Name: Prédiction pharmacologique en réseau et validation expérimentale du mécanisme d’action de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contre l’adénocarcinome pulmonaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T14:35:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Découvrez la pharmacologie en réseau et la validation expérimentale du mécanisme de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contre l'adénocarcinome pulmonaire via la voie PI3K/AKT.

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Cette étude a été soutenue par le Programme de formation à l’innovation de l’Université de médecine chinoise de Beijing (No: 202110026036).

Toutes les procédures de pharmacologie en réseau ont été effectuées conformément aux lignes directrices pour les méthodes d’évaluation de la pharmacologie des réseaux18. Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux règles de gestion de laboratoire de l’Université de médecine chinoise de Beijing.
1. Prédiction pharmacologique en réseau
<ol><li>Sélection des composants actifs<ol><li>Ouvrez la base de données HERB (http://herb.ac.cn)19 et utilisez « Gualou » (le nom chinois de Trichosanthes kirilowii Maxim) et « Zhebeimu » (le nom chinois de Bulbus Fritillariae thunbergii) comme mots-clés pour obtenir les composants des deux médicaments. Téléchargez la liste et les structures SMILES canoniques des composants connexes des deux médicaments.</li>
		<li>Déterminez si le composant obtenu est le composant actif.<ol><li>Inclure comme composants actifs ceux qui ont des valeurs de biodisponibilité orale (BO) et de médicament (DL) dans la base de données du groupe HERB (c.-à-d. les composants avec ≥ obstétricien et DL ≥ 0,18)20,21.</li>
			<li>Si le composant n’a pas de valeurs OB et DL, entrez le composant dans la base de données suisse ADME (http://www.swissadme.ch/index.php)22 pour obtenir les informations sur chaque composant. Inclure les composants ayant une absorption gastro-intestinale « élevée » et au moins deux valeurs DL « Oui » comme composants actifs.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Prédiction cible des composants actifs<ol><li>Ouvrez la base de données HERB (http://herb.ac.cn). Recherchez et copiez les structures SMILES canoniques des composants actifs.</li>
		<li>Ouvrez la base de données SEA (Similarity ensemble approach, http://sea.bkslab.org)23. Collez les structures SMILES canoniques des composants actifs dans la zone de recherche, puis cliquez sur Essayer SEA pour obtenir la clé cible, le nom de la cible, la valeur P et le MaxTC de chaque composant actif.</li>
		<li>Copiez les données dans une feuille de calcul et utilisez la fonction de filtrage du fichier de feuille de calcul pour filtrer les cibles des composants actifs par touche cible (Humain, P < 0,05 et MaxTC > 0,5).</li>
		<li>Copiez toutes les cibles dans une feuille de calcul et supprimez les doublons pour obtenir les cibles médicamenteuses.</li>
	</ol></li>
	<li>Prédiction des cibles de la maladie<ol><li>Ouvrez la base de données GeneCards (https://www.genecards.org)24 et la base de données OMIM, https://www.omim.org)25 et utilisez l’adénocarcinome pulmonaire comme mot-clé pour obtenir les cibles de la maladie de l’adénocarcinome pulmonaire.</li>
		<li>Téléchargez les feuilles de calcul des cibles de la maladie. Supprimez les cibles répétées pour obtenir les cibles LUAD.</li>
	</ol></li>
	<li>Construction d’un réseau médicament-composant-maladie-cible<ol><li>Copiez les cibles liées à LUAD et les cibles médicamenteuses dans la même colonne dans une nouvelle feuille de calcul. Utilisez la fonction Données - Identifier les doublons de la barre d’outils pour obtenir les cibles d’intersection des cibles liées à LUAD et des cibles liées aux composants actifs Trichosanthes-Fritillaria thunbergii .</li>
		<li>Ouvrez Cytoscape 3.8.0. Cliquez sur Fichier dans la barre de menus, puis sélectionnez Importer > réseau à partir du fichier pour importer le fichier de feuille de calcul. Optimisez la taille et la couleur des nœuds réseau via la barre de style située dans le panneau de configuration de gauche.</li>
		<li>Utilisez la fonction Analyser le réseau pour l’analyse de la topologie du réseau . Cliquez sur Outils dans la barre de menus, puis sélectionnez Analyser le réseau. Dans le panneau Tableau , cliquez sur le degré dans la barre de titre pour organiser les composants par degré par ordre décroissant. Prenez les dix principaux composants et cibles comme principaux composants actifs et cibles principales.</li>
	</ol></li>
	<li>Construction du réseau PPI et criblage des protéines centrales<ol><li>Ouvrez la base de données STRING (https://cn.string-db.org/)26. Collez la liste au format texte des cibles potentielles de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contre LUAD dans la boîte de dialogue Liste des noms . Sélectionnez Homo sapiens dans Organismes, puis cliquez sur les boutons RECHERCHER > CONTINUER .</li>
		<li>Lorsque les résultats sont disponibles, cliquez sur Paramètres et cochez Confiance élevée (0,700) dans Paramètres de base > Score d’interaction minimum requis. Cochez Masquer les nœuds déconnectés du réseau dans Paramètres avancés, puis cliquez sur le bouton METTRE À JOUR.</li>
		<li>Cliquez sur Exportations dans la barre de titre et téléchargez le court texte tabulaire de la relation PPI au format TSV.</li>
		<li>Ouvrez Cytoscape 3.8.0. Cliquez sur Fichier > Importer > Réseau à partir du Fichier pour importer le fichier au format TSV pour une analyse visuelle.</li>
		<li>Utilisez la fonction Network Analyzer pour effectuer l’analyse topologique. Optimisez la taille et la couleur des nœuds réseau via la barre de style située dans le panneau de configuration de gauche.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse d’enrichissement KEGG<ol><li>Ouvrez la plateforme Metascape (https://metascape.org/)27. Collez la liste en format texte des cibles thérapeutiques potentielles dans la boîte de dialogue, puis cliquez sur le bouton Soumettre. Cochez H. sapiens dans Entrée en tant qu’espèce et Analyse en tant qu’espèce, puis cliquez sur le bouton Analyse personnalisée. Sélectionnez Enrichissement, cochez uniquement la voie KEGG, puis cliquez sur Analyse de l’enrichissement. Une fois que la barre de progression atteint 100%, cliquez sur le bouton orange de la page du rapport d’analyse pour les résultats de l’enrichissement.</li>
		<li>Cliquez sur All in One Zip File pour télécharger le résultat de l’enrichissement, puis ouvrez le fichier _ FINAL_GO.csv dans le dossier Enrichment_GO pour obtenir le résultat.</li>
		<li>Logiciel Open R (https://cran.r-project.org/). Tapez install.package (« ggplot2 ») et library (ggplot2) dans R pour l’installation du package ggplot2 R. Appuyez sur Entrée pour exécuter le programme de visualisation KEGG.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Vérification expérimentale
<ol><li>Préparation du médicament NOTE: Fritillaria thunbergii Miq et Trichosanthes kirilowii Maxim ont été achetés à l’hôpital Dongzhimen, affilié à l’Université de médecine chinoise de Pékin.<ol><li>Mélanger 50 g de Fritillaria thunbergii Miq et 50 g de Trichosanthes kirilowii Maxim. Faire tremper le mélange dans 1 L d’eau distillée pendant 20 min, puis décocter le mélange à 100 °C sous pression normale pendant 1 h.</li>
		<li>Filtrer la décoction pour obtenir un filtrat avec une double couche de gaze médicale stérile, puis utiliser du papier filtre de 80 μm pour filtrer davantage l’extrait. Répétez l’opération ci-dessus trois fois.</li>
		<li>Mélanger le filtrat ensemble pour obtenir une décoction d’environ 1,2 L. Placer la solution dans le ballon d’un évaporateur rotatif. Réglez la vitesse de rotation à 50 tr/min avec une température de 37 °C. Mélanger et condenser les décoctions en un extrait dans l’évaporateur rotatif pendant 6 h pour obtenir un liquide visqueux.</li>
		<li>Allumez le mécanisme de lyophilisation sous vide pour prérefroidir la température à −40 °C. Mettez l’extrait obtenu dans le plateau de matériau et placez-le dans le piège à froid pour la congélation.</li>
		<li>Lorsque la température du piège à froid atteint −50 °C et que le matériau a été congelé pendant 2 h, transférer les matériaux congelés dans un séchoir placé dans le piège à froid. Allumez la pompe à vide pour lancer le processus de lyophilisation. Sortez la poudre lyophilisée et conservez-la au réfrigérateur à −20 °C pour une utilisation ultérieure.</li>
	</ol></li>
	<li>Culture cellulaire<ol><li>Configurer le milieu complet DMEM avec 89% de milieu basique DMEM, 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine.</li>
		<li>Après avoir retiré les cellules A549 de l’azote liquide, incuber les cellules dans un bain-marie à 37 °C et remuer jusqu’à ce que le milieu dans le flacon fonde.</li>
		<li>Ajouter un quadruple volume de milieu complet DMEM dans les cellules fondues. Centrifuger les cellules (4 °C, 679 x g, 5 min) et jeter le surnageant.</li>
		<li>Resuspendre les cellules précipitées avec 6 mL de milieu complet DMEM, les plaquer dans une fiole de culture T25 et incuber la fiole dans un incubateur cellulaire à 37 °C, 5% CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>Détection de la viabilité cellulaire<ol><li>Digérer les cellules A549 logarithmiques en phase de croissance avec 1 mL de trypsine à 0,25% pendant 1 min à 37°C. Ajouter 1 mL de milieu complet DMEM pour neutraliser la trypsine, et souffler doucement pour favoriser l’excrétion cellulaire. Centrifuger le mélange pour obtenir la pastille cellulaire (4 °C, 192 x g, 5 min). Remettez en suspension les cellules obtenues en utilisant le milieu complet DMEM.</li>
		<li>Ajoutez la suspension cellulaire à un hémocytomètre et comptez à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Diluer à 5 x 104 cellules/mL en utilisant le milieu complet DMEM.</li>
		<li>Dissoudre 1 g d’extrait aqueux de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii dans 10 mL de solution de PBS et le stériliser par filtre à travers un filtre de 0,22 μm. Diluer le mélange à 90 mg/mL, 80 mg/ml, 70 mg/mL, 60 mg/mL, 50 mg/mL, 40 mg/mL, 30 mg/mL, 20 mg/mL et 10 mg/mL à l’aide du PBS.</li>
		<li>Plaquer les cellules diluées sur des plaques de 96 puits avec 100 μL par puits. Après l’adhérence cellulaire, ajouter 1 μL d’extraits aqueux de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii de différentes concentrations pour ajuster la concentration de chaque puits à 900 μg/mL, 800 μg/mL, 700 μg/mL, 600 μg/mL, 500 μg/mL, 400 μg/mL, 300 μg/mL, 200 μg/mL et 100 μg/mL.</li>
		<li>Jeter le milieu d’origine après 24 h de culture et ajouter 100 μL de milieu basique DMEM pour une incubation ultérieure pendant 2 h à 37 °C, 5 % de CO2.</li>
		<li>Après le traitement ci-dessus, ajouter 20 μL de solution MTS (Table of Materials), et incuber les cellules pendant encore 1 h à 37 °C, 5% CO2.</li>
		<li>Transférer le mélange incubé dans une assiette différente. Mesurer l’absorbance (OD) à une longueur d’onde de 490 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Calculez la viabilité de la cellule à l’aide de la formule suivante : Viabilité (%) = 100 × (DO de l’échantillon traité − DO du milieu)/(DO de l’échantillon témoin − DO du milieu). NOTE: Une concentration minimale proche de CI50 est définie comme une dose élevée. La concentration à laquelle la prolifération cellulaire commence à être inhibée est définie comme une concentration à faible dose, et la valeur intermédiaire est définie comme une concentration à dose moyenne pour les études expérimentales ultérieures. Dans cette étude, 400 μg/mL, 600 μg/mL et 800 μg/mL ont été utilisés comme doses faible, moyenne et élevée.</li>
	</ol></li>
	<li>Intervention en matière de drogue et prélèvement d’échantillons REMARQUE: La croissance cellulaire a été tracée en fonction du temps pour déterminer la phase logarithmique.<ol><li>Diluer les cellules A549 logarithmiques en phase de croissance à 5 x 105 cellules/mL. Ajouter 2 mL de la suspension cellulaire dans une plaque de 6 puits et cultiver pendant 12 h.</li>
		<li>Répéter l’étape 2.3.3 pour obtenir des dilutions PBS de 80 mg/mL, 60 mg/mL et 40 mg/mL d’extrait aqueux de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii. Ajouter 20 μL de la solution de PBS, 20 μL de l’extrait aqueux de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii à 40 mg/mL, 20 μL de l’extrait aqueux de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii à 60 mg/mL et 20 μL de l’extrait aqueux de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii à 80 mg/mL au groupe témoin blanc, au groupe à faible concentration, au groupe à concentration moyenne et au groupe à concentration élevée, respectivement. Jeter le surnageant après 24 h d’intervention et nettoyer les cellules avec du PBS trois fois. NOTA : Les concentrations du groupe témoin blanc, du groupe à faible concentration, du groupe à concentration moyenne et du groupe à forte concentration de l’extrait aqueux de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii étaient de 0 μg/mL, 400 μg/mL, 600 μg/mL et 800 μg/mL, respectivement.</li>
		<li>Ajouter 250 μL de tampon RIPA (contenant 1% PMSF et 1% inhibiteur de phosphatase) à chaque puits, et lyser les cellules pendant 30 min. Recueillir le lysat pour centrifugation (4 °C, 6 714 x g, 10 min) et obtenir le surnageant.</li>
	</ol></li>
	<li>Western blotting<ol><li>Détecter la concentration en protéines des échantillons par la méthode BCA conformément aux instructions du fabricant. Utilisez le tampon RIPA pour ajuster la concentration de chaque échantillon afin qu’elle soit cohérente.</li>
		<li>Mélanger 40 μL de l’échantillon de protéines avec 10 μL de tampon de charge 5x et faire bouillir pendant 5 min à 100 °C. Centrifuger (4 °C, 6 714 x g, 10 min) le mélange pour obtenir le surnageant pour les expériences ultérieures.</li>
		<li>Isoler les protéines par électrophorèse sur gel en utilisant une électrophorèse verticale de 120 V.</li>
		<li>Préparez un « sandwich » électrique (éponge - papier filtre - gel - membrane PVDF - papier filtre - éponge). Faire tremper l’appareil de transfert dans un bain de glace et transférer la protéine sur des membranes de PVDF à 70 V pendant 60 min.</li>
		<li>Utilisez 100 mL de solution TBST (0,05 % [v/v] Tween-20, 10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5) et 5 g de lait écrémé en poudre pour configurer le lait à 5 %. Pré-diluer les anticorps AKT et p-AKT avec le diluant d’anticorps dans un rapport de 1:1 000.</li>
		<li>Bloquer la membrane PVDF dans du lait écrémé en poudre à 5% pendant 1 h en agitant. Après le blocage, jeter le lait bloquant et ajouter l’anticorps primaire dilué pour une incubation nocturne à 4 °C.</li>
		<li>Après avoir retiré l’anticorps primaire, utilisez la solution TBST pour laver la membrane PVDF cinq fois pendant 5 minutes chacune.</li>
		<li>Pré-diluer l’anticorps secondaire avec le diluant d’anticorps dans un rapport de 1:5 000. Ajouter l’anticorps secondaire et incuber à température ambiante (RT) pendant 1,5 h. Après avoir retiré l’anticorps secondaire, utilisez la solution TBST pour laver la membrane PVDF cinq fois pendant 5 minutes chacune.</li>
		<li>Détecter la protéine à l’aide d’un système de détection par chimiluminescence.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Amarrage moléculaire
<ol><li>Ouvrez la base de données UniProt (https://www.uniprot.org)28. Tapez les symboles cibles dans la zone de recherche et cliquez sur le bouton RECHERCHER . Dans le sous-titre Structure , cliquez sur Télécharger pour les structures 3D des cibles protéiques.</li>
	<li>Ouvrez la base de données PDB RCSB (https://www.rcsb.org/pdb/home/sitemap.do)29. Tapez le nom des macromolécules de protéines dans la zone de recherche. Téléchargez les structures des macromolécules protéiques au format PDB.</li>
	<li>Téléchargez le package d’installation du logiciel UCSF Chimera 1.16 (https://vina.scripps.edu/) et AutoDock Vina (https://vina.scripps.edu/). Installez et ouvrez le logiciel UCSF Chimera 1.16. Cliquez sur Fichier > Ouvrir pour afficher la protéine réceptrice.</li>
	<li>Cliquez sur Outils > Modification de la structure > Dock Prep, puis cochez Supprimer le solvant, Ajouter des hydrogènes et Ajouter des charges dans la fenêtre contextuelle pour éliminer l’eau et ajouter des charges d’hydrogénation et d’équilibre. Cliquez sur Write Mol2 File pour enregistrer la protéine réceptrice au format mol2. Effectuez la même étape sur le ligand.</li>
	<li>Cliquez sur Fichier > Ouvrir pour afficher le ligand au format mol2 dans le logiciel UCSF Chimera 1.16. Dans Outils > Analyse de surface/liaison > AutoDock Vina, définissez la barre de récepteur sur le nom de la protéine réceptrice et la barre de ligand sur le nom du ligand. Entrez une valeur dans la case derrière Centre et Taille pour ajuster l’espace nouvellement développé, ce qui permet d’englober complètement le ligand et le récepteur.</li>
	<li>Cliquez sur OK pour le criblage virtuel d’amarrage moléculaire afin d’obtenir l’emplacement optimal pour la liaison du ligand au récepteur. Enregistrez la valeur de l’énergie de liaison à la position optimale.</li>
</ol>4. Analyse statistique
<ol><li>Ouvrez le logiciel statistique SPSS 26.0. Cliquez sur Fichier > Importer des données pour le chargement des données.</li>
	<li>Présenter les données expérimentales sous forme d’écart moyen ± type.</li>
	<li>Comparez plusieurs groupes à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle. REMARQUE : P < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif dans ce travail.</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

En général, une étude pharmacologique de réseau complète comprend l’identification des composants actifs à partir de bases de données, l’acquisition de cibles correspondant aux composants actifs et aux maladies, la construction d’un réseau médicament-composant-maladie-cible, et la prédiction des cibles et des voies principales. L’association entre les composants actifs et les protéines centrales (amarrage moléculaire) est prédite de manière préliminaire par la technologie informatique, et la vérification finale est effec...

Le cancer du poumon fait référence aux tumeurs malignes provenant de la muqueuse bronchique pulmonaire, y compris le carcinome épidermoïde, l’adénocarcinome, le carcinome à grandes cellules et le carcinome à petites cellules1. L’adénocarcinome du poumon (LUAD) est le type de cancer du poumon le plus courant, représentant environ 40 % du total des cas de cancer du poumon2. La plupart des patients sont diagnostiqués à un stade avancé ou ont des métastases à distance et, par conséquent, perdent l’occasion d’une intervention chirurgicale3. Dans le traitement clinique actuel, la chimioradiothérapie concomitante est la stratégie la plus courante pour traiter LUAD, mais son application est limitée en raison d’effets indésirables graves4.
La médecine traditionnelle chinoise (MTC) peut soulager efficacement les symptômes cliniques des patients atteints de LUAD et réduire les effets indésirables causés par la radiothérapie et la chimiothérapie et est ainsi devenue un haut lieu de recherche 5,6,7. En médecine traditionnelle chinoise, le cancer du poumon appartient à la catégorie de « l’accumulation pulmonaire » et « pétreux pulmonaire ». La carence en Qi et l’interaction des mucosités, de la stase et du poison sont importantes dans la pathogenèse du cancer du poumon. Par conséquent, tonifier le Qi et éliminer les mucosités et la stase sanguine sont les principales méthodes de traitement clinique8 pour le cancer du poumon selon la théorie de la MTC9. Trichosanthes kirilowii Maxim (Gualou) et Fritillaria thunbergii Miq (Zhebeimu) représentent une paire de médicaments commune dans le traitement du cancer du poumon, et cette combinaison a pour effet d’éliminer la chaleur et de réduire les mucosités10,11,12. Cependant, son mécanisme d’action n’est pas encore clair et d’autres recherches doivent être menées.
La pharmacologie de réseau est une méthode complète basée sur la théorie de la biologie des systèmes et la pharmacologie multidirectionnelle qui vise à révéler des relations de réseau complexes entre plusieurs médicaments et maladies13. Les prescriptions traditionnelles chinoises ont les caractéristiques d’être multi-composants et multi-cibles, ce qui signifie qu’elles sont très appropriées pour l’étude de la pharmacologie de réseau14,15. Récemment, la pharmacologie de réseau est apparue comme une approche puissante dans l’étude des formules de MTC et est devenue un point chaud de la recherche16,17.
Cependant, à notre connaissance, toutes les recherches sur la pharmacologie des réseaux sont présentées sous forme de texte. Présenter cette technologie par vidéo réduira considérablement le seuil d’apprentissage et facilitera la promotion de cette technologie, ce qui est l’un des avantages de cet article. Dans cette étude, nous avons pris Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contre l’adénocarcinome pulmonaire comme exemple pour effectuer la prédiction pharmacologique en réseau et la validation expérimentale.

<table><tbody><tr><td>0,25 % trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>R001100</td><td></td></tr><tr><td>A549 lignée cellulaire</td><td>Procell</td><td>CL-0016</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps AKT</td><td>CST</td><td>4691S</td><td></td></tr><tr><td>BCA Kit de dosage des protéines</td><td>Solarbio</td><td>PC0020</td><td></td></tr><tr><td>Système de détection par chimiluminescence</td><td>Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory</td><td>ChemiScope 6100</td><td></td></tr><tr><td>Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM)</td><td>Solarbio</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Kit de chimiluminescence améliorée (ECL)</td><td>ABclonal</td><td>RM00021</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>ScienCell</td><td>0025</td><td></td></tr><tr><td>HRP Chèvre Anti-Lapin IgG (H+L)</td><td>ABclonal</td><td>AS014</td><td></td></tr><tr><td>MTS kit de dosage</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td></td></tr><tr><td>p-AKT</td><td>anticorps CST</td><td>6040S</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline streptomycine</td><td>Gibco</td><td>C14-15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF)</td><td>Solarbio</td><td>P0100</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la phosphatase</td><td>Beyotime</td><td>P1081</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td></td></tr><tr><td>Membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF)</td><td>Millipore</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Solution de lyse</td><td>Solarbio</td><td>R0010</td><td></td></tr><tr><td>Évaporateur rotatif</td><td>Shanghai Yarong Biochemical Instrument Factory</td><td>RE52CS-1</td><td></td></tr><tr><td>Mécanisme de lyophilisation sous vide</td><td>Ningbo Scientz Biotechnology</td><td>SCIENTZ-10</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-Actin</td><td>anticorps ABclonal</td><td>AC026</td><td></td></tr></tbody></table>

prédiction pharmacologique en réseau et validation expérimentale du mécanisme d’action de trichosanthes-fritillaria thunbergii contre l’adénocarcinome pulmonaire

Network Pharmacology Prediction and Experimental Validation of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii Action Mechanism Against Lung Adenocarcinoma

Notre objectif était d’étudier le mécanisme de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii dans le traitement de l’adénocarcinome pulmonaire (LUAD) sur la base de la pharmacologie de réseau et de la vérification expérimentale. Les composants efficaces et les cibles potentielles de Trichosanthis et Fritillaria thunbergii ont été collectés par la base de données expérimentale à haut débit et guidée par référence (HERB) de la médecine traditionnelle chinoise et une base de données d’approche d’ensemble de similarité (SEA), et les cibles liées à LUAD ont été interrogées par les bases de données GeneCards et Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Un réseau médicament-composant-maladie-cible a été construit par le logiciel Cytoscape. Le réseau d’interaction protéine-protéine (PPI), la fonction d’ontologie génique (GO) et les analyses d’enrichissement des voies de l’encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) ont été effectués pour obtenir des cibles principales et des voies clés. Un extrait aqueux de cellules Trichosanthes-Fritillaria thunbergii et A549 a été utilisé pour la validation expérimentale ultérieure. Grâce à la base de données HERB et à la recherche documentaire, 31 composés efficaces et 157 gènes cibles potentiels de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii ont été examinés, dont 144 étaient des cibles régulatrices de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii dans le traitement de l’adénocarcinome pulmonaire. L’analyse de l’enrichissement fonctionnel GO a montré que le mécanisme d’action de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contre l’adénocarcinome pulmonaire est principalement la phosphorylation des protéines. L’analyse d’enrichissement de la voie KEGG suggère que le traitement de l’adénocarcinome pulmonaire par Trichosanthes-Fritillaria thunbergii implique principalement la voie de signalisation PI3K/AKT. La validation expérimentale a montré qu’un extrait aqueux de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii pouvait inhiber la prolifération des cellules A549 et la phosphorylation de l’AKT. Grâce à la pharmacologie en réseau et à la validation expérimentale, il a été vérifié que la voie de signalisation PI3K / AKT joue un rôle essentiel dans l’action de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii dans le traitement de l’adénocarcinome pulmonaire.

Au total, 31 composants actifs liés à Trichosanthes-Fritillaria thunbergii ont été identifiés, dont 21 Trichosanthes et 10 Fritillaria thunbergia, ainsi que 144 cibles correspondantes. Au total, 9 049 et 67 gènes liés à LUAD ont été extraits de la base de données GeneCards et de la base de données OMIM, respectivement. Après suppression des gènes dupliqués, 9 057 gènes liés à LUAD ont été identifiés. L’intersection des gènes liés à LUAD et des cibles liées au composant actif de Trichosanth...

Cette étude révèle le mécanisme de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii dans le traitement de l’adénocarcinome pulmonaire basé sur la pharmacologie de réseau et la vérification expérimentale. L’étude démontre également que la voie de signalisation PI3K / AKT joue un rôle essentiel dans l’action de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii dans le traitement de l’adénocarcinome pulmonaire.

Prédiction pharmacologique en réseau et validation expérimentale du mécanisme d’action de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contre l’adénocarcinome pulmonaire

We aimed to study the mechanism of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii in treating lung adenocarcinoma (LUAD) based on network pharmacology and ...

Médecine traditionnelle chinoise, Nous parlerons des caractéristiques de multicomposant de la cible. Ce qui est la boîte de base pour la recherche en réseau et biologique. Nous avons fait une démonstration de la technologie qui réduira le seuil.Network Pharmacological est une technologie analytique systématique, construit les outils de travail de réseau d’interaction de multifacteurs. Il peut prédire efficacement la voie unique de la médecine traditionnelle chinoise dans Les données de Network Pharmacological proviennent de la base de données, bien qu’il ne puisse pas prédire la relation avec les médicaments, les protéines, et cela doit encore être vérifié par des expériences ultérieures. Pour commencer, ouvrez la base de données HERB et utilisez Gua Liu et Zhebimu comme mots-clés pour obtenir les composants des deux médicaments.Téléchargez la liste et la structure SMILES canonique des composants associés des deux médicaments. Déterminez maintenant si le composant obtenu est actif en incluant les composants ayant une biodisponibilité orale et des valeurs analogues à celles d’un médicament dans la base de données du groupe HERB. Si le composant n’a pas de biodisponibilité orale et de valeurs médicamenteuses, entrez le composant dans la base de données suisse ADME pour obtenir les informations sur chaque composant.Inclure les composants ayant une absorption gastro-intestinale élevée et au moins deux valeurs semblables à celles d’un médicament oui en tant que composants actifs. Pour prédire la cible des composants actifs, ouvrez la base de données HERB. Recherchez et copiez les structures SMILES canoniques des composants actifs.Ouvrez ensuite l’approche d’ensemble de similarité et collez les structures SMILES canoniques des composants actifs dans la zone de recherche. Cliquez sur try SEA' pour obtenir la valeur P du nom de cible de la clé cible et le TC maximum de chaque composant actif. Copiez les données dans une feuille de calcul et utilisez la fonction de filtrage des fichiers de feuille de calcul pour filtrer les cibles des composants actifs par clé cible.Copiez toutes les cibles dans une feuille de calcul et supprimez les doublons pour obtenir les cibles médicamenteuses. Ouvrez maintenant la base de données des cartes génétiques et l’héritage mendélien en ligne chez l’homme pour prédire les cibles de la maladie. Utilisez Adénocarcinome pulmonaire comme mot-clé pour obtenir les cibles de la maladie de l’adénocarcinome pulmonaire.Téléchargez les feuilles de calcul des cibles de la maladie et supprimez les cibles répétées, pour obtenir les cibles de l’adénocarcinome pulmonaire. Construisez un réseau de cibles de maladies constitutives d’un médicament en copiant les cibles liées à l’adénocarcinome pulmonaire et les cibles médicamenteuses dans la même colonne, dans une nouvelle feuille de calcul. Utilisez la fonction d’identification des doublons de données, dans la barre d’outils pour obtenir des cibles d’intersection des cibles liées à l’adénocarcinome pulmonaire et des cibles liées au composant actif de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia.Ouvrez Cytoscape 3.8.0. Cliquez sur Fichier dans la barre de menus et sélectionnez Importer. Suivi par le réseau à partir du fichier.Pour importer le fichier de feuille de calcul, optimisez la taille et la couleur des nœuds du réseau via la barre de style située dans le panneau de configuration de gauche. Utilisez la fonction d’analyse du réseau pour l’analyse de la topologie du réseau. Cliquez sur Outils dans la barre de menus et sélectionnez Analyser le réseau.Dans le panneau du tableau, cliquez sur le degré dans la barre de titre pour organiser les composants par degré par ordre décroissant. Prenez les 10 principaux composants et cibles comme principaux composants actifs et cibles principales. Construire le réseau PPI et cribler les protéines de base.Ouvrez la base de données de chaînes et collez la liste au format texte des cibles potentielles de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia, contre les adénocarcinomes pulmonaires dans la boîte de dialogue de la liste des noms. Ensuite, sélectionnez les homosapiens dans les organismes. Cliquez sur les boutons de recherche et sélectionnez continuer, lorsque les résultats sont disponibles, cliquez sur paramètres et cochez confiance élevée 0,700 Dans les paramètres de base, sous le score d’interaction minimum requis, cochez les nœuds déconnectés élevés du réseau, dans les paramètres avancés.Cliquez ensuite sur le bouton de mise à jour. Ensuite, cliquez sur les exportations dans la barre de titre et téléchargez le court texte tabulaire de la relation PPI au format TSV. Ouvrez Cytoscape 3.8.0.Cliquez sur fichier, sélectionnez, importez, puis sur le réseau à partir du fichier pour importer le fichier au format TSV pour une analyse visuelle. Utilisez la fonction d’analyseur de réseau pour effectuer l’analyse topologique. Optimisez la taille et la couleur des nœuds réseau via la barre de style située dans le panneau de configuration de gauche.Effectuez l’analyse d’enrichissement KEGG en ouvrant la plateforme Medscape, en collant la liste au format texte des cibles thérapeutiques potentielles dans la boîte de dialogue, puis en cliquant sur le bouton soumettre. Cochez Homo sapiens à la fois en entrée en tant qu’espèce et en analyse en tant qu’espèce, puis cliquez sur le bouton d’analyse personnalisée. Sélectionnez l’enrichissement.Cochez uniquement la voie KEGG, puis cliquez sur analyse d’enrichissement. Une fois que la barre de progression atteint 100%, cliquez sur le bouton orange de la page du rapport d’analyse pour les résultats de l’enrichissement. Cliquez sur tout en un fichier zip pour télécharger le résultat de l’enrichissement, puis ouvrez le fichier _FINAL_GO’csv dans le dossier Enrichment_GO' pour obtenir le résultat.Ouvrez R-Software et tapez install package GG plot two’and library GG Plot two’in R Pour l’installation du paquet GG plot two R. Appuyez sur Entrée pour exécuter le programme de visualisation KEGG. Pour détecter la viabilité cellulaire, digérer les cellules logarithmiques de la phase de croissance A 549 avec un millilitre de 0,25% de trypsine pendant une minute à 37 degrés Celsius.Ajouter un millilitre de DMEM Milieu Complet pour neutraliser la trypsine et souffler doucement pour favoriser l’excrétion cellulaire. Ensuite, centrifuger le mélange pour obtenir la pastille cellulaire et remettre en suspension les cellules obtenues, en utilisant DMEM Complete Medium. Ajouter la suspension cellulaire à un hémocytomètre et compter à l’aide d’un compteur de cellules automatisé, diluer à cinq fois 10 à la quatrième cellule par millilitre, en utilisant le milieu complet DMEM Maintenant, dissoudre un gramme d’extrait d’eau de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia dans 10 millilitres de PBS et le filtrer stériliser à travers un filtre de 0,22 micromètre.Diluer le mélange à différentes concentrations à l’aide de PBS. Plaquer 100 microlitres des cellules diluées dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Après l’adhérence cellulaire, ajoutez un microlitre d’extraits d’eau de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia de différentes concentrations pour ajuster la concentration de chaque puits.Jeter le milieu d’origine après 24 heures de culture et ajouter 100 microlitres de DMEM. Milieu de base pour une incubation ultérieure pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. À la fin de l’incubation, ajoutez 20 microlitres de solution de MTS et incuber les cellules pendant une heure supplémentaire.Transférer le mélange incubé dans une assiette différente. À l’aide d’un lecteur de microplaques, mesurez l’absorbance à une longueur d’onde de 490 nanomètres et calculez la viabilité cellulaire. Diluer la phase de croissance logarithmique A 549 cellules à cinq fois 10 à la cinquième cellule par millilitre.Ajouter deux millilitres de la suspension cellulaire à une plaque de six puits et cultiver pendant 12 heures. Après avoir obtenu différentes dilutions PBS de l’extrait d’eau de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia comme démontré précédemment, ajouter 20 microlitres de la solution PBS au groupe témoin blanc et 20 microlitres des différentes dilutions de l’extrait d’eau de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia à différents groupes de concentration. Après 24 heures d’intervention, jetez le surnageant et nettoyez les cellules avec du PBS trois fois.Ajouter 250 microlitres de tampon RIPA à chaque puits et lyser les cellules pendant 30 minutes. Recueillir le lysat pour la centrifugalisation et obtenir le surnageant. Le réseau d’interaction cible de la maladie composant médicamenteuse de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia contre l’adénocarcinome pulmonaire est montré.Dans le réseau d’interaction, Les 10 principaux composants actifs obtenus sont les composants actifs clés de l’action de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia dans le traitement de l’adénocarcinome pulmonaire. Le réseau PPI comprenait 122 protéines fonctionnelles et 210 relations d’interaction. Les 10 principales protéines de base sont principalement impliquées dans la néovascularisation, la prolifération cellulaire, l’apoptose et le transport de la membrane cellulaire.Parmi les 20 premières voies classées par KEGG, la voie de signalisation PI3K-AKT, la voie de signalisation Rap1, la voie de signalisation Phospholipase-D et la voie de signalisation MAPK1 sont étroitement associées au cancer du poumon, parmi lesquelles la voie PI3K-AKT s’est classée au premier rang. Les extraits de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia à des concentrations supérieures à 400 microgrammes par millilitre pouvaient inhiber la prolifération cellulaire et l’effet inhibiteur sur les cellules A-549 à des concentrations allant jusqu’à 800 microgrammes par millilitre, était proche de la moitié de la concentration inhibitrice. L’intervention des extraits de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia n’a entraîné aucun changement significatif dans l’expression de la protéine AKT dans chaque groupe.Cependant, l’expression de p-AKT Serine-473 a été inhibée et a montré un effet dose-dépendant. Les composants critiques de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia ont été amarrés moléculairement aux protéines clés de la voie PI3K AKT, et les résultats ont suggéré que les énergies de liaison de Diosmetin et Kaempferol avec AKT1 étaient inférieures à moins sept, indiquant une forte activité de liaison. Le plus important est d’avoir atteint des ingrédients actifs sur les cibles de la médecine traditionnelle chinoise.Ainsi que les cibles de ce qui est le cœur de Network Pharmacological.

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