Name: Infection de cellules épithéliales nasales primaires cultivées à l’interface air-liquide pour caractériser les interactions entre le coronavirus humain et l’hôte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Découvrez comment infecter des cellules épithéliales nasales primaires en culture interface air-liquide pour étudier les interactions entre coronavirus humains et hôte. Cette méthode permet d'analyser la cinétique de réplication et les réponses immunitaires innées.

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Cette étude bénéficie des sources de financement suivantes : National Institutes of Health (NIH) R01AI 169537 (S.R.W. et N.A.C.), NIH R01AI 140442 (S.R.W.), VA Merit Review CX001717 (N.A.C.), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. et N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens (S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation (S.R.W. et N.A.C.), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).

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</ol>

Susan Weiss est membre du conseil consultatif scientifique d’Ocugen. Noam A. Cohen est consultant pour GSK, AstraZeneca, Novartis, Sanofi/Regeron et Oyster Point Pharmaceuticals et détient un brevet américain, « Therapy and Diagnostics for Respiratory Infection » (10 881 698 B2, WO20913112865), ainsi qu’un accord de licence avec GeneOne Life Sciences.

Les méthodes détaillées ici décrivent un système de culture épithéliale primaire dans lequel des cellules épithéliales nasales dérivées de patients sont cultivées à une interface air-liquide et appliquées à l’étude des interactions HCoV-hôte. Une fois différenciées, ces cultures nasales d’ALI récapitulent de nombreuses caractéristiques de l’épithélium nasal in vivo , y compris une population cellulaire hétérogène avec des cellules ciliées, caliciformes et basales représentées, ainsi qu’une fonction mucociliaire ...

Sept coronavirus humains (HCoV) ont été identifiés à ce jour et provoquent une série de maladies respiratoires2. Les HCoV courants ou saisonniers (HCoV-NL63, -229E, -OC43 et -HKU1) sont généralement associés à une pathologie des voies respiratoires supérieures et causent environ 10 à 30 % des cas de rhume chaque année. Bien qu’il s’agisse du phénotype clinique typique associé aux HCoV courants, ces virus peuvent causer des maladies des voies respiratoires inférieures plus importantes dans les populations à risque, y compris les enfants, les personnes âgées et les personnes immunodéprimées 3,4. Au cours des 20 dernières années, trois HCoV pathogènes ont émergé et causé d’importantes urgences de santé publique, notamment le syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS)-CoV, le syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS)-CoV et le SRAS-CoV-2. Les HCoV létaux sont associés à une pathologie plus sévère des voies respiratoires, ce qui est clairement illustré par le taux de létalité de >34 % associé aux cas de MERS-CoV (894 décès pour plus de 2 500 cas depuis son apparition en 2012)5,6. Il est important de noter que les HCoV mortels causent également toute une série de maladies des voies respiratoires, allant des infections asymptomatiques à la pneumonie mortelle, comme on l’a vu avec la pandémie de COVID-19 en cours7.
Les HCoV, comme d’autres agents pathogènes respiratoires, pénètrent dans les voies respiratoires et établissent une infection productive dans l’épithélium nasal8. On pense que la propagation aux voies respiratoires inférieures est associée à l’aspiration de la cavité buccale/nasale vers le poumon, où les HCoV provoquent une pathologie plus importante des voies respiratoires inférieures 9,10,11. Ainsi, le nez sert de porte initiale pour l’entrée virale et constitue la principale barrière à l’infection grâce à sa robuste machinerie de clairance mucociliaire et à ses mécanismes immunitaires innés uniques visant à empêcher la propagation virale vers les voies respiratoires inférieures12,13. Par exemple, il a été rapporté que les cellules épithéliales nasales expriment des niveaux basaux plus élevés que la moyenne d’interférons antiviraux et de gènes stimulés par l’interféron, ce qui indique que les cellules nasales peuvent être préparées à des réponses précoces aux virus respiratoires14,15,16.
Nous avons déjà utilisé des cellules épithéliales nasales primaires dérivées de patients cultivées à l’interface air-liquide (ALI) pour modéliser les interactions HCoV-hôte dans le nez, où les infections HCoV commencent. Les cultures nasales d’ALI sont permissives pour les HCoV pathogènes (SRAS-CoV-2 et MERS-CoV) et communs (HCoV-NL63 et HCoV-229E) et offrent divers avantages par rapport aux lignées cellulaires épithéliales traditionnelles des voies respiratoires telles que A549 (une lignée cellulaire d’adénocarcinome pulmonaire)16,17. Après différenciation, les cultures nasales d’ALI contiennent une population cellulaire hétérogène et présentent de nombreuses fonctions attendues de l’épithélium nasal in vivo, telles que la machinerie de clairance mucociliaire18. Les cellules nasales offrent également des avantages par rapport aux systèmes de culture des voies respiratoires inférieures (tels que les cellules épithéliales bronchiques humaines, HBEC), car l’acquisition de cellules épithéliales nasales par brossage cytologique est nettement moins invasive que l’utilisation de techniques telles que la bronchoscopie pour atteindre les HBECs 19,20,21.
Cet article décrit les méthodes d’utilisation de ce système de culture ALI nasale pour caractériser les interactions HCoV-hôte dans l’épithélium nasal. Nous avons appliqué ces méthodes dans des travaux récemment publiés pour comparer le SARS-CoV-2, le MERS-CoV, le HCoV-NL63 et le HCoV-229E 1,16,17. Bien que ces méthodes et ces résultats représentatifs mettent l’accent sur l’étude des HCoV dans ce modèle de cellules nasales, le système est hautement adaptable à d’autres HCoV, ainsi qu’à d’autres agents pathogènes respiratoires. De plus, ces méthodes peuvent être appliquées plus largement à d’autres systèmes de culture ALI afin d’étudier la réplication virale et le tropisme cellulaire, ainsi que la cytotoxicité et l’induction immunitaire innée après l’infection.

<table><tbody><tr><td>Anticorps secondaires Alexa Fluor (488, 594, 647)</td><td>Invitrogen</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albumine sérique bovine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete mini inhibiteur de protéase sans EDTA</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Roche Kit de détection de cytotoxicité</td><td>Roche</td><td>11644793001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Media)</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco)</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>DPBS + calcium + magnésium</td><td>Gibco</td><td>14040-117</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de mesure Endohm-6G</td><td>World Precision Instruments</td><td>ENDOHM-6G</td><td></td></tr><tr><td>Marqueur d’adhésion des cellules épithéliales (EpCAM ; CD326)</td><td>eBiosciences</td><td>14-9326-82</td><td></td></tr><tr><td>Compteur épithélial Volt/Ohm (TEER) (EVOM)</td><td>World Precision Instruments</td><td>300523</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Sérum de Bovin Fœtal)</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW Logiciel d’imagerie</td><td>Olympus</td><td>Version 4.02</td><td></td></tr><tr><td>HCoV-NL63 (Coronavirus humain, NL63)</td><td>Ressources BEI</td><td>NR-470</td><td></td></tr><tr><td>HCoV-NL63 nucléocapside</td><td>anticorps Sino Biological</td><td>40641-V07E</td><td></td></tr><tr><td>Coloration de Hoescht</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’échantillon Laemmli (4x)</td><td>BIO-RAD</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>LLC-MK2 cellules</td><td>ATCC</td><td>CCL-7</td><td>Pour titrer HCoV-NL63</td></tr><tr><td>MERS-CoV (Coronavirus humain, Coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV), EMC/2012)</td><td>Ressources BEI&nbsp ;</td><td>NR-44260</td><td></td></tr><tr><td>MERS-CoV Anticorps nucléocapside</td><td>Sino Biological</td><td>40068-MM10</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps MUC5AC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AMAB91539</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Fluoview Microscope confocal</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 647</td><td>stain Abcam</td><td>ab176759</td><td></td></tr><tr><td>PhosStop easy pack (inhibiteurs de la phosphatase)&nbsp ;</td><td>Roche</td><td>PHOSS-RO</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques&nbsp ;</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH34000000</td><td>Tout lecteur de plaques ou lecteur ELISA est suffisant ; doit être capable de lire l’absorbance à 492 nm</td></tr><tr><td>de tampon RIPA (50 mM Tris pH 8 ; 150 mM NaCl ; 0,5 % désoxycholate ; 0,1 % SDS ; 1 % NP40)</td><td>Thermo Fisher</td><td>89990</td><td>Peut préparer en interne ou acheter</td></tr><tr><td>RNeasy Plus Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020)</td><td>Ressources BEI</td><td>NR-52281</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-nucléocapside du SRAS-CoV-2</td><td>Genetex</td><td>GTX135357</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151100</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-tubuline de type IV</td><td>Abcam</td><td>ab11315</td><td></td></tr><tr><td>Cellules VeroCCL81</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td>Pour titrer les cellules MERS-CoV</td></tr><tr><td>VeroE6</td><td>ATCC</td><td>CRL-1586</td><td>Pour titrer le SARS-CoV-2</td></tr></tbody></table>

infection de cellules épithéliales nasales primaires cultivées à l’interface air-liquide pour caractériser les interactions entre le coronavirus humain et l’hôte

Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions

Trois coronavirus humains hautement pathogènes (HCoV) - le SRAS-CoV (2002), le MERS-CoV (2012) et le SRAS-CoV-2 (2019) - ont émergé et provoqué d’importantes crises de santé publique au cours des 20 dernières années. Quatre autres HCoV sont à l’origine d’une part importante des cas de rhume chaque année (HCoV-NL63, -229E, -OC43 et -HKU1), ce qui souligne l’importance d’étudier ces virus dans des systèmes physiologiquement pertinents. Les HCoV pénètrent dans les voies respiratoires et établissent l’infection dans l’épithélium nasal, le site principal rencontré par tous les agents pathogènes respiratoires. Nous utilisons un système de culture épithéliale nasale primaire dans lequel des échantillons nasaux dérivés de patients sont cultivés à une interface air-liquide (ALI) pour étudier les interactions hôte-pathogène sur cet important site sentinelle. Ces cultures récapitulent de nombreuses caractéristiques des voies respiratoires in vivo , y compris les types de cellules présentes, la fonction ciliaire et la production de mucus. Nous décrivons des méthodes pour caractériser la réplication virale, le tropisme de la cellule hôte, la cytotoxicité induite par le virus et l’induction immunitaire innée dans les cultures nasales d’ALI après une infection par HCoV, en utilisant des travaux récents comparant les HCoV létaux et saisonniers comme exemple1. Une meilleure compréhension des interactions hôte-pathogène dans le nez a le potentiel de fournir de nouvelles cibles pour les thérapies antivirales contre les HCoV et d’autres virus respiratoires qui émergeront probablement à l’avenir.

Les figures représentatives sont partiellement adaptées des données que l’on peut trouver dans le manuscrit Otter et al.1. Les cultures nasales d’ALI provenant de quatre ou six donneurs ont été infectées par l’un des quatre HCoV (SRAS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 et HCoV-229E) selon les protocoles décrits ci-dessus, et les titres viraux moyens excrétés apicalement pour chaque virus sont représentés à la figure 1A. Alors que ces quatre HCoV se répliquent de manière produ...

L’épithélium nasal est le principal site barrière rencontré par tous les agents pathogènes respiratoires. Ici, nous décrivons des méthodes pour utiliser des cellules épithéliales nasales primaires cultivées sous forme de cultures d’interface air-liquide (ALI) pour caractériser les interactions entre le coronavirus humain et l’hôte dans un système physiologiquement pertinent.

Infection de cellules épithéliales nasales primaires cultivées à l’interface air-liquide pour caractériser les interactions entre le coronavirus humain et l’hôte

Three highly pathogenic human coronaviruses (HCoVs) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012), and SARS-CoV-2 (2019) - have emerged and caused significant public ...

Les protocoles décrits ici abordent des questions clés telles que la cinétique de réplication, le tropisme de la cellule hôte, l’induction immunitaire innée et l’induction de la cytotoxicité dans l’épithélium nasal lors d’infections par des coronavirus humains. Ce protocole permet d’étudier les interactions de l’hôte du coronavirus humain dans un microenvironnement organoïde qui récapitule étroitement les caractéristiques de l’épithélium nasal in vivo, y compris sa population cellulaire hétérogène et ses fonctions mucociliaires. Cette technique peut être appliquée à d’autres systèmes de culture d’IALA tels que ceux dérivés des voies respiratoires inférieures.De plus, le système peut être utilisé pour imiter des états pathologiques cliniques tels que l’asthme ou la mucoviscidose. Développer et différencier l’interface nasale-air-liquide, ou cultures ALI, dans les transpuits ayant une chambre basale et une chambre apicale. Développer les cellules sinonasales humaines dissociées dans des conditions immergées, après quoi retirer le milieu de la chambre apicale pour permettre la différenciation des cultures dans une interface air-liquide.La veille de l’infection, laver les cultures d’AL

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette méthode permet la caractérisation des bactéries étendu co-culture avec EpiAirways, des tissus humains primaires épithéliales respiratoires grandi à l'interface air-liquide, une biologiquement...

L&#39;utilisation du modèle EpiAirway pour Caractériser long terme Interactions hôte-pathogène

Nous décrivons l'isolement rapide des primaires murins cellules alvéolaires de type II épithéliales (AECII) par flux cytométrique sélection négative. Ceux-ci montrent AECII viabilité et à la pureté et conviennent à un large éventail d'études fonctionnelles et moléculaires concernant leur rôle dans les affections respiratoires comme les maladies auto-immunes ou infectieuses.

Isolation par cytométrie en flux des cellules primaires murins épithéliales alvéolaires de type II pour les études fonctionnelles et moléculaires

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Source :  Otter, C. J., et al. Infection de cellules épithéliales nasales primaires cultivées à l'interface air-liquide pour caractériser les interactions entre le coronavirus humain et l'hôte. J. Vis. Exp. (2023)Ce vidéo montre la croissance du coronavirus dans des cellules épithéliales nasales humaines cultivées à une interface air-liquide, imitant l'infection et la réplication virale dans la cavité nasale humaine.

Croissance virale dans des cellules épithéliales nasales humaines cultivées à l'interface air-liquide

Les constatations et conclusions présentées dans ce rapport sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues des Centers for Disease Control and Prevention.

L&#39;établissement d&#39;une culture liquide recouvert de Airway humaines épithéliales polarisées cellules Calu-3 pour étudier la réponse cellulaire aux agents pathogènes respiratoires hôte<em&gt; In vitro</em

Cellules épithéliales nasales, obtenues par grattage superficiel de la biopsie des volontaires humains, sont expansées et transférées sur des inserts de culture tissulaire. Après avoir atteint la confluence, les cellules sont cultivées à l'interface air-liquide, ce qui donne des cultures de cellules ciliées et non ciliées. Cultures de cellules épithéliales nasales différenciées fournissent des modèles expérimentaux viables pour l'étude de la muqueuse respiratoire.

Culture de cellules humaines épithéliales nasales à l&#39;interface Air Liquide

Le virus respiratoire syncytial humain (HRSV) peut provoquer une bronchiolite sévère chez les jeunes nourrissons. Une partie de la pathogenèse de la maladie grave du VRSL est causée par la réponse immunitaire de l’hôte. La stimulation des cellules immunitaires humaines primaires avec le HRSV fournit un système modèle rapide et reproductible pour étudier l’activation des voies inflammatoires et l’infection.

Un modèle in vitro pour étudier les réponses immunitaires des cellules mononucléées du sang périphérique humain à l’infection par le virus respiratoire syncytial humain

Nous décrivons un protocole pour un modèle tridimensionnel de co-culture des voies respiratoires infectées, utilisant CFBE41o- cellules, macrophages THP-1, et Pseudomonas aeruginosa, établi à l’interface air-liquide. Ce modèle fournit une nouvelle plate-forme pour tester simultanément l’efficacité antibiotique, la fonction de barrière épithéliale, et les marqueurs inflammatoires.

P. aeruginosa Co-culture 3D infectée des cellules épithéliales bronchiques et des macrophages à l’interface air-liquide pour l’évaluation préclinique des anti-infectieux

Ce protocole détaille une étude des interactions précoces entre les cellules épithéliales nasales infectées par le virus et l’activation des cellules innées. Des sous-ensembles individuels de cellules immunitaires peuvent être distingués en fonction de leur activation en réponse à des infections virales. Ils peuvent ensuite être étudiés plus avant pour déterminer leurs effets sur les réponses antivirales précoces.

Modèle de co-culture sans contact pour l’étude de l’activation des cellules immunitaires innées au cours d’une infection virale respiratoire

Nous décrivons ici l’isolement, l’amplification et la différenciation des cellules primaires de l’épithélium nasal humain (HNE) à l’interface air-liquide et un protocole de biobanque permettant de congeler avec succès puis de décongeler l’HNE amplifiée. Le protocole analyse les propriétés électrophysiologiques des cellules HNE différenciées et la correction de la sécrétion de chlorure liée au CFTR sur différents traitements modulateurs.

Cellules épithéliales nasales humaines primaires : la biobanque dans le contexte de la médecine de précision

Cet article décrit la génération d’un modèle complexe de barrière respiratoire multicellulaire composé d’épithélium pulmonaire, de mésenchyme, de cellules endothéliales et de macrophages dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) dans une culture d’interface air-liquide.

Co-culture de cellules épithéliales, mésenchymateuses, endothéliales et immunitaires dérivées d’iPSC pour modéliser l’intégrité de la barrière des voies respiratoires dans la santé et les maladies pulmonaires

Découvrez comment infecter des cellules épithéliales nasales primaires en culture interface air-liquide pour étudier les interactions entre coronavirus humains et hôte. Cette méthode permet d'analyser la cinétique de réplication et les réponses immunitaires innées.

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Infection de cellules épithéliales nasales primaires cultivées à l’interface air-liquide pour caractériser les interactions entre le coronavirus humain et l’hôte

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