AMEBaS : Extraction automatique de la ligne médiane et soustraction de l’arrière-plan des time-lapses de fluorescence ratiométrique de cellules uniques polarisées

Cette méthode quantifie la dynamique spatio-temporelle des cellules polarisées le long de leur ligne médiane exprimant un rapporteur fluorescent ou un colorant pour une entité d’intérêt spécifique telle que l’actine, les ions ou la dynamique des vésicules. La version de l’automatisation élimine les biais et permet l’évolutivité, en particulier pour les tâches qui sont effectuées numériquement manuellement et qui peuvent devenir chronophages et subjectives. Pour commencer, ouvrez Jupyter Notebook et lisez les fichiers time-lapse, soit en accédant à la page d’accueil interactive du bloc-notes Google CoLab, soit en téléchargeant et en ouvrant le AMEBaS_local IP YNB à partir de GitHub.

Pour préparer la configuration du répertoire pour les données d’entrée et de sortie à l’aide de la version locale, placez le time-lapse de fluorescence sous forme de fichier TIF ou DV dans un dossier nommé data situé dans le dossier racine du programme. Créez un dossier de sortie pour recevoir les données générées, puis exécutez le bloc de code d’installation. Si vous utilisez le bloc-notes sur Google CoLab, exécutez le bloc de code d’installation pour générer automatiquement des données et des dossiers, puis exécutez le bloc de code d’entrée de fichier pour lire les données time-lapse en cliquant sur le bouton de lecture.

Si vous utilisez Google CoLab, téléchargez le fichier time-lapse dans le dossier de données en cliquant sur le bouton Choisir un fichier. Ensuite, choisissez de générer des sorties supplémentaires pour chaque étape en définissant le paramètre verbose sur true ou false. Pour détecter la cellule principale et le segment de l’arrière-plan, exécutez le bloc de code de segmentation d’une cellule unique en cliquant sur le bouton de lecture pour séparer automatiquement la cellule d’intérêt de l’arrière-plan.

Ajustez la valeur sigma dans la variable sigma pour affiner le lissage du masque de segmentation. La valeur par défaut est 2.0. Définissez maintenant l’estimation de la variable sur false pour stocker le seuil estimé directement à partir des données ISO, ou sur true pour le lisser sur les images voisines à l’aide de la régression polynomiale locale.

Ajustez la variable n_points pour affiner la fonction, la valeur par défaut étant 40. Pour tracer la ligne médiane le long de l’extension de cellule, exécutez le bloc de code de traçage de la ligne médiane de la cellule en cliquant sur le bouton de lecture pour squelettiser la cellule à l’aide de la méthode de Lee et étendre la pointe du dernier squelette par extrapolation linéaire. Ensuite, sélectionnez l’option de traçage pour la ligne médiane en ajustant l’argument complete_skeletonization pour tracer sur la dernière image ou une fois par image.

Ajustez la variable interpolation_fraction pour définir la fraction de points dans le squelette pour l’interpolation lors de l’extrapolation. La valeur par défaut est 0,25. Ensuite, modifiez la variable extrapolation_length pour déterminer la longueur de l’extrapolation médiane.

La valeur par défaut est moins un, ce qui étend le squelette jusqu’à l’arête la plus proche. Exécutez maintenant le premier bloc de code de visualisation de données en cliquant sur le bouton de lecture pour générer automatiquement des kymographes pour les deux canaux. Choisissez la taille du noyau gaussien pour le lissage en ajustant la variable kymograph_kernel.

Pour afficher correctement les intensités des squelettes non étendus, une carte de couleurs personnalisée est nécessaire pour leurs kymographes coiffés. Ajustez la variable shift_fraction pour choisir le pourcentage de fraction d’intensité qui sera désigné comme couleur d’arrière-plan, le noir. Exécutez ensuite le deuxième bloc de code de visualisation de données en cliquant sur le bouton de lecture pour générer automatiquement un kymographe de métrique de ratio et un time-lapse.

Ajustez la variable switch_ratio pour modifier l’ordre des canaux utilisés comme numérateur et dénominateur lors des calculs de ratio, la valeur par défaut étant false. Vérifiez si le laps de temps de ratio nécessite un lissage supplémentaire avec un passage de filtre médian en ajustant la variable smooth_ratio. Par défaut, cette valeur est définie sur false.

Ensuite, choisissez de supprimer ou de conserver les valeurs aberrantes résultant d’un signal faible dans le canal du dénominateur en ajustant la variable reject_outliers. Les valeurs aberrantes sont marquées comme des valeurs égales à 1,5 fois l’intervalle interquartile au-dessus du troisième quartile. Enfin, choisissez si la sortie de la métrique d’arrière-plan et de ratio doit être exportée en ajustant la variable background_ratio.

La valeur par défaut est false pour remplacer l’arrière-plan par des zéros. L’AMEBaS a été testé sur des ensembles de données tels que des tubes polliniques exprimant le rapporteur calcique caméléon, des tubes polliniques exprimant le florin indicateur de pH, des poils racinaires exprimant le rapporteur calcique NESYC 3.6 a fonctionné avec succès malgré les différences dans la direction de croissance, les techniques d’imagerie, les rapporteurs fluorescents et les types de cellules. N’oubliez pas d’exécuter l’ensemble de blocs afin de pouvoir installer les paquets requis.

De plus, il est essentiel d’ajuster les valeurs sigma spécifiquement pour vos images afin d’obtenir des résultats plus précis. Les kymographes qui en résultent peuvent ensuite être utilisés pour analyser la dynamique spatio-temporelle de l’intérêt de résolution. De plus, vous pouvez le calculer en trouvant la méthode, la croissance et les séries chronologiques pour analyser la bonne solution.