auto-immune récurrente contre les cellules bêta transplantées. Le génie génétique des cellules SC-bêta pour réduire leur visibilité immunitaire ou leur susceptibilité est une solution potentielle à ce problème. Décrit ici est un protocole pour l...

Le diabète de type 1 (DT1) est causé par la destruction auto-immune des cellules bêta productrices d’insuline du pancréas. La perte de masse des cellules bêta entraîne une carence en insuline et une hyperglycémie. Les patients atteints de DT1 dépendent de multiples injections quotidiennes d’insuline exogène et connaissent des épisodes d’hyperglycémie et d’hypoglycémie sévères tout au long de leur vie. Les complications liées à ces épisodes comprennent la rétinopathie diabétique, la diminution de la fonction rénale et la neuropathie1.
Les injections d’insuline sont un traitement, mais pas un remède contre le DT1. Le remplacement de la masse cellulaire bêta perdue, cependant, a le potentiel d’inverser la maladie en permettant aux patients de produire leur propre insuline. Cependant, l’offre d’îlots donneurs cadavériques est limitée2. Les îlots dérivés de cellules souches (îlots SC) peuvent fournir un approvisionnement pratiquement illimité de cellules bêta pour la transplantation. Plusieurs groupes ont démontré que les cellules souches embryonnaires humaines (CSE) et les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) peuvent être différenciées pour générer des cellules fonctionnelles de type bêta 3,4,5. Des données prometteuses d’essais cliniques préliminaires indiquent que ces cellules conservent leur fonction après la greffe et peuvent permettre aux patients de devenir insulino-indépendants6. Une immunosuppression chronique est toutefois nécessaire, augmentant ainsi leur susceptibilité au cancer et à l’infection. De plus, les agents immunosuppresseurs peuvent être cytotoxiques pour les greffons à long terme7. Pour éliminer le besoin d’immunosuppression, les îlots SC peuvent être génétiquement modifiés pour les protéger de l’auto-immunité récurrente ainsi que de l’allo-immunité après la transplantation.
La recherche sur les cellules souches est très exigeante en termes de coûts et de main-d’œuvre. Les lignées cellulaires de souris et les modèles animaux sont des outils utiles pour l’identification initiale et la validation expérimentale de stratégies visant à protéger les cellules transplantées contre l’auto-immunité. La souris NOD développe un diabète auto-immun spontané avec de nombreuses similitudes avec le DT18 humain, et la lignée cellulaire d’insulinome NIT-1 partage un fond génétique avec cette souchede souris 9. Le diabète peut être transféré de manière adoptive à la souche de souris NOD-scid immunodéficiente apparentée par injection de splénocytes diabétiques de souris NOD afin de synchroniser temporellement l’apparition du diabète chez des souris expérimentales répliquées10. Ce modèle peut être utilisé pour identifier des cibles génétiques relativement rapidement et à peu de frais pour une validation ultérieure dans les îlots SC. Récemment, la méthode a été appliquée pour identifier et valider RNLS, une cible qui a été trouvée pour protéger les îlots humains primaires de l’auto-immunité in vivo et les îlots dérivés de l’iPSC du stress des cellules bêta in vitro11. Décrit ici est un protocole simple pour transplanter des cellules NIT-1 génétiquement modifiées et surveiller de manière non invasive leur survie dans un modèle de transfert adoptif du diabète auto-immun chez la souris.

<table><tbody><tr><td>0,05 % de trypsine, 0,53 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>293FT</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td>Isolat clonal à croissance rapide, hautement transfectable, dérivé de cellules rénales embryonnaires humaines transformées avec le grand antigène T SV40</td></tr><tr><td>Tampon de lyse ACK</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Coussinets de préparation à l’alcool, alcool isopropylique à 70 %</td><td>Amazon/Ever Ready First Aid</td><td>B08NWF31DX</td><td></td></tr><tr><td>BD 5ml Seringue Luer-Lok Tip</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0,45 mm x 16 mm) Sub-Q</td><td>BD</td><td>305115</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 mL TB Seringue Slip Tip</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin S HCl</td><td>Corning</td><td>&nbsp ; 30-100-RB</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à cellules premium SureStrain, 70 &micro ; m, stérile</td><td>Southern Labware</td><td>C4070</td><td>Ou utilisez une passoire stérile similaire avec des pores de 40-70um</td></tr><tr><td>Compteur de cellules automatisé CellDrop</td><td>Denovix</td><td>CellDrop BF-PAYG</td><td>Ou utilisez un dispositif de compteur de cellules similaire</td></tr><tr><td>Corning 100 mL Pénicilline-Streptomycine Solution, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes aspirantes jetables, polystyrène, stérile, Capacité=2 mL</td><td>VWR</td><td>414004-265</td><td>Ou utilisez une pipette aspirante similaire</td></tr><tr><td>D-Luciférin, sel de potassium, qualité biologie moléculaire, poudre, >99 %</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, haute teneur en glucose, pyruvate, sans glutamine</td><td>Gibco</td><td>10313039</td><td></td></tr><tr><td>Falcon BD tubes, 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>sérum fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Pince premium pour mouchoirs, 1 x 2 dents 5 in, Acier allemand</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-820-074</td><td></td></tr><tr><td>Bandelette de test d’urine de glucose</td><td>California Pet Pharmacy</td><td>u-tsg100</td><td>Ou utilisez une bandelette de test similaire pour les mesures de glucose dans l’urine/le sang</td></tr><tr><td>GlutaMAX&ndash ; 1 (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Lampe chauffante infrarouge</td><td>Cole Parmer</td><td>03057-00</td><td>Ou utilisez une lampe infrarouge similaire&nbsp ;</td></tr><tr><td>Seringue à insuline 0,5 mL, U-100 29 G 0,5 po</td><td>Becton Dickinson</td><td>309306</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Piramal Critical Care</td><td>6679401725</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum Système d’imagerie in vivo</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>Instrument pour la collecte non invasive d’images bioluminescentes de cellules transplantées Logiciel d’analyse d’images</td></tr><tr><td>vivantes</td><td>Perkin Elmer</td><td>128113</td><td>Logiciel de collecte et de quantification du signal bioluminescent</td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation seal-rite, 1,5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td>Ou utilisez des tubes de microcentrifugation stériles similaires</td></tr><tr><td>NIT-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2055</td><td>Lignée de cellules bêta pancréatiques dérivées de souris NOD/Lt</td></tr><tr><td>NOD. Cg-Prkdcscid/J</td><td>Le Laboratoire Jackson</td><td>001303</td> souris <td>homozygotes pour la mutation spontanée sévère de l’immunodéficience combinée Prkdcscid, communément appelé sur&nbsp ; scid, sont caractérisés par une absence de lymphocytes T et B fonctionnels, une lymphopénie, une hypogammaglobulinémie et un microenvironnement hématopoïétique normal.</td></tr><tr><td>NOD/ShiLtJ</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>001976</td><td>La souche de souris NOD/ShiLtJ (communément appelée NOD) est un modèle polygénique pour le diabète auto-immun de type 1</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010031</td><td>Sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénol</td></tr><tr><td>pCMV-VSV-G</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-luciferase-blast</td><td>Fabriqué en interne</td><td>Plasmide disponible sur demande</td><td>Voir le fichier supplémentaire 1</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene</td><td>12251</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylénine, linéaire, MW 25 000, degré de transfection (PEI 25K)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1014320</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>Dispositif de contention pour rongeurs, rond de type brome 1 dans</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-288-32A</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux pointus</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td>Ou utilisez d’autres ciseaux en acier inoxydable de qualité chirurgicale</td></tr><tr><td>Boîtes de culture traitées pour culture tissulaire</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS430167-20EA</td><td>Ou utilisez d’autres boîtes de Pétri stériles traitées pour culture cellulaire</td></tr><tr><td>Pince à épiler/Pince à pointe, fine précision à pointe moyenne</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-157</td><td></td></tr></tbody></table>

surveillance bioluminescente de la survie du greffon dans un modèle de transfert adoptif du diabète auto-immun chez la souris

Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice

Le diabète de type 1 est caractérisé par la destruction auto-immune des cellules bêta productrices d’insuline du pancréas. Un traitement prometteur pour cette maladie est la transplantation de cellules bêta dérivées de cellules souches. Des modifications génétiques, cependant, peuvent être nécessaires pour protéger les cellules transplantées de l’auto-immunité persistante. Les modèles murins diabétiques sont un outil utile pour l’évaluation préliminaire des stratégies visant à protéger les cellules transplantées contre les attaques auto-immunes. Décrit ici est une méthode mini-invasive pour la transplantation et l’imagerie des greffes cellulaires dans un modèle de transfert adoptif du diabète chez la souris. Dans ce protocole, les cellules de la lignée cellulaire bêta pancréatique murine NIT-1 exprimant le transgène luciférase luciférase luc2 sont transplantées par voie sous-cutanée chez des souris immunodéficientes non obèses diabétiques (NOD) immunodéficientes combinées sévères (SCID). Ces souris sont injectées simultanément par voie intraveineuse avec des splénocytes de souris NOD spontanément diabétiques pour transférer l’auto-immunité. Les greffons sont imagés à intervalles réguliers via une imagerie bioluminescente non invasive pour surveiller la survie cellulaire. La survie des cellules mutantes est comparée à celle des cellules témoins transplantées dans la même souris.

La figure 1 donne un aperçu du protocole. La survie de deux lignées cellulaires, comme un mutant et un témoin non ciblé, peut être comparée, ou la survie d’une lignée cellulaire peut être mesurée dans plusieurs groupes de souris, comme les souris traitées par un médicament par rapport aux témoins traités par véhicule. La figure 3A montre trois souris NOD-scid femelles âgées de 8 semaines transplantées avec un témoin non ciblé (à gauche) et une lignée cellulaire ...

Ce protocole décrit une méthode simple et peu invasive pour la transplantation et l’imagerie de cellules NIT-1 chez des souris immunodéficientes combinées diabétiques sévères non obèses (NOD) défiées avec des splénocytes purifiés à partir de souris NOD spontanément diabétiques.

Surveillance bioluminescente de la survie du greffon dans un modèle de transfert adoptif du diabète auto-immun chez la souris

Type 1 diabetes is characterized by the autoimmune destruction of the insulin-producing beta cells of the pancreas. A promising treatment for this disease ...

Ce protocole peut aider à comprendre les mécanismes de protection contre les attaques auto-immunes et à identifier des cibles thérapeutiques pour le remplacement des cellules bêta dans le diabète de type un. Le principal avantage de cette technique est le coût relativement faible, la simplicité des méthodes de culture cellulaire, de transplantation et d’imagerie, ainsi que le caractère invasif minimal des techniques de souris. Les personnes qui n’ont jamais effectué d’injection veineuse de la queue auparavant peuvent avoir du mal à insérer l’aiguille dans la veine.Demandez une démonstration par un expert avant votre première injection. Pour commencer, prenez la souris anesthésiée et retirez les poils de sa face dorsale à l’aide d’un rasoir électrique avec un garde, exposant environ un pouce sur deux pouces de la peau. Remettez la souris rasée dans la chambre de retournement.Avant la greffe, transférez une souris à la fois de la chambre à une surface propre équipée d’un cône nasal d’isoflurane et guidez doucement la tête de la souris dans le cône nasal. Essuyez la zone rasée avec un tampon de préparation à l’alcool isopropylique pour enlever les poils lâches et désinfecter la peau.

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