Name: Isolement de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes à partir d’yeux de cobaye (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 6 s
Description: Apprenez une méthode simple d'isolement d'épithélium pigmentaire rétinien à partir d'yeux de cobaye. Cette technique produit des échantillons de haute qualité adaptés aux études d'expression génique en biologie moléculaire.

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Cette étude est financée par la Japan Society for the Promotion of Science Overseas Research Fellowships (S.G.), un boursier postdoctoral Loris et David Rich (S.G.) et une subvention du National Eye Institute des National Institutes of Health (R01EY012392; C.F.W.).

Tous les soins et traitements utilisés dans cette étude étaient conformes à la Déclaration ARVO sur l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. Les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie à Berkeley.
1. Énucléation de l’œil de cobaye
<ol><li>Euthanasier un cobaye avec une injection intracardiaque de pentobarbital sodique administré sous anesthésie (5% d’isoflurane dans l’oxygène).</li>
	<li>Énucléez les yeux à l’aide de forceps et de ciseaux, et transférez-les immédiatement dans une boîte de Petri de 10 cm avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile pour le lavage. Transférer les yeux à la solution fraîche de PBS. REMARQUE : Une plaque de 6 puits contenant 4 mL de solution par puits est recommandée.</li>
</ol>2. Isolement de l’œilleton oculaire postérieur et du complexe EPR/choroïde/sclérotique
<ol><li>À l’aide d’un microscope à dissection, utiliser une aiguille de 18 G pour faire une petite incision initiale dans la sclérotique, à environ 1,0 mm derrière la limite limbique (c.-à-d. entre la cornée et la sclérotique) (figure 1A); Ensuite, utilisez des ciseaux pour enlever le segment antérieur, y compris la cornée, l’iris, le corps ciliaire et le cristallin.</li>
	<li>Ensuite, en travaillant avec l’œilleton du segment oculaire postérieur restant, détachez la rétine du complexe EPR / choroïde / sclérotique; utiliser une pince pour d’abord saisir puis tirer doucement sur la zonule de Zinn, puis pour décoller progressivement la rétine sans fragmentation (Figure 1B). REMARQUE: La rétine ne doit pas être saisie directement pour éviter la fragmentation rétinienne et l’isolement incomplet du tissu rétinien. L’utilisation d’un microscope est essentielle pour cette étape de dissection.</li>
</ol>3. Isolement de l’EPR de la choroïde
<ol><li>Une fois que la rétine a été complètement enlevée, immerger le cupule postérieur restant, qui comprend l’EPR, la choroïde et la sclérotique, dans un réactif de stockage des tissus pendant 5 minutes (voir le tableau des matériaux). REMARQUE : Utilisez une plaque de 12 puits avec des puits identifiés, chacun rempli de 2 mL de réactif d’entreposage tissulaire.</li>
	<li>Transférer la coupelle oculaire dans un autre puits rempli de 4 ml de PBS pendant 10 s avant de le déplacer vers un troisième puits rempli de 2 ml de PBS.</li>
	<li>Fixez une aiguille de 30 G à une seringue de 1 mL remplie de PBS pour la dernière étape d’isolement de l’EPR. Appuyez doucement sur la seringue pour créer un flux de PBS; Tout d’abord, dirigez ce flux vers l’EPR pour y faire une petite déchirure ou un trou, puis dirigez le flux de PBS dans l’ouverture créée pour détacher l’EPR sous forme de feuille de la choroïde (Figure 1C). REMARQUE : Le détachement de l’EPR sous forme de feuille donne le plus grand échantillon d’EPR. Encore une fois, l’utilisation d’un microscope est essentielle pour cette étape.</li>
	<li>Après avoir détaché l’EPR de la choroïde (figure 1D), prélever le tissu EPR dans une seringue de 1 mL sans aiguille, puis transférer l’échantillon prélevé dans un tube de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifuger le tube de 1,5 mL avec l’EPR recueilli à 8 000 × g pendant 1 min pour obtenir une pastille d’EPR (figure 2A).</li>
	<li>Jeter la solution PBS et la remplacer par 350 mL de tampon de lyse, tel qu’inclus dans les trousses d’isolement de l’ARN (voir le tableau des matériaux); Pipette 20x pour mélanger et, ainsi, préserver la qualité de l’échantillon. Pour un stockage et une conservation à plus long terme, transférer les échantillons dans un congélateur à −80 °C. REMARQUE: Le tampon de lyse est un composant exclusif du kit d’isolement d’ARN pour la lyse cellulaire et tissulaire avant l’isolement de l’ARN et l’isolement simultané de l’ARN / ADN / protéine. Pour inactiver les ARN dans le lysat, assurez-vous d’ajouter du β-mercaptoéthanol au tampon de lyse (10 μL de β-mercaptoéthanol par 1 mL de tampon de lyse).</li>
</ol>4. Extraction de l’ARN-EPR
<ol><li>Utiliser une trousse d’isolement de l’ARN (voir le tableau des matériaux) pour isoler et prélever l’ARN des échantillons d’EPR en suivant les instructions fournies par le fabricant. Évaluer la qualité de l’échantillon par électrophorèse. REMARQUE : Le protocole décrit a donné un produit de bonne qualité (c.-à-d. indice d’intégrité de l’ARN [RIN] supérieur à 8,0).</li>
</ol>

<ol><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li>
<li>Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigmented+epithelium+-+from+basic+developmental+biology+research+to+translational+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The retinal pigmented epithelium - from basic developmental biology research to translational approaches.</a> The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).</li>
<li>Goto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+retina-specific+Aldh1a1+controls+dorsal+choroidal+vascular+development+via+Sox9+expression+in+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells.</a> Elife. 7, 32358(2018).</li>
<li>Rymer, J., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+retinal+pigment+epithelium+in+eye+growth+regulation+and+myopia%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review.</a> Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).</li>
<li>Wallman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+the+retina%3A+Choroidal+modulation+of+refractive+state%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state.</a> Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scleral+hypoxia+is+a+target+for+myopia+control%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Scleral hypoxia is a target for myopia control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).</li>
<li>Troilo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imi+-+Report+on+experimental+models+of+emmetropization+and+myopia%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Imi - Report on experimental models of emmetropization and myopia.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Violet+light+suppresses+lens-induced+myopia+via+neuropsin+%28OPN5%29+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118(2021).</li>
<li>Zhang, Y., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPE+and+choroid+mechanisms+underlying+ocular+growth+and+myopia%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).</li>
<li>Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> New England Journal of Medicine. 358 (24), 2606-2617 (2008).</li>
<li>McLeod, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+RPE+and+choriocapillaris+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Opthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration.</a> Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982(2009).</li>
<li>Bhutto, I., Lutty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+age-related+macular+degeneration+%28AMD%29%3A+Relationships+between+the+photoreceptor%2Fretinal+pigment+epithelium%2FBruch%27s+membrane%2Fchoriocapillaris+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex.</a> Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).</li>
<li>Shelton, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+choroid%2FRPE+gene+expression+in+marmoset+eyes+undergoing+changes+in+ocular+growth+and+refraction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction.</a> Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).</li>
<li>Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+retinoic+acid+on+the+tight+junctions+of+the+retinal+pigment+epithelium-choroid+complex+of+guinea+pigs+with+lens-induced+myopia+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo.</a> International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).</li>
<li>He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+gene+expression+in+tree+shrew+retina+and+retinal+pigment+epithelium+produced+by+short+periods+of+minus-lens+wear%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear.</a> Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).</li>
<li>Nickla, D. L., Wallman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifunctional+choroid%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The multifunctional choroid.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 144-168 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional%2C+optical+sign-dependent+regulation+of+BMP2+gene+expression+in+chick+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).</li>
<li>Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+the+rapid+isolation+of+RPE+cells+specifically+for+RNA+extraction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis.</a> Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).</li>
<li>Goto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+signatures+of+contact+lens-induced+myopia+in+guinea+pig+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Opthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium.</a> Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25(2022).</li>
<li>De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vascular+patterns+in+domestic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Retinal vascular patterns in domestic animals.</a> Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).</li>
<li>Araki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base-resolution+methylome+of+retinal+pigment+epithelial+cells+used+in+the+first+trial+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-based+autologous+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation.</a> Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).</li>
<li>Sonoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).</li>
<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Dans cet article, nous décrivons une méthode d’isolement de l’EPR, appropriée pour les analyses d’expression génique de l’EPR, à partir des yeux de jeunes cobayes pigmentés. Les avantages de ce protocole sont qu’il produit des échantillons d’EPR de haute qualité qui sont relativement exempts de contamination, avec de l’ARN convenablement préservé pour les analyses spécifiques de l’ARN et, pourtant, est relativement simple et efficace. Alors que dans l’exemple fourni ici, les échantillons d’EPR ont été prélevés dans les y...

L’EPR comprend une monocouche unique de cellules pigmentées situées entre la rétine neurale et la choroïde vasculaire, et l’EPR a des rôles bien reconnus dans le développement et le maintien de la fonction rétinienne normale, y compris la phototransduction 1,2. Plus récemment, l’EPR s’est vu attribuer un rôle clé supplémentaire dans la régulation de la croissance oculaire3 et, par conséquent, dans le développement de la myopie4. Cette assignation est basée sur l’emplacement critique de l’EPR, interposé entre la rétine et la choroïde et l’acceptation désormais large que la croissance oculaire et, par conséquent, les erreurs de réfraction sont régulées localement5. On pense que le RPE joue un rôle clé en tant que relais de signaux, reliant la rétine, source supposée de signaux modulateurs de croissance, à la choroïde et à la sclérotique, les deux cibles des signaux relayés 6,7,8.
L’augmentation de la longueur axiale qui caractérise la plupart des myopies ne peut pas être considérée comme bénigne, les changements physiopathologiques impliquant la rétine, la choroïde et / ou la sclérotique représentant des conséquences inévitables et désormais bien reconnues d’un allongement oculaire excessif 7,9. Dans ce contexte, l’EPR est peut-être le plus vulnérable, car, étant un tissu non mitotique, il ne peut accueillir la chambre vitrée en expansion que par l’étirement et l’amincissement de cellules individuelles. Bien que son rôle dans les pathologies liées à la myopie, telles que la dégénérescence maculaire myope, n’ait pas encore été entièrement compris, l’EPR a été impliqué dans la pathogenèse d’un certain nombre d’autres maladies de la rétine, y compris l’atrophie géographique, l’une des principales causes de cécité, qui est associée à des anomalies documentées de la rétine, de l’EPR et de la choroïde10,11, 12.
L’isolement réussi des cellules EPR, exemptes de contamination par les tissus oculaires adjacents, ouvre potentiellement de nombreuses possibilités de recherche pour acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes sous-jacents à diverses maladies oculaires et rétiniennes. Cependant, l’isolement de l’EPR s’est avéré difficile, de nombreuses études publiées utilisant des échantillons combinés de rétine/EPR ou d’EPR/choroïde pour cette raison13,14,15. Les études impliquant l’isolement réussi de l’EPR d’une qualité adaptée aux études de biologie moléculaire ont été limitées aux yeux de poussins et de souris16,17. Par exemple, la méthode d’isolement simultané de l’EPR et de stabilisation de l’ARN (SRIRS) décrite par Wang et coll.18. Isoler les cellules EPR chez la souris ne semble pas bien fonctionner dans les yeux des cobayes. Le protocole décrit ici représente un raffinement d’une approche qui a été initialement prototypée avec des yeux de musaraigne arboricole par l’un des auteurs (M.F.) et qui s’est avérée produire des échantillons d’EPR de haute qualité, appropriés pour les analyses d’ARN et d’autres analyses de biologie moléculaire, à partir des yeux de jeunes cobayes pigmentés19.

<table><tbody><tr><td>Seringue de 1 mL avec embout coulissant</td><td>Bd Vacutainer Labware Medical</td><td>22-253-260</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire à 6 puits avec couvercle, fond plat,</td><td>pectre stérile Chemical Mfg. Corp</td><td>970-95008</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire à 12 puits avec couvercle, individuelle, stérile</td><td>Thomas Scientific LLC</td><td>1198D72</td><td></td></tr><tr><td>Électrophorèse automatisée du bioanalyseur</td><td></td><td></td> Agilent 2100 <td>pour vérifier la qualité de l’ARN</td></tr><tr><td>Solutions de sel équilibré</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Bonn Micro pinces, droite, lisse, pointe de 0,3 mm, 7 cm</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>11083-07</td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont n° 5</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles jetables hypodermiques</td><td>Exelint International, Co.</td><td>26419</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles jetables hypodermiques</td><td>Exelint International, Co.</td><td>26437</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuses MiniSpin</td><td>Eppendorf</td><td>540108</td><td>Vitesse max. : 8 000 g</td></tr><tr><td>Solution de stabilisation RNAlater</td><td>Invitrogen</td><td>AM7020</td><td>réactif de stockage de tissus</td></tr><tr><td>RNeasy Mini kits</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Kit d’isolement de l’ARN</td></tr><tr><td>Student Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>Référence 91500-09</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes à partir d’yeux de cobaye

Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes

Ce protocole décrit l’isolement des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) des yeux de jeunes cobayes pigmentés pour une application potentielle dans les études de biologie moléculaire, y compris les analyses d’expression génique. Dans le contexte de la régulation de la croissance oculaire et de la myopie, l’EPR joue probablement un rôle de relais cellulaire pour les signaux modulateurs de croissance, car il est situé entre la rétine et les deux parois de l’œil, telles que la choroïde et la sclérotique. Bien que des protocoles d’isolement de l’EPR aient été développés pour les poussins et les souris, ces protocoles se sont avérés ne pas être directement transposables au cobaye, qui est devenu un modèle de myopie de mammifère important et largement utilisé. Dans cette étude, des outils de biologie moléculaire ont été utilisés pour examiner l’expression de gènes spécifiques afin de confirmer que les échantillons étaient exempts de contamination par les tissus adjacents. La valeur de ce protocole a déjà été démontrée dans une étude RNA-Seq de l’EPR de jeunes cobayes pigmentés exposés à un défocalisation optique induisant la myopie. Au-delà de la régulation de la croissance oculaire, ce protocole a d’autres applications potentielles dans les études des maladies de la rétine, y compris la maculopathie myopique, l’une des principales causes de cécité chez les myopes, dans laquelle l’EPR a été impliquée. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est relativement simple et, une fois perfectionnée, donne des échantillons d’EPR de haute qualité adaptés aux études de biologie moléculaire, y compris l’analyse de l’ARN.

L’analyse des échantillons d’EPR recueillis à l’aide du protocole ci-dessus a montré un ARN bien conservé (RIN &gt;8.0, Figure 2B), avec 240,2 ng ± 35,1 ng par œil (n = 8, NanoDrop, Figure 2B). Pour évaluer davantage la qualité des échantillons d’EPR isolés, en particulier l’absence de contaminants choroïdiens et scléraux, nous avons examiné l’expression de gènes représentatifs pour chacun de ces derniers tissus dans les échantillons d’EPR19</...

Nous décrivons une méthode simple et efficace pour isoler les cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) des yeux de jeunes cobayes pigmentés. Cette procédure permet des études de biologie moléculaire de suivi sur l’EPR isolé, y compris des analyses d’expression génique.

Isolement de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes à partir d’yeux de cobaye

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential ...

L’épithélium pigmentaire rétinien ou EPR est essentiel pour la santé de la rétine. Et l’étude de l’EPR isolé est cruciale pour la maladie de la rétine. Cette méthode d’isolement de l’EPR du cobaye, un modèle populaire de myopie, aide à résoudre le problème difficile.Le principal avantage de cette technique est qu’elle est relativement simple et donne un échantillon d’EPR de haute qualité adapté aux études moléculaires biologiques, y compris l’analyse RPE. En suivant parfaitement la technique démontrée et en observant comment manipuler les outils de dissection, on peut maîtriser cette procédure rapidement avec un peu de pratique. Après avoir euthanasié sans cruauté le cochon d’Inde et énucléé les yeux de l’animal, lavez immédiatement les yeux en les transférant dans une boîte de Petri de 10 centimètres contenant une solution saline tamponnée au phosphate stérile ou PBS.Après le lavage, transférer les yeux dans une solution de PBS fraîche. Maintenant sous un microscope à dissection, utilisez une aiguille de calibre 18 pour faire une petite ouverture initiale dans la sclérotique d’un œil, à environ un millimètre derrière la limite limbique entre la cornée et la sclérotique. À l’aide d

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Biologie

Dans cette vidéo, nous montrons une procédure pour obtenir des cellules épithéliales pigmentaires oculaires à partir d’un modèle de lapin. Les cellules sont utiles dans le développement de stratégies thérapeutiques pour les maladies dégénératives de la rétine.

Isolement des cellules IPE et RPE : une technique pour obtenir des cellules épithéliales de pigment oculaire à partir d’œil de lapin

Dans cette vidéo, nous décrivons une technique permettant d’isoler les cellules épithéliales de l’iris et du pigment rétinien des yeux porcins afin d’obtenir leurs cultures primaires pour des études in vivo et ex vivo. Ces cellules pigmentaires pourraient être génétiquement modifiées pour étudier des approches régénératives pour traiter les troubles oculaires.

Isolement des cellules IPE et RPE : une technique pour obtenir des cellules épithéliales pigmentées à partir d’un œil porcin isolé

Cette vidéo montre la procédure d’isolement des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (EPR) et des cellules épithéliales pigmentaires de l’iris (EPI) à partir d’yeux bovins prélevés. Les cellules isolées peuvent être cultivées pour étudier leur rôle dans le traitement des maladies oculaires.

Isolement des cellules EPR et IPE de l’œil bovin : une procédure de récolte et de culture de cellules épithéliales pigmentaires primaires bovines

Ici, un protocole pour isoler et transfecter les cellules épithéliales pigmentaires primaires de l’iris et de la rétine de divers mammifères (souris, rats, lapins, porcs et bovins) est présenté. La méthode est parfaitement adaptée à l’étude des approches de thérapie génique oculaire dans diverses configurations pour des analyses ex vivo et des études in vivo transférables à l’homme.

Isolement, culture et génie génétique de cellules épithéliales pigmentaires primaires de mammifères pour la thérapie génique non virale

Ce manuscrit décrit un protocole simplifié pour l’isolement progressif des cellules de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR) des yeux de souris. Le protocole comprend l’énucléation et la dissection des yeux de souris, suivies de l’isolement, de l’ensemencement et de la culture des cellules EPR.

Isolement de cellules épithéliales pigmentées rétiniennes primaires de souris

Ce protocole décrit la procédure d’obtention et de culture de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes primaires (EPR) à partir d’yeux porcins d’origine locale. Ces cellules constituent une alternative de haute qualité aux cellules souches et conviennent à la recherche rétinienne in vitro .

Isolement de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes porcines primaires pour la modélisation in vitro

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) agit comme une barrière cruciale entre la choroïde et la rétine, favorisant la santé et la fonction des types de cellules rétiniennes, telles que les photorécepteurs. Nous décrivons ici un protocole simple et efficace pour isoler et cultiver l’EPR murin adulte.

Méthode simplifiée d’isolement et de culture de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes de souris adultes

Dans cette vidéo, nous allons démontrer comment isoler des cellules souches rétiniennes de l'épithélium ciliaire de l'oeil de la souris et les faire grandir dans la culture pour former clonale sphères de la rétine. Les sphères qui sont isolées possèdent les propriétés cardinales des cellules souches: l'auto-renouvellement et multipotentiality.

L&#39;isolement des cellules souches rétiniennes de l&#39;Oeil de la souris

Une façon rapide, robuste d'isoler des cellules adultes viables souches épithéliales de la peau humaine est décrite. La méthode utilise la digestion enzymatique de la matrice collagène de la peau, suivie par la plumaison des follicules pileux et à l'isolement des suspensions de cellules uniques ou fragments de tissus pour la culture cellulaire.

Isolement et culture des cellules souches épithéliales adultes de la peau humaine

Le profil des souches d'origine humaine pluripotentes (iPS), l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de l'homme induit-souches pluripotentes (iPS) (iPS-RPE), et RPE fœtale microARN (miARN), ont été comparés.

Profils MicroRNA d&#39;expression de cellules iPS humaines, l&#39;épithélium pigmentaire rétinien Derived From iPS, et fœtale épithélium pigmentaire rétinien

Apprenez une méthode simple d'isolement d'épithélium pigmentaire rétinien à partir d'yeux de cobaye. Cette technique produit des échantillons de haute qualité adaptés aux études d'expression génique en biologie moléculaire.

Isolement de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes à partir d’yeux de cobaye

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