Name: Surveillance des réponses de signalisation ciblée chez les larves de poisson-zèbre - Z-REX démasque les mécanismes précis des médicaments électrophiles et des métabolites (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Découvrez la méthode Z-REX pour analyser la signalisation des petites molécules réactives chez les larves de poisson-zèbre. Cette approche précise permet d'étudier les interactions ligand-protéine et leurs effets phénotypiques dans le contexte du cancer du sein.

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<ol><li>Long, M. J. C., Ly, P., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+harnessing+non-enzymatic+post-translational+modifications+for+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A primer on harnessing non-enzymatic post-translational modifications for drug design.</a> RSC Medicinal Chemistry. 12 (11), 1797-1807 (2021).</li>
<li>Parvez, S., Long, M. J. C., Poganik, J. R., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+signaling+by+reactive+electrophiles+and+oxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Redox signaling by reactive electrophiles and oxidants.</a> Chemical Reviews. 118 (18), 8798-8888 (2018).</li>
<li>Parvez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-REX+on-demand+redox+targeting+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">T-REX on-demand redox targeting in live cells.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2328-2356 (2016).</li>
<li>Long, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+electrophile+tagging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Precision electrophile tagging in Caenorhabditis elegans.</a> Biochemistry. 57 (2), 216-220 (2018).</li>
<li>Van Hall-Beauvais, A., Zhao, Y., Urul, D. A., Long, M. J. C., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-protein-specific+redox+targeting+in+live+mammalian+cells+and+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-protein-specific redox targeting in live mammalian cells and C. elegans.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 10 (3), 43(2018).</li>
<li>Long, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt3+is+a+privileged+first+responder+in+isozyme-specific+electrophile+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Akt3 is a privileged first responder in isozyme-specific electrophile response.</a> Nature Chemical Biology. 13 (3), 333-338 (2017).</li>
<li>Poganik, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wdr1+and+cofilin+are+necessary+mediators+of+immune-cell-specific+apoptosis+triggered+by+Tecfidera%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Wdr1 and cofilin are necessary mediators of immune-cell-specific apoptosis triggered by Tecfidera.</a> Nature Communications. 12 (1), 5736(2021).</li>
<li>Lin, H. -Y., Haegele, J. A., Disare, M. T., Lin, Q., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generalizable+platform+for+interrogating+target-+and+signal-specific+consequences+of+electrophilic+modifications+in+redox-dependent+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A generalizable platform for interrogating target- and signal-specific consequences of electrophilic modifications in redox-dependent cell signaling.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (19), 6232-6244 (2015).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Wakabayashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keap1-null+mutation+leads+to+postnatal+lethality+due+to+constitutive+Nrf2+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Keap1-null mutation leads to postnatal lethality due to constitutive Nrf2 activation.</a> Nature Genetics. 35 (3), 238-245 (2003).</li>
<li>Huang, K. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Z-REX%3A+Shepherding+reactive+electrophiles+to+specific+proteins+expressed+either+tissue-specifically+or+ubiquitously%2C+and+recording+the+resultant+functional+electrophile-induced+redox+responses+in+larval+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Z-REX: Shepherding reactive electrophiles to specific proteins expressed either tissue-specifically or ubiquitously, and recording the resultant functional electrophile-induced redox responses in larval fish.</a> Nature Protocols. , (2023).</li>
<li>Long, M. J. C., Assari, M., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hiding+in+plain+sight%3A+The+issue+of+hidden+variables%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Hiding in plain sight: The issue of hidden variables.</a> ACS Chemical Biology. 17 (6), 1285-1292 (2022).</li>
</ol>

Des inhibiteurs de kinases à petites molécules spécifiques aux isoformes, dont la découverte a été rendue possible par les technologies REX, ont été déposés pour demande de brevet

Le Z-REX décrit dans ce protocole démontre une stratégie robuste pour l’étude de paires électrophile-cible et la déconvolution de la voie de signalisation chez les poissons vivants. L’administration dirigée à proximité permet le dosage et le contrôle spatial du traitement composé électrophile. Contrairement aux méthodes conventionnelles de dosage en bolus, dans lesquelles les concentrations supraphysiologiques d’électrophile déployées conduisent souvent à des problèmes hors cible, la quantité relativement faible d’électrophile libérée dans le système rend Z-REX largement non invasif. Nous avons utilisé 0,1-6 μM Ht-PreHNE (alcyne) dans des embryons de poisson zèbre, et les résultats ont montré que le traitement n’est pas préjudiciable au développement embryonnaire11.
La procédure Z-REX est généralement plus longue que T-REX, une technique de criblage / étude des protéines de détection électrophile dans les cellules en culture. Supposons que le but de l’expérience soit de dépister les interactions électrophile-cible; nous suggérons d’abord d’effectuer un criblage approfondi par T-REX dans des cellules en culture et d’utiliser Z-REX pour la validation in vivo et l’analyse phénotypique/pathique. Par rapport à la culture cellulaire, les exigences pour effectuer Z-REX sont des techniques d’élevage de poissons de base en plus des compétences expérimentales biochimiques requises par T-REX. Un délai typique pour Z-REX (de la traversée du poisson à l’administration électrophile inductible par la lumière) est de 2-3 jours, ce qui n’est pas plus de 1 jour de plus que le temps typique pour une expérience T-REX sur des cellules vivantes transfectées. L’imagerie en direct pour l’analyse phénotypique peut être effectuée 2-10 h après l’éclairage de la lumière; le couplage de clics avec l’azoture de biotine pour le test déroulant prend 3 jours; qRT-PCR pour tester la réponse transcriptionnelle prend 3 jours; SI la coloration prend 5 jours. Ces étapes sont à peu près similaires à leurs équivalents de culture cellulaire, bien que l’interprétation des données nécessite une compréhension de la physiologie des poissons et des souches rapporteures.
En tant que procédure à variables multiples12, plusieurs groupes témoins sont nécessaires pour que Z-REX exclue les incertitudes dans les résultats (Figure 1D). Les groupes témoins communs sont les suivants : (1) traitement DMSO/véhicule seulement; 2° le traitement par sonde, mais sans éclairage lumineux; 3° l’éclairage lumineux, mais sans traitement par sonde; (4) la construction P2A-split, dans laquelle Halo et le POI sont exprimés séparément, de sorte que la livraison de proximité est ablée; et (5) les mutants hypomorphes, dont les résidus électrophiles sont mutés, tels que Akt3 (C119S)6 et Keap1 (C151S, C273W, C288E)5, que nous avons utilisés dans des études antérieures.
Si les essais en aval comprennent une analyse par transfert Western, le dyolking doit être effectué avant la récolte. Les protéines vitellines réduisent la fidélité des évaluations de la concentration de lysat et peuvent se lier de manière non spécifique aux anticorps. Lors de l’imagerie de poissons vivants ou de la coloration IF à montage entier, nous avons également observé des signaux fluorescents non spécifiques dans le sac vitellin, résultant probablement de protéines autofluorescentes dans le sac vitellin, ou d’une liaison non spécifique des anticorps eux-mêmes. Si le signal d’autofluorescence interfère avec le signal, nous suggérons d’exclure le sac vitellin de la quantification, ou de quantifier différentes régions séparément. La déchorination est nécessaire pour l’imagerie des poissons vivants et le dosage de coloration IF à montage entier. Le chorion peut interférer avec l’imagerie, et plus tard avec la quantification / comptage cellulaire. Cependant, la déchorination n’est applicable qu’aux embryons âgés de plus de 1 dpf; Les embryons plus jeunes aux stades de blastulation/gastrulation/segmentation sont trop fragiles pour être déchorionnés.
Le protocole Z-REX décrit ici est basé sur l’expression de POI ectopiques pilotée par l’ARNm. La procédure est rapide par rapport à l’utilisation / génération de lignées de poissons transgéniques. L’expression pilotée par l’ARNm est omniprésente et transitoire, et dure au moins 2 jours pour les ARNm utilisés dans ce protocole. Cependant, la durée d’expression est susceptible de varier dans d’autres cas. Ainsi, cette approche fournit une fenêtre d’investigation rapide et plus globale sur les effets d’un événement spécifique de marquage électrophile, compatible avec plusieurs tests à haut débit / contenu élevé. Les lignées transgéniques avec une expression stable de Halo-POI dans des tissus spécifiques sont également compatibles avec le Z-REX11. De telles lignes sont mieux utilisées lorsqu’une question plus précise doit être posée, par exemple, lorsqu’un phénotype dans un organe spécifique est prédit à partir de données de culture cellulaire, ou lorsque le dépistage à partir d’expériences d’injection d’ARNm prédit qu’un organe spécifique est sensible à un événement de marquage électrophile. Une induction de réponse antioxydante spécifique au cœur par Z-REX a été démontrée en utilisant Tg(gstp1:GFP;DsRed-P2A-myl7:Halo-TeV-Keap1) poisson dans notre publication précédente11. Il peut également être possible d’effectuer Z-REX sur des poissons transgéniques âgés de plus de 2 dpf.

Une myriade d’événements de signalisation cellulaire impliquent des réactions entre de petites molécules réactives (produites de manière endogène dans la cellule ou xénobiotiques/xénométabolites, tels que des médicaments) et leur cible protéique. Dans de nombreux cas, un niveau substœchiométrique de tels événements de liaison covalents peut déclencher des réponses cellulaires, entraînant des changements, par exemple, dans le développement, le métabolisme, l’apoptose et / ou la réponse immunitaire1. Cependant, déconstruire le mode d’action (MOA) en reliant des événements de liaison spécifiques à leurs conséquences phénotypiques s’est avéré difficile. Les méthodes traditionnelles de dosage en bolus qui impliquent l’introduction de concentrations élevées de l’espèce réactive entraînent souvent la modification d’une multitude de protéines, ainsi qu’une toxicité excessive pour l’organisme modèle2. De telles conditions sont loin d’être idéales. Une méthode a été développée pour résoudre ces problèmes en culture cellulaire en utilisant la livraison électrophile localisée de précision dans un contexte cellulaire natif, appelée T-REX (targetable reactive electrophiles and oxidants)3. Dans les années qui ont suivi, l’accent a été mis sur des expériences sur des organismes entiers, ce qui permet d’étudier des protéines dans des contextes cellulaires spécifiques dans des cellules non transformées. Ainsi, nous avons étendu la technique pour être compatible avec plusieurs modèles, y compris les modèles d’embryons Danio rerio . Nous présentons ici le Z-REX (poisson zèbre ciblant les électrophiles et oxydants réactifs) (Figure 1).
Pour comprendre Z-REX, cet article présente d’abord les technologies REX et leurs concepts sous-jacents. À la base, ces techniques modélisent la signalisation endogène des espèces électrophiles réactives physiologiques (SER) en imitant la façon dont les électrophiles naturels sont produits localement in vivo avec une précision spatio-temporelle. La protéine d’intérêt (POI) est exprimée comme une construction de fusion vers Halo; cette dernière ancre la sonde perméable et inerte portant le RES photocagé dans une stœchiométrie 1:1. L’un de ces RES endogènes est le 4-hydroxynonénal (HNE ci-après), qui est photocagé dans la sonde Ht-PreHNE. Dans de nombreux cas, nous utilisons une version fonctionnalisée en alcyne de HNE [c’est-à-dire HNE (alcyne)], qui a essentiellement des propriétés biologiques identiques à HNE, mais peut être étiquetée par chimie de clic. La sonde, qui est également fonctionnalisée avec un chloroalcane pour la réactivité avec Halo, est appelée Ht-PreHNE (alcyne). Le complexe de la fusion Halo-POI et de la sonde ainsi formée permet l’administration proximale de RES au POI fusionné lors de l’irradiation à la lumière UV. Si le POI réagit rapidement avec le RES libéré, l’étiquetage covalent résultant du POI avec RES nous permet d’identifier les cystéines cinétiquement privilégiées.
Z-REX prend les avantages susmentionnés des technologies REX et les applique largement pour étudier des voies de signalisation spécifiques chez les poissons vivants. Ce protocole a été optimisé pour le poisson-zèbre (D. rerio), car ce sont des organismes vertébrés génétiquement traitables qui sont transparents pendant le développement, et donc idéaux pour les techniques opto-chimiques / génétiques comme les technologies REX. Néanmoins, une stratégie similaire est également susceptible de bien fonctionner sur d’autres espèces de poissons génétiquement traitables, car la large applicabilité de la méthode est due au mécanisme pseudo-intramoléculaire de l’administration électrophile dérivée des lipides (LDE). En effet, la procédure est hautement biocompatible, puisque les poissons peuvent être traités avec le Z-REX photocaged-électrophile [par exemple, Ht-PreHNE (alcyne)] pendant au moins 48 heures sans impact notable sur le développement. Un protocole similaire fonctionne dans C. elegans 4,5.
Le protocole décrit d’abord l’utilisation de l’injection d’ARNm pour produire une expression transitoire d’une construction de fusion Halo-POI non native dans des modèles embryonnaires de poissons-zèbres, 1 à 1,5 jours après la fécondation (dpf). Il en résulte l’expression de la protéine ectopique dans la majorité des cellules du poisson (ci-après appelée « ubiquitaire »), plutôt que dans des tissus ou des lieux spécifiques; Cependant, les données montrent que des effets spécifiques aux cellules peuvent être observés dans certains cas. Après injection, les embryons sont incubés avec une faible concentration [0,3-5 μM Ht-PreHNE (alcyne)] de la sonde jusqu’à 30,5 h après la fécondation (hpf). Ensuite, à un moment prescrit par l’utilisateur, la livraison du RES au POI dans le poisson est réalisée par photodéfocalisation pendant 2-5 min. Après la photodéfocalisation du RES, divers essais phénotypiques en aval peuvent être effectués au cours des 2 à 10 prochaines heures : 1) imagerie en direct des lignées rapporteures (figure 2A); 2) évaluation de l’étiquetage des cibles par transfert Western (figure 3); 3) analyse transcriptomique (figure 4); ou 4) immunofluorescence sur support entier (figure 5).
À titre d’exemple d’imagerie en direct de lignées rapporteures, Z-REX est démontré en tandem avec l’imagerie en direct de lignées de poissons, Tg (lyz: TagRFP) et Tg (mpeg1: eGFP), pour mesurer comment la modification RES d’un POI de capteur électrophile spécifique (à savoir Keap1) diminue les niveaux de neutrophiles et de macrophages, respectivement, sans effets observables sur d’autres cellules du poisson. Cependant, nous avons montré précédemment que le marquage POI et la signalisation de la voie consécutive des études T-REX peuvent être reproduits à l’aide de Z-REX pour plusieurs protéines: Akt3 6, Keap17 et Ube2v26. Dans l’ensemble, avec Z-REX, les scientifiques peuvent étudier la ou les conséquences de la modification covalente des points d’intérêt par les RES dans le contexte de plusieurs voies redox complexes. Cette technique est conçue pour identifier les cibles et leurs résidus fonctionnels pour la conception de médicaments covalents et les nouveaux mécanismes médicamenteux dans un modèle animal entier plus pertinent sur le plan contextuel.

<table><tbody>Tube de microcentrifugation <tr><td>2-Mercaptoéthanol (BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>de 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri de 10 cm</td><td>Celltreat</td><td>229692</td><td></td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation de 2 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’acrylamide et de bis-acrylamide à 30 %</td><td>BioRad</td><td>1610154</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à 6 puits</td><td>Celltreat</td><td>229506</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher</td><td>A/0600/15</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>GoldBio</td><td>A201-100</td><td></td></tr><tr><td>All Blue Prestained Protein Standards</td><td>BioRad</td><td>1610373</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-dPEG11-azide</td><td>Quanta Biodesign</td><td>102856-142</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Dye</td><td>BioRad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubes capillaires</td><td>VWR</td><td>HARV30-00200</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Supelco, Inc</td><td>1.02445.1000</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, sans EDTA Cocktail d’inhibiteurs de protéase Roche</td><td></td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Cu(TBTA)</td><td>Lumiprobe</td><td>21050</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-mouse-Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150107</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit-Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150075</td><td>1:1000 (IF)</td></tr><tr><td>Donkey anti-rat-AlexaFluor 568</td><td>Abcam</td><td>ab175475</td><td>1:1000 (IF)</td></tr><tr><td>Substrat ECL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>Substrat ECL-Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32132</td><td></td></tr><tr><td>Rotateur de bout en bout</td><td>FinePCR</td><td>Rotator AG</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Sigma</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur</td> <td>de micropipette flamboyant/brunSutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope à fluorescence</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>Pince (émoussée)</td><td>auto-fabriquée</td><td></td><td>par émoussement pince tranchante (Fine Science Tools, Dumont #5, 11252-40)</td></tr><tr><td>Pince (tranchante)</td><td>Fine Science Tools</td><td>Dumont #5, 11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Pointe de chargement de gel</td><td>Fisher</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>Imageur gel/transfert</td><td>Vilber</td><td>Imageur</td><td></td>Fusion FX</tr><tr><td>Perles de verre</td><td>Sigma</td><td>45-G1145</td><td></td></tr><tr><td>Micromètre à platine en verre</td><td>Meiji Techno.</td><td>MA285</td><td></td></tr><tr><td>Heat inactivated FBS</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Bain à ultrasons chauffé</td><td>VWR</td><td>89375-470</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Haute capacité streptavidine agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20359</td><td></td></tr><tr><td>Ht-PreHNE sonde alcyne</td><td>faite maison</td><td>-</td><td>Parvez, S. et al. Ciblage redox à la demande T-REX dans des cellules vivantes. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016).</td></tr><tr><td>Plaque d’imagerie (tampon HBSS 10 %, pour les embryons vivants)</td><td></td><td></td><td>Fabriqué avec une boîte de Pétri et 2 % d’agarose dans un tampon HBSS 10 %</td></tr><tr><td>Plaque d’imagerie (PBS, pour les embryons fixés au formaldéhyde)</td><td></td><td></td><td>Fabriqué avec une boîte de Pétri et 2 % d’agarose dans une plaque</td></tr><tr><td></td><td></td><td>d’injection</td> PBS <td>Fabriqué avec un moule de micro-injection, une boîte de Pétri et 2 % d’agarose dans un tampon HBSS 10 %</td></tr><tr><td>LDS</td><td>Apollo</td><td>APOBI3331</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>VWR</td><td>20864.32</td><td></td></tr><tr><td>Moule de micro-injection</td><td>Outils de science adaptatifs</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de microchargeur</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>Microscope pour micro-injection</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Source lumineuse</td><td>de microscope Olympus</td><td>&nbsp ;KL 1600 LED</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Sigma</td><td>M3516</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine SP6 Kit de transcription</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti- &beta ;-actine-HRP</td><td>Sigma</td><td>A3854</td><td>1:20000 (WB)</td></tr><tr><td>Souris anti-HaloTag</td><td>Promega</td><td>G921A</td><td>1:500 (IF)</td></tr><tr><td>Lecteur multimode</td><td>BioTek Instruments</td><td>Cytation 5</td><td></td></tr><tr><td>Appareil d’électrophorèse sur gel d’agarose d’acide nucléique</td><td>Biorad</td><td>Mini-Sub Cell GT Systems</td><td></td></tr><tr><td>Oligo(dT)20</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>personnalisées : (dT)20</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>pCS2+8 Halo-2XHA-P2A-TeV-Keap1-2xHA&nbsp ;</td><td>auto-cloné-Disponible</td><td></td> <td>auprès du groupe du Prof. Yimon AYE à l’EPFL</td></tr><tr><td>pCS2+8 Halo-TeV-Keap1-2xHA</td><td>auto-cloné-Disponible</td><td></td> <td>auprès du groupe du Prof. Yimon AYE à l’EPFL</td></tr><tr><td>PicoPump pneumatique</td><td>WPI</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Equipement et fournitures d’électrophorèse des protéines</td><td>Biorad</td><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorèse</td><td></td></tr><tr><td>Lapin anti-actif Caspase-3</td><td>BD Pharmingen&nbsp ;</td><td>559565</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>Rat anti-HA-HRP</td><td>Sigma</td><td>H3663</td><td>1:500 (IF et WB)</td></tr><tr><td>Rat anti-RFP</td><td>ChromoTek</td><td>5F8</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT inhibiteur de ribonucléase recombinant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>RnaseZap Solution</td> <td>de décontamination de l’ARNThermoFisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur à bascule</td><td>DLAB</td><td>SK-R1807-S</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Teknova</td><td>S9974</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III transcriptase inverse</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>t-Butanol</td><td>Sigma</td><td>471712</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Gold Biotechnology</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>TeV protéase (S219V)</td><td>self-made-Parvez</td><td></td><td>, S. et al. T-REX ciblage redox à la demande dans des cellules vivantes. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016).</td></tr><tr><td>Tg(lyz :TagRFP)</td><td>Centre International de Ressources Poisson-Zèbre (ZIRC)</td><td>uwm11Tg (ZFIN)</td><td>-</td></tr><tr><td>Tg(mpeg1 :eGFP)</td><td>Centre International de Ressources Poisson-Zèbre (ZIRC)</td><td>gl22Tg (ZFIN)</td><td>-</td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Analytik Jana</td><td>846-x-070-280</td><td></td></tr><tr><td>TMEDA</td><td>Sigma</td><td>T7024</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de transfert</td><td>Fisher</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Apollo</td><td>APOBI2888</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Réactif TRIzol Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de trypsine de Glycine max (soja)</td><td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Lampe UV avec lumière 365 nm</td><td>Spectroline</td><td>ENF 240C</td><td></td></tr><tr><td>Compteur UV&nbsp ;</td><td>Spectroline</td><td>XS-365</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scientific Industries, Inc.</td>Équipement et fournitures de transfert <td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>Western Blot</td><td>Biorad</td><td>Mini Trans-Blot ou Criterion Blotter.</td><td></td></tr><tr>Matériel <td></td><td></td><td>d’élevage et d’élevage de poissons-zèbres</td><td>dans la maison</td></tr><tr><td>Perles de zircone</td><td>BioSpec</td><td>11079107zx</td><td></td></tr></tbody></table>

surveillance des réponses de signalisation ciblée chez les larves de poisson-zèbre - z-rex démasque les mécanismes précis des médicaments électrophiles et des métabolites

Monitoring On-Target Signaling Responses in Larval Zebrafish - Z-REX Unmasks Precise Mechanisms of Electrophilic Drugs and Metabolites

Les métabolites réactifs et les médicaments électrophiles apparentés sont parmi les petites molécules les plus difficiles à étudier. Les approches conventionnelles pour déconstruire le mode d’action (MOA) de ces molécules tirent parti du traitement en vrac de spécimens expérimentaux avec un excès d’une espèce réactive spécifique. Dans cette approche, la forte réactivité des électrophiles rend l’étiquetage non discriminant du protéome d’une manière dépendante du temps et du contexte; Les protéines et les processus sensibles à l’oxydoréduction peuvent également être affectés indirectement et souvent de manière irréversible. Dans un tel contexte d’innombrables cibles potentielles et d’effets secondaires indirects, lier le phénotype à l’engagement cible spécifique reste une tâche complexe. Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX) - une plate-forme d’administration réactive électrophile à la demande adaptée à une utilisation chez les larves de poisson-zèbre - est conçue pour délivrer des électrophiles à une protéine d’intérêt spécifique (POI) dans des embryons de poissons vivants autrement non perturbés. Les principales caractéristiques de cette technique comprennent un faible niveau d’invasivité, ainsi qu’une administration électrophile de précision contrôlée par dosage, chémotype et spatio-temporel. Ainsi, en conjonction avec une suite unique de témoins, cette technique évite les effets hors cible et la toxicité systémique, autrement observés après une exposition en vrac incontrôlée des animaux aux électrophiles réactifs et aux médicaments électrophiles pléiotropes. En tirant parti de Z-REX, les chercheurs peuvent prendre pied dans la compréhension de la façon dont les réponses individuelles au stress et les sorties de signalisation sont modifiées à la suite de l’engagement spécifique du ligand réactif avec un point d’intérêt spécifique, dans des conditions quasi physiologiques chez des animaux vivants intacts.

Imagerie en direct de poissons rapporteurs transgéniques neutrophiles/macrophages traités au Z-REX, Tg(lyz:TagRFP) et Tg(mpeg1:EGFP). Induction de l’apoptose des neutrophiles/macrophages par HNEylation Keap1. (Voir aussi la figure 2). L’effet du marquage électrophile de Keap1 sur les niveaux de neutrophiles et de macrophages a été évalué en injectant des embryons transgéniques hétérozygotes dérivés de Tg(lyz:TagRFP) ou Tg(mpeg1:EGFP) avec de l’ARNm codant pour Halo-Keap1, puis en traitant avec Ht-PreHNE (alcyne). Conformément aux procédures de l’étape 6.1 - essai en aval, l’option 1-HNE (alcyne) a été libérée et Keap1 a été étiqueté. Les niveaux de neutrophiles et de macrophages ont été évalués par imagerie en direct des lignées rapporteures, Tg(lyz:TagRFP) et Tg(mpeg1:eGFP), respectivement. Le niveau des deux types de cellules a diminué de 30% à 40% après le traitement par Z-REX, dans lequel HNE a été administré à Keap1. Au contraire, aucune perte de neutrophiles ou de macrophages n’a été observée dans les groupes témoins techniques Z-REX [sans lumière et Ht-PreHNE (alcyne), lumière seule, ou Ht-PreHNE (alcyne) seul] (Figure 1D et Figure 2A-D).
L’induction de l’apoptose des neutrophiles/macrophages a indiqué une administration réussie d’ENH à Keap1 par Z-REX. Les détails de l’analyse de la voie et du mécanisme d’apoptose ont été publiés5. Pour tenir compte des effets hors cible de l’HNE(alcyne), plusieurs témoins ont été utilisés. (1) Dans les mêmes conditions expérimentales, au lieu de l’ARNm Halo-TeV-Keap1, les embryons ont été injectés avec l’ARNm Halo-P2A-Keap1. Le linker P2A a permis aux protéines Halo et Keap1 d’être exprimées indépendamment. Dans ce scénario, HNE (alcyne) libéré par Halo ne pouvait pas étiqueter Keap1, car il n’était plus proche de Halo (Figure 1D); Par conséquent, la voie de signalisation de l’apoptose n’a pas été déclenchée. Aucun changement dans les concentrations de macrophages ou de neutrophiles n’a été observé dans ce groupe (Figure 2A,B). (2) Les mêmes conditions expérimentales ont été réalisées en utilisant l’ARNm codant pour Halo-TeV-Keap1(C151S,C273W,C288E), un mutant de Keap1 qui ne répond pas à HNE (alcyne) (Figure 1D). Aucun changement dans les concentrations de macrophages ou de neutrophiles n’a été observé (Figure 2G,H).
Couplage azoture-clic de biotine et dosage de biotine pull-down. Évaluation de l’étiquetage des cibles. (Voir aussi la figure 3). L’évaluation du marquage de la cible a été réalisée à l’aide d’embryons WT, injectés avec de l’ARNm codant soit pour Halo-TeV-Keap1-2xHA (construction de fusion Halo-POI) ou Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA (construction P2A-split, dans laquelle Halo et Keap1 ne sont pas fusionnés; Figure 1D). La protéine Keap1 marquée n’a été retirée que dans le groupe exprimant la protéine de fusion et traitée avec Z-REX (deuxième voie dans le transfert anti-HA supérieur), mais pas dans les autres groupes témoins (pas d’injection d’ARNm, construction de fusion sans Z-REX ou construction P2A-split). Les résultats indiquent que le HNE (alcyne) a été livré avec succès à Keap1, et le Keap1 modifié a ensuite été conjugué avec la biotine par réaction de clic, et le Keap1 marqué à la biotine a été tiré vers le bas par la résine streptavidine.
Analyse transcriptionnelle. RNA-seq et qRT-PCR. (Voir aussi la figure 4). Le changement transcriptionnel après le traitement par Z-REX a été évalué par RNA-seq et qRT-PCR. Dans le séquençage de l’ARN, plusieurs gènes liés au système immunitaire ont été régulés à la baisse après Z-REX. En revanche, de nombreux gènes liés à la réponse antioxydante (RA) ont été régulés à la hausse après Z-REX, ce qui a résulté de l’induction de la voie Keap1-Nrf2-AR lors de la HNEylation sur Keap110 (Figure 4A). Dans l’analyse qRT-PCR, des résultats similaires ont été trouvés lors de l’analyse de trois gènes liés au système immunitaire (lyz, mpeg1.1 et coro1a) (Figure 4B). La régulation ascendante et négative des gènes respectifs a montré l’induction réussie de voies médiées par la HNEylation Keap1.
Essai de coloration par (co)immunofluorescence et analyse de colocalisation en montage entier. (Voir aussi la figure 5). L’expression exogène de Halo-TeV-Keap1-2xHA et de Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA a été évaluée par coloration par immunofluorescence (FI) sur support entier (Figure 5A,B). La construction P2A-split-build avait deux fois plus de balises HA que la construction de fusion TeV, ce qui correspond à un signal anti-HA deux fois plus élevé dans le groupe P2A-split-construct-mRNA-injecté que l’autre, indiquant que le niveau d’expression des deux constructions était similaire (Figure 5C). Les niveaux d’expression du Halo-TeV-Keap1 (wt) et du Halo-TeV-Keap1 (C151S,C273W,C288E) ont également été trouvés similaires lors du sondage avec anti-Halo (Figure 5D,E). La colocalisation des neutrophiles et de la caspase active 3 dans la Tg traitée par Z-REX (lyz:TagRFP) a été observée par co-immunomarquage avec la caspase 3 anti-RFP et anti-active (Figure 5F). Active Caspase 3 est un indicateur d’événements d’apoptose.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig01.jpg"> Figure 1 : flux de travail Z-REX. (A,B) Un embryon de poisson-zèbre au stade 1-4 cellules est injecté avec (morpholino et) ARNm codant pour Halo-POI (par exemple, Halo-Keap1). Les embryons injectés sont ensuite traités avec une sonde composée d’un ligand HaloTag et d’un électrophile photocagé additionné d’un groupe fonctionnel alcyne, tel que Ht-PreHNE(alcyne) chez B. Après avoir retiré l’excès de sonde, l’embryon est exposé à la lumière pour libérer l’électrophile d’intérêt [p. ex., HNE ou son analogue, HNE (alcyne)]. L’analyse en aval est effectuée à un moment donné/défini par l’utilisateur. (C) Conception et mécanisme de la sonde Ht-PreLDE, applicable à différents électrophiles dérivés de lipides (LDE). (D) Groupes témoins négatifs/techniques pour Z-REX. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig02.jpg"> Figure 2 : Imagerie en direct de poissons rapporteurs transgéniques de neutrophiles/macrophages soumis au Z-REX. La HNEylation Keap1 médiée par Z-REX induit l’apoptose des neutrophiles/macrophages. (A) Images représentatives de poissons Tg(lyz:TagRFP) exprimant soit Halo-TeV-Keap1 (construction de fusion) ou Halo-P2A-Keap1 (construction divisée), et soumis à des conditions de contrôle négatives [pas de traitement, lumière seule, ou Ht-PreHNE (alcyne) seul ou Z-REX]. Âge de l’embryon: 36 hpf. (B) Quantification des niveaux de neutrophiles dans A. (C) Images représentatives de poissons Tg(mpeg1:eGFP) exprimant Halo-TeV-Keap1 avec ou sans traitement au Z-REX. Âge de l’embryon: 34 hpf. D) Quantification des concentrations de macrophages en C. (E,F) Mesure temporelle des niveaux de (E) neutrophiles et (F) de macrophages après traitement par Z-REX. (G) Expérience similaire à celle de A chez des poissons exprimant soit Halo-TeV-Keap1 (WT) ou Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E), un mutant qui n’a pas de capacité de détection HNE. H) Quantification des niveaux de neutrophiles en G. Barres d’échelle : 500 μm. Tous les graphiques sont présentés avec la moyenne ± les valeurs de SEM. p ont été calculées avec l’ANOVA unidirectionnelle (bleu) et le test t de Student bilatéral (noir). Cette figure a été modifiée à partir de Poganik et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig03.jpg"> Figure 3 : Dosage de la biotine. Les embryons WT exprimant Halo-TeV-Keap1-2XHA ou Halo-2XHA-P2A-Keap1-2XHA ont été traités avec Z-REX ou des conditions de contrôle négatives respectives (pas de traitement par sonde dans ce cas). Après la récolte, les embryons ont été lysés et traités avec de la protéase TeV avant le test d’extraction de la biotine. Les résultats ont été analysés par Western blotting. Ce chiffre a été modifié à partir de Huang et al. Z-REX : guidage des électrophiles réactifs vers des protéines spécifiques exprimées spécifiquement dans les tissus ou de manière ubiquitaire, et enregistrement des réponses redox fonctionnelles induites par les électrophiles résultantes chez les larves de poissons. Ce chiffre a été modifié à partir de Huang et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig04.jpg"> Figure 4 : Analyse transcriptionnelle. (A) Résultats du séquençage de l’ARN des embryons traités par Z-REX par rapport aux embryons non traités. Les gènes exprimés différentiellement significatifs (SDE) statistiquement significatifs sont mis en évidence. Les gènes SDE liés à l’immunité sont colorés en rouge. Les gènes liés à la réponse antioxydante (RA) sont colorés en vert. Les autres gènes SDE sont colorés en bleu. Toutes les valeurs p ont été calculées avec CuffDiff. (B-D) Trois gènes SDE liés à l’immunité de A: (B) lyz, (C) mpeg1.1 et (D) coro1a ont été analysés plus en détail avec qRT-PCR, et seuls les embryons traités par Z-REX ont montré la suppression de ces transcrits. Tous les graphiques sont présentés avec la moyenne ± les valeurs de SEM. p ont été calculées avec l’ANOVA unidirectionnelle (bleu) et le test t de Student bilatéral (noir). Cette figure a été modifiée à partir de Poganik et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig05.jpg"> Figure 5 : Essai de coloration par immunofluorescence à montage entier. (A,B) Images représentatives d’embryons exprimant soit (A) Halo-TeV-Keap1-2xHA ou (B) Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA immunocoloré avec un anticorps anti-HA et un anticorps secondaire conjugué avec AlexaFluor568. Les poissons injectés d’ARNm ont été comparés aux poissons non injectés appariés selon l’âge. (C) Quantification du signal anti-HA en (A,B). (D) Images représentatives d’embryons exprimant Halo-TeV-Keap1 (WT) ou Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E) immunocolorés avec un anticorps anti-Halo et d’anticorps secondaires conjugués avec AlexaFluor647. Les poissons injectés d’ARNm ont été comparés aux poissons non injectés appariés selon l’âge. e) Quantification du signal antihalo en D. Les valeurs p ont été calculées à l’aide du test t de Student bilatéral. (F) Les embryons Tg(lyz:TagRFP) soumis au Z-REX ont été co-immunocolorés avec de la Caspase 3 anti-RFP et anti-active, et des anticorps secondaires conjugués au fluorophore. La case blanche marque la zone agrandie. Les flèches blanches indiquent les colocalisations des neutrophiles et de Caspases 3 actives. Barres d’échelle : 500 μm. Tous les graphiques sont présentés avec la moyenne ± SEM. Cette figure a été modifiée à partir de Poganik et al.7. et Huang et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau supplémentaire 1 : Liste des tampons utilisés dans cette étude. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Le poisson zèbre ciblant les électrophiles et les oxydants réactifs (Z-REX) est une méthode basée sur la biologie chimique pour l’étude de la signalisation réactive des petites molécules. Cette technique peut être appliquée à des poissons vivants de différents stades de développement. Ici, nous associons des tests standard chez le poisson zèbre avec Z-REX pour l’analyse de la voie de signalisation.

Surveillance des réponses de signalisation ciblée chez les larves de poisson-zèbre - Z-REX démasque les mécanismes précis des médicaments électrophiles et des métabolites

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the ...

Ainsi, en tirant parti de Z-REX, les chercheurs peuvent interroger comment les réponses de signalisation individuelles sont modifiées en réponse à un ligand réactif spécifique s’engageant avec une protéine d’intérêt spécifique dans des conditions quasi physiologiques chez les larves de poisson zèbre. Les méthodes conventionnelles telles que la dose globale réactive de petites molécules provoquant des cibles et de la toxicité et ne donnent aucun contrôle sur la spécificité de la cible du ligand. Z-REX peut lier un engagement cible de ligand spécifique à un phénotype spécifique avec une grande précision spatio-temporelle.Nous avons récemment montré comment un métabolite réactif HNE, une cible associée et une voie découverte par Z-REX, permet le développement d’inhibiteurs de kinases spécifiques de l’isoforme de précision contre les cancers du sein triple négatif. Commencez par aligner les embryons dans les rainures d’une plaque d’injection remplie de solution saline équilibrée fraîche à 10% de Hank ou HBSS. Immergez l’extrémité de l’aiguille dans le milieu et, si nécessaire, appliquez des impulsions d’injection pour éliminer les bulles d’air dans l’embout Pour injecter l’embryon, pénétrez le chorion et le sac vitellin en un seul mouvement et appliquez une impulsion d’injection.Après avoir injecté les autres embryons, rincez-les dans une nouvelle boîte de Petri contenant un média HBSS frais à l’aide d’un flacon d’assaut. Mettez en commun les embryons non injectés dans une autre plaque. Pour effectuer l’analyse du traitement Z-REX, commencez par répartir les embryons injectés dans des boîtes de 10 centimètres.Dans une pièce sombre avec lumière rouge, remplacez le milieu par 30 millilitres de HBSS à 10% avec ou sans une micromolaire de la sonde REX. Incuber les embryons à 28,5 degrés Celsius dans l’obscurité. 30 heures après la fécondation, remplacez le support dans l’obscurité.Après avoir répété l’incubation et le remplacement du milieu deux fois, exposez les embryons à la lumière d’une lampe UV préchauffée tourbillonnant toutes les 30 secondes. Pour effectuer un test phénotypique, retirez les embryons non fécondés ou morts de la plaque contenant les embryons anesthésiés. À l’aide d’une pince tranchante, retirez le chorion des embryons.Monter les embryons sur une plaque d’agarose 2% préparée avec un milieu HBSS à 10% et observer au stéréomicroscope. Utilisez ImageJ pour compter le nombre de neutrophiles et de macrophages de chaque poisson. Sélectionnez la sélection à main levée et encerclez le poisson entier, puis choisissez l’option Trouver des maxima pour compter les cellules fluorescentes Dans la présente étude, les embryons traités au Z-REX ont démontré une perte de neutrophiles et de macrophages.Cet effet était absent dans les groupes non traités. La voie de signalisation de l’apoptose n’a pas été déclenchée dans le groupe Halo-P2A-Keap1, ce qui a entraîné des niveaux inchangés de macrophages et de neutrophiles. Des résultats similaires ont également été observés chez le mutant Halo-TEV-Keap1 qui n’a pas répondu à l’ENH.Les analyses de PCR transcriptionnelles et quantitatives en temps réel ont montré une régulation négative des gènes liés au système immunitaire et une régulation positive des gènes antioxydants après Z-REX. La coloration par immunofluorescence a montré que la construction divisée P2A avait deux fois plus de marqueurs HA que la construction de fusion TeV, ce qui indique des niveaux d’expression similaires. Les niveaux d’expression du type sauvage et du type mutant Halo-TeV-Keap1 étaient également similaires.Dans la lignée de rapporteurs de neutrophiles transgéniques traités par Z-REX, une colocalisation des neutrophiles et des caspases actives 3 a également été observée. Le plus important est d’avoir vos documents correctement configurés. Limiter améliorera vraiment vos résultats.Nous avons adopté Z-REX, une idée de plate-forme de dépistage de drogues connue sous le nom de Localis-REX. Jusqu’à présent, aucune autre technique n’a permis d’obtenir une telle cartographie locale spécifique et réactive du ligand ou de la cible. Il nous a aidés à développer des candidats médicaments électrophiles pour le traitement du cancer du sein.Compte tenu de l’importance croissante de la signalisation localisée dans de nombreux domaines, cancer, immunologie, vieillissement, etc., Z-Rex, le seul outil capable de cartographier les événements dirigés par ligand réactif localisé, promet d’aider de nombreux domaines.

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Surveillance des réponses de signalisation ciblée chez les larves de poisson-zèbre - Z-REX démasque les mécanismes précis des médicaments électrophiles et des métabolites

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