Name: Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en amas d’îlots pancréatiques producteurs d’insuline (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Découvrez une méthode de culture en suspension statique pour différencier des progéniteurs pancréatiques en amas d'îlots sécrétant de l'insuline à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Ce protocole améliore le taux de réussite et réduit le stress cellulaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous tenons à remercier STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, FRDJ et les Instituts de recherche en santé du Canada pour leur soutien. Jia Zhao et Shenghui Liang sont les récipiendaires de la bourse Michael Smith Health Research BC Trainee Award. Mitchell J.S. Braam est récipiendaire de la bourse Mitacs Accélération. Diepiriye G. Iworima est récipiendaire de la bourse d’études supérieures du Canada Alexander-Graham-Bell et du Prix commémoratif de l’École Polytechnique 1989 de la FCFDU. Nous remercions sincèrement le Dr Edouard G. Stanley de l’IRMC et de l’Université Monash d’avoir partagé la ligne Mel1 INS GFP/W et l’Alberta Diabetes Institute Islet Core pour l’isolement et la distribution des îlots humains. Nous tenons également à souligner le soutien des installations d’imagerie et de cytométrie en flux de l’Institut des sciences de la vie de l’Université de la Colombie-Britannique. La figure 1 a été créée avec BioRender.com.

<ol><li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes.</a> Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).</li>
<li>Petersen, M. C., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+insulin+action+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of insulin action and insulin resistance.</a> Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+journey+of+islet+cell+transplantation+and+future+development%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">The journey of islet cell transplantation and future development.</a> Islets. 10 (2), 80-94 (2018).</li>
<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li>
<li>Jennings, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+human+pancreas+from+foregut+to+endocrine+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment.</a> Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).</li>
<li>Jorgensen, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+illustrated+review+of+early+pancreas+development+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">An illustrated review of early pancreas development in the mouse.</a> Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).</li>
<li>Jensen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+factors+in+pancreatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory factors in pancreatic development.</a> Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).</li>
<li>Hald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+Ptf1a+antiserum+and+localization+of+Ptf1a+in+relation+to+Nkx6.1+and+Pdx1+during+the+earliest+stages+of+mouse+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).</li>
<li>Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+dynamics+of+pancreatic+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis.</a> Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).</li>
<li>Rukstalis, J. M., Habener, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin3%3A+a+master+regulator+of+pancreatic+islet+differentiation+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration.</a> Islets. 1 (3), 177-184 (2009).</li>
<li>Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Neurod1+contributes+to+the+lineage+potential+of+Neurogenin3%2B+endocrine+precursor+cells+in+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas.</a> PLoS Genetics. 9 (2), e1003278(2013).</li>
<li>Balboa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional%2C+metabolic+and+transcriptional+maturation+of+human+pancreatic+islets+derived+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells.</a> Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).</li>
<li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem-cell-derived+islets+ameliorate+diabetes+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates.</a> Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).</li>
<li>Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+cytoskeleton+to+direct+pancreatic+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).</li>
<li>Yoshihara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-evasive+human+islet-like+organoids+ameliorate+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes.</a> Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).</li>
<li>Mahaddalkar, P. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pancreatic+beta+cells+from+CD177%28%2B%29+anterior+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm.</a> Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).</li>
<li>Liang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+insulin-secreting+islet+clusters+in+a+multiwell-based+static+3D+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports+Methods%22%5BJournal%5D)">Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system.</a> Cell Reports Methods. 3, 10046(2023).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+beta-cell+function+reveals+glucose-mediated+heterogeneity+of+beta-cell+functional+development%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development.</a> Elife. 8, e41540(2019).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+calcium+activities+from+pancreatic+beta-cells+in+zebrafish+embryos+using+spinning-disc+confocal+and+two-photon+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy.</a> Bio-protocol. 11 (23), e4245(2021).</li>
<li>Liang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+monoxide+enhances+calcium+transients+and+glucose-stimulated+insulin+secretion+from+pancreatic+beta-cells+by+activating+phospholipase+C+signal+pathway+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).</li>
<li>Bruin, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+and+function+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+in+macroencapsulation+devices+following+transplant+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice.</a> Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).</li>
<li>Toyoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+aggregation+optimizes+the+differentiation+of+human+ESCs+and+iPSCs+into+pancreatic+bud-like+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells.</a> Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).</li>
<li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li>
<li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+cellular+identity+during+human+in+vitro+beta-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation.</a> Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pancreatic+progenitors+from+human+pluripotent+stem+cells+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules.</a> Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).</li>
<li>Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+clustering+enhances+PDX1+and+NKX6.1+expression+in+pancreatic+endoderm+cells+derived+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1190(2020).</li>
<li>Mamidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosignalling+via+integrins+directs+fate+decisions+of+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors.</a> Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+human+embryonic+stem+cell-derived+NKX6.1-expressing+pancreatic+progenitor+cells+accelerates+the+maturation+of+insulin-secreting+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo.</a> Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).</li>
<li>Sander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+gene+Nkx6.1+lies+downstream+of+Nkx2.2+in+the+major+pathway+of+beta-cell+formation+in+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas.</a> Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).</li>
</ol>

Timothy J. Kieffer était un employé de ViaCyte lors de la préparation de ce manuscrit. Les autres auteurs ne déclarent pas d’intérêts concurrents.

Cet article décrit un protocole hybride en sept étapes qui permet de générer des îlots hPSC capables de sécréter de l’insuline lors d’une provocation au glucose dans les 40 jours suivant la culture in vitro. Parmi ces multiples étapes, l’induction efficace de l’endoderme définitif est considérée comme un point de départ important pour les résultats finaux de différenciation18,27,28. Selon le protocole du fabricant, une ...

Les cellules bêta pancréatiques sécrètent de l’insuline en réponse à l’augmentation de la glycémie. Les patients qui ne produisent pas suffisamment d’insuline en raison de la destruction auto-immune des cellules bêta dans le diabète de type 1 (DT1)1, ou en raison d’un dysfonctionnement des cellules bêta dans le diabète de type 2 (DT2)2, sont généralement traités par l’administration d’insuline exogène. Malgré cette thérapie qui sauve des vies, elle ne peut pas égaler avec précision le contrôle exquis de la glycémie obtenu par la sécrétion dynamique d’insuline à partir de cellules bêta authentiques. En tant que tels, les patients souffrent souvent des conséquences d’épisodes hypoglycémiques potentiellement mortels et d’autres complications résultant d’excursions hyperglycémiques chroniques. La transplantation d’îlots cadavériques humains rétablit avec succès un contrôle glycémique strict chez les patients atteints de DT1, mais elle est limitée par la disponibilité de donneurs d’îlots et les difficultés à purifier les îlots sains pour la transplantation 3,4. Ce défi peut, en principe, être résolu en utilisant les hPSC comme matériau de départ alternatif.
Les stratégies actuelles de génération d’îlots sécréteurs d’insuline à partir de CSPh in vitro visent souvent à imiter le processus de développement du pancréas embryonnaire in vivo 5,6. Cela nécessite de connaître les voies de signalisation responsables et d’ajouter au moment opportun les facteurs solubles correspondants pour imiter les étapes critiques du développement du pancréas embryonnaire. Le programme pancréatique commence par l’engagement dans l’endoderme définitif, qui est marqué par les facteurs de transcription forkhead box A2 (FOXA2) et la région déterminant le sexe Y-box 17 (SOX17)7. La différenciation successive de l’endoderme définitif implique la formation d’un tube intestinal primitif, formant un intestin antérieur postérieur qui exprime l’homéobox pancréatique et duodénal 1 (PDX1)7,8,9, et l’expansion épithéliale en progéniteurs pancréatiques qui co-expriment PDX1 et NK6 homéobox 1 (NKX6.1)10,11.
Un engagement supplémentaire dans les cellules des îlots endocriniens s’accompagne de l’expression transitoire de la neurogénine-3 (NGN3)12 et de l’induction stable des facteurs de transcription clés de la différenciation neuronale 1 (NEUROD1) et de l’homéobox 2 NK2 (NKX2.2)13. Les principales cellules exprimant des hormones, telles que les cellules bêta productrices d’insuline, les cellules alpha productrices de glucagon, les cellules delta productrices de somatostatine et les cellules PPY productrices de polypeptides pancréatiques, sont ensuite programmées. Grâce à ces connaissances, ainsi qu’aux découvertes issues d’études approfondies de criblage de médicaments à haut débit, les progrès récents ont permis de générer des îlots hPSC avec des cellules ressemblant à des cellules bêta capables de sécréter de l’insuline 14,15,16,17,18,19.
Des protocoles par étapes ont été rapportés pour générer des cellules bêta sensibles au glucose 6,14,18,19. Basé sur ces études, le présent protocole implique l’utilisation d’un kit de progéniteurs pancréatiques pour générer des cellules progénitrices pancréatiques PDX1+/NKX6.1+ dans une culture planaire, suivie d’une agrégation de plaques de micropuits en grappes de taille uniforme et d’une différenciation supplémentaire vers des îlots hPSC sécrétrices d’insuline avec le protocole R dans une culture statique en suspension 3D. Des analyses de contrôle de la qualité, y compris la cytométrie en flux, l’immunomarquage et l’évaluation fonctionnelle, sont effectuées pour une caractérisation rigoureuse des cellules en voie de différenciation. Cet article fournit une description détaillée de chaque étape de la différenciation dirigée et décrit les approches de caractérisation in vitro.

<table><tbody><tr><td>3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3)</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td>Hormone thyroïdienne</td></tr><tr><td>4 % PFA solution</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>Doit être manipulé dans une hotte</td></tr><tr><td>96-Well, Ultralow Accessoire, fond plat</td><td>Corning Costar (VWR)</td><td>CLS3474</td><td>Fond plat ; pour la culture en suspension statique dans les trois dernières étapes</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07920</td><td>Réactif de dissociation pour cellules de stade 4</td></tr><tr><td>Aggrewell400 plaques</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>34415</td><td>400 &micro ; plaques à micropuits de diamètre m</td></tr><tr><td>Plaques Aggrewell800</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>34815</td><td>800 &micro ; m de diamètre plaques de micropuits</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Chèvre anti-Humain FOXA2 (IgG de chèvre)</td><td>R& D Systems</td><td>IC2400G</td><td>1:100 en cytométrie en flux ; utilisé pour le dosage des cellules de l’étape 1</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control</td><td>R& D Systems</td><td>IC108G</td><td>1:100 en cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Souris anti-SST humaine (souris IgG2B)</td><td>BD Sciences</td><td>566032</td><td>1:250 en cytométrie en flux ; utilisé pour le dosage des cellules de stade 7</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Souris IgG2B Contrôle des isotypes</td><td>R& D Systems</td><td>IC0041G</td><td>1:500 en cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Souris anti-peptide C humain (souris IgG1&kappa ;)</td><td>BD Pharmingen</td><td>565831</td><td>1:2 000 en cytométrie en flux ; utilisé pour le dosage des cellules de stade 7</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Souris anti-INS humain (souris IgG1&kappa ;)</td><td>BD Sciences</td><td>565689</td><td>1:2 000 en cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Souris anti-Human NKX6.1 (souris IgG1&kappa ;)</td><td>BD Sciences</td><td>563338</td><td>1:33 en cytométrie en flux ; utilisé pour le dosage des cellules de stade 4</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Souris anti-Human SOX17 (souris IgG1&kappa ;)</td><td>BD Sciences</td><td>562594</td><td>1:50 en cytométrie en flux ; utilisé pour le dosage des cellules de stade 1</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Souris IgG1&kappa ; Contrôle des isotypes</td><td>BD Sciences</td><td>557714</td><td>1:50 en cytométrie en flux</td></tr><tr><td>ALK5i II</td><td>Cayman Chemicals</td><td>14794</td><td>Inhibiteur de signalisation TGF-bêta</td></tr><tr><td>Solution de rinçage anti-adhérence&nbsp ;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7010</td><td>Microwell Rinsing Solution</td></tr><tr><td>Chambre d’essai</td><td>Cellvis</td><td>D35-10-1-N</td><td>Pour le GSIS statique et l’imagerie confocale</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td>Pour la procédure d’immunocoloration</td></tr><tr><td>Anticorps CK19</td><td>DAKO</td><td>M0888</td><td>1:50 en montage entier immunofluorescence</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>Supplément moyen</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Pour contre-coloration nucléaire</td></tr><tr><td>DMEM/F12, HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330032</td><td>Solution de dilution</td></tr> de matrice <tr><td>Âne anti-chèvre Alexa Fluor 555</td><td>Life technologies</td><td>A21432</td><td>1:500 en monture entière immunofluorescence</td></tr><tr><td>Âne anti-chèvre Alexa Fluor 647</td><td>Technologies de vie</td><td>A21447</td><td>1:500 en monture entière immunofluorescence</td></tr><tr><td>Donkey anti-souris Alexa Fluor 555</td><td>Life technologies</td><td>A31570</td><td>1:500 en monture entière immunofluorescence</td></tr><tr><td>âne anti-souris Alexa Fluor 647</td><td>Life technologies</td><td>A31571</td><td>1:500 en monture entière immunofluorescence</td></tr><tr><td>âne anti-lapin Alexa Fluor 555</td><td>Life technologies</td><td>A31572</td><td>1:500 en monture entière immunofluorescence</td></tr><tr><td>Âne anti-lapin Alexa Fluor 647</td><td>Life technologies</td><td>A31573</td><td>1:500 en porte-mouton</td></tr> entier <tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>Life technologies</td><td>A21448</td><td>1:500 en monture entière immunofluorescence</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>Sans Ca2+ et Mg2+</td></tr><tr><td>ELISA, insuline, humain</td><td>Alpco</td><td>80-INSHU-E01.1</td><td>Pour la mesure de l’insuline humaine</td></tr><tr><td>Sans acides gras BSA</td><td>Proliant</td><td>68700</td><td>Supplément moyen</td></tr><tr><td>Kit de solutions de fixation et de perméabilisation</td><td>BD Sciences</td><td>554714</td><td>Fix/Perm et 10x Perm/Wash solutions incluses</td></tr><tr><td>Réactif de dissociation cellulaire douce</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7174</td><td>Pour le passage des hPSC en agglomération pendant la culture d’entretien</td></tr><tr><td>Anticorps anti-glucagon</td><td>Sigma</td><td>G2654</td><td>1:400 en monture entière</td></tr><tr><td>immunofluorescence GLUT1</td><td>anticorps Thermo Fisher Scientific</td><td>PA1-37782</td><td>1:200 en monture entière immunofluorescence</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Supplément de L-glutamine</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td>Pour l’éclaircissement et le montage des tissus</td></tr><tr><td>GSi XX</td><td>Sigma Millipore</td><td>565789</td><td>Inhibiteur de l’encoche</td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td>Supplément moyen</td></tr><tr><td>ITS-X (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51500056</td><td>Insuline-Transferrine-Sélénium-Éthanolamine ; supplément moyen</td></tr><tr><td>LDN193189&nbsp ;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72147</td><td>Antagoniste BMP</td></tr><tr><td>Anticorps MAFA</td><td>Abcam</td><td>ab26405</td><td>1:200 en montage entier immunofluorescence</td></tr><tr><td>Matrigel, qualifié hESC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-774-552</td><td>Matrice extracellulaire pour revêtement de surface du vaisseau</td></tr><tr><td>MCDB131 medium</td><td>Life technologies</td><td>10372019</td><td>Base</td></tr><tr><td>medium mTeSR1 Kit complet</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>milieu de cellules souches et supplément 5x inclus</td></tr><tr><td>N-Cys (N-acétyl cystéine)</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>Antioxydant</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td>Supplément moyen</td></tr><tr><td>NEUROD1 anticorps</td><td>R& D Systems</td><td>AF2746</td><td>1:20 en immunofluorescence à monture entière</td></tr><tr><td>Anticorps NKX6.1</td><td>DSHB</td><td>F55A12-c</td><td>1:50 en immunofluorescence à monture entière</td></tr><tr><td>Anticorps polypeptide pancréatique</td><td>R& D Systems</td><td>AF6297</td><td>1:200 en immunofluorescence</td></tr><tr><td>totale PBS</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td>avec Ca2+ et Mg2+</td></tr><tr><td>PDX1</td><td>anticorps Abcam</td><td>ab47267</td><td>1:200 en immunofluorescence</td></tr><tr><td>totale PE Souris anti-Human GCG (souris IgG1&kappa ;)</td><td>BD Sciences</td><td>565860</td><td>1:2 000 en cytométrie en flux ; utilisé pour le dosage des cellules de stade 7</td></tr><tr><td>PE Souris anti-humaine NKX6.1 (souris IgG1k)</td><td>BD Sciences</td><td>563023</td><td>1:250 en cytométrie en flux</td></tr><tr><td>PE Souris anti-Human PDX1 (souris IgG1k)</td><td>BD Sciences</td><td>562161</td><td>1:200 en cytométrie en flux ; utilisé pour le dosage des cellules de stade 4</td></tr><tr><td>PE Souris IgG1&kappa ; Contrôle des isotypes</td><td>BD Sciences</td><td>554680</td><td>1:2 000 en cytométrie</td></tr><tr><td>en flux PE Souris-Chromogranine humaine A (CHGA, souris IgG1k)</td><td>BD Sciences</td><td>564563</td><td>1:200 en cytométrie en flux</td></tr><tr><td>R428&nbsp ;</td><td>Cayman Chemicals</td><td>21523</td><td>AXL Inhibiteur de la tyrosine kinase</td></tr><tr><td>Acide rétinoïde, all-trans</td><td>Sigma</td><td>R2625</td> Tampon de lyse RIPA <td>sensible à la lumière</td></tr><tr><td>, 10x</td><td>Sigma</td><td>20-188</td><td>Pour l’extraction hormonale</td></tr><tr><td>SANT-1</td><td>Sigma</td><td>S4572</td><td>Inhibiteur de SHH</td></tr><tr><td>SLC18A1 anticorps</td><td>Sigma</td><td>HPA063797</td><td>1:200 en immunofluorescence à monture entière</td></tr><tr><td>Anticorps Somatostatine</td><td>Sigma</td><td>HPA019472</td><td>1:100 en immunofluorescence</td></tr><tr><td>totale STEMdiff Kit de progéniteur pancréatique</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05120</td><td>Milieux basaux et suppléments inclus</td></tr><tr><td>Anticorps anti-synaptophysine</td><td>Novus</td><td>NB120-16659</td><td>1:25 en immunofluorescence totale</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Pour la perméabilisation</td></tr><tr><td>Trolox&nbsp ;</td><td>Sigma Millipore</td><td>648471</td><td>Analogue de la vitamine E</td></tr><tr><td>TrypLE Enzyme Express</td><td>Life technologies</td><td>12604-021</td><td>réactif d’enzyme de dissociation cellulaire pour hPSCs de passage de cellule unique</td></tr><tr><td>Trypsine1/2/3 anticorps</td><td>R& D Systems</td><td>AF3586</td><td>1:25 en monture entière immunofluorescence</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td>Inhibiteur de ROCK</td></tr><tr><td>Sulfate de zinc</td><td>Sigma</td><td>Z0251</td><td>Supplément de milieu</td></tr></tbody></table>

différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en amas d’îlots pancréatiques producteurs d’insuline

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters

La différenciation des cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) en cellules bêta sécrétrices d’insuline fournit du matériel pour étudier la fonction des cellules bêta et le traitement du diabète. Cependant, il reste des défis à relever pour obtenir des cellules bêta dérivées de cellules souches qui imitent adéquatement les cellules bêta humaines natives. S’appuyant sur des études antérieures, des cellules d’îlots pancréatiques dérivées de CSPh ont été générées pour créer un protocole avec des résultats de différenciation et une cohérence améliorés. Le protocole décrit ici utilise un kit de progéniteurs pancréatiques pendant les stades 1 à 4, suivi d’un protocole modifié à partir d’un article précédemment publié en 2014 (appelé « protocole R » ci-après) au cours des stades 5 à 7. Des procédures détaillées pour l’utilisation du kit de progéniteurs pancréatiques et de plaques de micropuits de 400 μm de diamètre pour générer des grappes de progéniteurs pancréatiques, le protocole R pour la différenciation endocrinienne dans un format de suspension statique à 96 puits, ainsi que la caractérisation in vitro et l’évaluation fonctionnelle des îlots dérivés des CSPh, sont inclus. Le protocole complet prend 1 semaine pour l’expansion initiale des CSPh, suivie de ~5 semaines pour obtenir des îlots de CSPh productrices d’insuline. Le personnel possédant des techniques de culture de cellules souches de base et une formation en essais biologiques peut reproduire ce protocole.

Nous avons développé une stratégie hybride pour différencier les cellules souches en îlots hPSC sécréteurs d’insuline en sept étapes, qui utilise un kit de progéniteurs pancréatiques pour les quatre premières étapes de la culture planaire, suivi d’un protocole modifié basé sur une méthode6 précédemment rapportée dans une culture en suspension statique pour les trois dernières étapes (Figure 1). Avec ce protocole, il est essentiel d’assurer une culture proche de la con...

La différenciation des cellules souches en cellules d’îlots pancréatiques offre une solution alternative au traitement conventionnel du diabète et à la modélisation de la maladie. Nous décrivons un protocole détaillé de culture de cellules souches qui combine un kit de différenciation commercial avec une méthode préalablement validée pour aider à produire des îlots dérivés de cellules souches sécrétrices d’insuline dans une boîte.

Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en amas d’îlots pancréatiques producteurs d’insuline

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and ...

Ce protocole utilise une stratégie de culture en suspension statique pour différencier les progéniteurs pancréatiques en grappes d’îlots pancréatiques, réduit les contraintes subies par les cellules lors de la culture par agitation et améliore considérablement le succès de la différenciation. Le protocole matériel est convivial pour les débutants et permet de gagner du temps pour l’optimisation des quatre premières étapes. Le personnel ayant des techniques de base de culture de cellules souches peut reproduire ce protocole avec de bonnes chances de générer des amas fonctionnels en forme d’îlots.Pour commencer, pré-enrobez les puits de culture avec du matrigel qualifié hESC dilué dans du DMEM/F12 glacé et placez la plaque dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius à 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Aspirez le milieu usé de la culture hPSC et rincez une fois avec du DPBS. Dissocier la culture de hPSC en cellules individuelles avec une enzyme de dissociation cellulaire à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes.Après dissociation, rincez les cellules en ajoutant du milieu DMEM/F12 chaud et transférez-les dans un tube conique de 15 ou 50 millilitres. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 G pendant cinq minutes et remettre la pastille en suspension dans un milieu complet de cellules souches contenant 10 micromolaires Y-27632. Ensuite, effectuez le comptage des cellules vivantes à l’aide d’un hémocytomètre.Après comptage, aspirer le matrigel dilué et ensemencer immédiatement les cellules vivantes à raison de 1,6 à 1,8 fois 10 à la densité de cinq par centimètre carré sur les puits recouverts de matrigel. Incubez les cellules dans un incubateur humidifié pendant 24 heures. Ensuite, à la première étape, le premier jour, préparez le milieu de l’étape 1A.Remplacez le milieu usé par le milieu de stade 1A et incubez pendant 24 heures. Le lendemain, remplacez le milieu usé des puits par un milieu de stade 1B fraîchement préparé. À la deuxième étape, le premier jour, préparez le milieu de stade 2A et remplacez le milieu des puits par le milieu de stade 2A.Incuber pendant 24 heures avant d’ajouter le milieu de stade 2B dans les puits ; Une troisième étape, le premier jour, aspire le milieu épuisé des puits, puis ajoute le milieu de l’étape 3 fraîchement préparé et incube dans un incubateur humidifié. À l’étape quatre, le premier jour, remplacez le milieu épuisé par un milieu de l’étape 4 fraîchement préparé et incubez dans un incubateur humidifié. À l’étape quatre, le cinquième jour, prétraitez les micropuits avec 500 microlitres de solution de rinçage anti-adhérence par puits.Centrifugez la plaque du micropuits à 1 300 g pendant cinq minutes et observez-la au microscope pour vous assurer qu’aucune bulle d’air n’est piégée dans les micropuits. Ensuite, aspirez la solution de rinçage des puits et rincez une fois avec un millilitre de DPBS. Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu d’agrégation dans chaque puits.Après avoir retiré le milieu épuisé des cultures de progéniteurs pancréatiques, laver la culture une fois avec du DPBS avant de se dissocier en cellules individuelles avec un réactif de dissociation à 37 degrés Celsius pendant 10 à 12 minutes. Rincez les cellules avec du DMEM/F12 chaud et transférez-les dans un tube pour centrifugation à 300 G pendant cinq minutes. Remettre la pastille en suspension dans le milieu d’agrégation et effectuer le comptage des cellules vivantes.Ensemencer de 2,4 à 3,6 millions de cellules par puits et ajouter un milieu d’agrégation à chaque puits pour obtenir un volume final de deux millilitres par puits. À l’aide d’une pointe de pipette P-1000, pipetez doucement les cellules de haut en bas pour une répartition uniforme. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 G pendant cinq minutes pour capturer les cellules dans les micropuits et incuber dans un incubateur humidifié pendant 24 heures pour initier l’agrégation.Après l’agrégation, pipetez doucement les agrégats de haut en bas plusieurs fois pour faire flotter les cellules non agrégées. Une fois que les agrégats se déposent, retirez avec précaution le milieu usé contenant des cellules flottantes non agrégées sans aspirer les agrégats. Verser un milieu frais de l’étape 5 sur la surface de la plaque de micropuits pour déloger les agrégats des micropuits et les transférer dans la plaque à six puits à très faible fixation.Après avoir recueilli tous les agrégats dans les six puits à très faible fixation, les remettre en suspension dans le milieu de l’étape 5 pour ajuster la densité à 20 grappes par 100 microlitres. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanaux, versez 50 microlitres de milieu de l’étape 5 dans chaque puits d’une plaque ULA à fond plat à 96 puits à fixation ultra-faible. Remplissez les puits d’angle et de bord avec 200 microlitres de DPBS.Mélangez délicatement la remise en suspension de la grappe à chaque fois avant de distribuer. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de la remise en suspension du cluster dans chaque puits de la plaque ULA à fond plat de 96 puits. Placez les plaques de culture sur une surface plane dans un incubateur humidifié pendant 24 heures.Le lendemain ou à l’étape cinq, le deuxième jour, à l’aide d’une pipette multicanal, retirez délicatement 90 microlitres du milieu usé de chaque puits et rafraîchissez avec 100 microlitres de milieu de l’étape 5. À l’étape six, le premier jour, remplacez les 90 microlitres de milieu usé par 100 microlitres de milieu de l’étape 6 par puits. À l’étape sept, le premier jour, retirez le milieu épuisé et ajoutez 100 microlitres de milieu de l’étape 7 par puits.Dans cette étude, à l’aide de plaques de micropuits, des milliers de clusters de progéniteurs pancréatiques de taille et de morphologie uniformes ont été générés à la fois, et l’efficacité moyenne d’agrégation était d’environ 74%Il est important de noter que l’expression de PDX1 et NKX6.1 a été maintenue à des niveaux élevés dans ces clusters après l’agrégation. Les cellules exprimant l’insuline ont été progressivement induites au sein des clusters endocriniens, comme l’indique l’augmentation des signaux GFP de l’insuline dans les cultures vivantes au fil du temps. La taille de l’amas passe d’un diamètre moyen de 150 microns à 220 microns entre les stades cinq et sept.La caractérisation de la composition cellulaire montre que les îlots hPSC de stade sept générés par le protocole hybride étaient principalement endocriniens et comprenaient quatre principaux types de cellules d’îlots pancréatiques. Ce protocole hybride a généré en grande partie des cellules d’îlots pancréatiques monohormonales et une minorité de cellules bihormonales. Les cellules bêta en voie de différenciation expriment NKX6.1, MAFA, NEUROD1, PDX1 et GLUT1.De plus, 60 % d’insuline et de cellules doublement positives PDX1 et 50 % de cellules doublement positives du peptide C et NKX6.1 ont été induits dans les cultures de stade sept. In vitro, des tests statiques de sécrétion d’insuline stimulés par le glucose ont démontré que les îlots hPSC de stade sept sécrètent des niveaux élevés d’insuline en réponse à un taux élevé de glucose et à une dépolarisation directe. La teneur totale en insuline des îlots hPSC est environ la moitié de celle des îlots cadavériques.Le système de culture statique à puits multiples pour la génération d’îlots dérivés de cellules souches facilite divers essais in situ et peut servir de plate-forme appropriée pour le développement de protocoles et les études de criblage à petite échelle. Pour minimiser la fusion de la grappe lors d’une culture statique dans une plaque à 96 puits, n’inclinez pas la plaque lors du changement de milieu. Gardez toujours la plaque horizontale sur une surface plane.

differentiation-human-pluripotent-stem-cells-into-insulin-producing

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

La présente étude décrit une approche différenciation dirigée dans l'induction de la différenciation du pancréas de cellules souches embryonnaires humaines. D'une grande importance est le fait que des cellules endothéliales de co-culture de maturation de la médiation sur les cellules souches embryonnaires humaines dérivées des progéniteurs pancréatiques en cellules exprimant l'insuline.

Cellules endothéliales co-culture de maturation de la médiation de l&#39;homme les cellules souches embryonnaires à des cellules productrices d&#39;insuline du pancréas dans une approche différenciation dirigée

Un protocole d'isoler, les grappes de la culture, et de l'image cellules des îlots (CCI) dérivées de cellules pancréatiques fœtales humaines est décrite. La méthode décrit les étapes nécessaires pour générer CCI du tissu, de la culture en monocouche ou en suspension sous forme d'agrégats, et l'image des marqueurs de prolifération et les décisions du destin cellulaire du pancréas.

L&#39;isolement, la culture, et de l&#39;imagerie de l&#39;homme causés par des amas de cellules pancréatiques

Ici, nous décrivons une méthode pour la purification de cellules embryonnaires humaines différenciées souches qui se sont engagés envers l'endoderme définitif pour l'amélioration des applications en aval et d'autres différenciations.

Une méthode rapide et efficace pour la purification des cellules endoderme Généré à partir d&#39;embryons humains Cellules souches

Nous décrivons ici un protocole 4 étapes pour différencier les cellules souches embryonnaires humaines à NKX6-1 + progéniteurs pancréatiques in vitro. Ce protocole peut être appliqué à une variété de lignées de cellules souches pluripotentes humaines.

Différenciation efficace de pluripotentes cellules souches à NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; pancréatiques progéniteurs

Nous présentons ici un protocole détaillé afin de différencier les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) dans les protéines de boîte homéotique pancréas/duodénum 1+ (PDX1+) pour la génération des lignées du pancréas, les cellules basé sur la croissance de monocouche de type non colonie de dissocier les cellules individuelles. Cette méthode convient pour la production homogènes cellules dérivées d’hPSC, la manipulation génétique et dépistage.

Génération efficace du pancréas/duodénum homéotique Protein 1+ postérieure Foregut/pancréatique progéniteurs de hPSCs dans les Cultures de l’adhérence

Le présent protocole décrit une méthode améliorée pour augmenter la co-expression des facteurs de transcription PDX1 et NKX6.1 chez les progéniteurs pancréatiques dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) dans des monocouches planes. Ceci est réalisé en reconstituant la matrice fraîche, en manipulant la densité cellulaire et en dissociant les cellules endodermiques.

Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en précurseurs de cellules bêta pancréatiques dans un système de culture 2D

Cet article présente un protocole de différenciation dirigée et d’analyse fonctionnelle des cellules de type β-cellules. Nous décrivons les conditions de culture et les passages optimaux pour les cellules souches pluripotentes humaines avant de générer des cellules pancréatiques productrices d’insuline. La différenciation en six étapes progresse de la formation définitive de l’endoderme à des cellules fonctionnelles de type β sécrétant de l’insuline en réponse au glucose.

Protocole optimisé pour la génération de cellules pancréatiques fonctionnelles sécrétant de l’insuline à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Nous proposons un protocole mini-invasif pour la transplantation intramusculaire d’îlots de cellules souches pancréatiques dérivées de cellules souches humaines dans des souris immunodéficientes pour une implantation in vivo et une analyse en aval.

Transplantation intramusculaire de cellules endocrines pancréatiques dérivées des cellules souches pluripotentes humaines chez la souris

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) ont la capacité intrinsèque de différencier et d'auto-organisation dans des modèles de tissus distincts; bien que cela nécessite la présentation des gradients environnementaux spatiales. Nous présentons stencil micromodelage comme une méthode simple et robuste pour générer des gradients biochimiques et mécaniques pour le contrôle des motifs de différenciation HPSC.

Stencil micromodelage des pluripotentes humaines Cellules souches pour Probing Organisation spatiale des Différenciation Fates

Ici, nous présentons un protocole de différenciation des cardiomyocytes robuste, rapide et évolutif pour les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC). Les cardiomyocytes dérivés à l’aide de cette méthode à grande échelle peuvent fournir un nombre suffisant de cellules pour leur utilisation efficace dans la modélisation des maladies cardiovasculaires humaines, le criblage de médicaments à haut débit et potentiellement des applications cliniques.

Production à grande échelle de cardiomyocytes à partir pluripotentes humaines cellules souches en utilisant un petit protocole Différenciation Molecule-Based hautement reproductible

Découvrez une méthode de culture en suspension statique pour différencier des progéniteurs pancréatiques en amas d'îlots sécrétant de l'insuline à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Ce protocole améliore le taux de réussite et réduit le stress cellulaire.

Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en amas d’îlots pancréatiques producteurs d’insuline

Explorer plus de vidéos