Name: Analyse de la morphologie mitochondriale par simulation d’apprentissage supervisé (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T12:05:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Découvrez une méthode d'apprentissage supervisé par simulation pour analyser automatiquement la morphologie mitochondriale en microscopie à fluorescence sur cellules fixes. Cette approche élimine l'annotation manuelle et améliore la précision de la segmentation.

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Les auteurs prennent acte de la discussion avec Arif Ahmed Sekh. Zambarlal Bhujabal est reconnu pour avoir aidé à construire les cellules H9c2 stables. Nous reconnaissons le financement suivant : la subvention de démarrage du CER n° 804233 (à K.A.), la subvention n° 325741 (à D.K.P.), la subvention n° HNF1449-19 (Å.B.B.) et le projet de financement thématique de l’UIT VirtualStain avec Cristin Project ID 2061348 (D.K.P., Å.B.B., K.A. et A.H.).

<ol><li>Sekh, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physics-based+machine+learning+for+subcellular+segmentation+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Machine+Intelligence%22%5BJournal%5D)">Physics-based machine learning for subcellular segmentation in living cells.</a> Nature Machine Intelligence. 3, 1071-1080 (2021).</li>
<li>Pernas, L., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mito-morphosis%3A+Mitochondrial+fusion%2C+fission%2C+and+cristae+remodeling+as+key+mediators+of+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mito-morphosis: Mitochondrial fusion, fission, and cristae remodeling as key mediators of cellular function.</a> Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+macrophage+mitochondria+dynamics+in+vivo+reveals+cellular+activation+phenotype+for+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Imaging of macrophage mitochondria dynamics in vivo reveals cellular activation phenotype for diagnosis.</a> Theranostics. 10 (7), 2897-2917 (2020).</li>
<li>Xu, X., Xu, S., Jin, L., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+analysis+of+Otsu+threshold+and+its+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pattern+Recognition+Letters%22%5BJournal%5D)">Characteristic analysis of Otsu threshold and its applications.</a> Pattern Recognition Letters. 32 (7), 956-961 (2011).</li>
<li>Legland, D., Arganda-Carreras, I., Schindelin, J. MorphoLibJ: MorphoLibJ v1.2.0. Zenodo. , Available from: 
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<li>Arganda-Carreras, I., et al. Trainable_Segmentation: Release v3.1.2. Zenodo. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://zenodo.org/record/59290#.Y8qf13bP23A">https://zenodo.org/record/59290#.Y8qf13bP23A</a> (2016).</li>
<li>Chu, C. H., Tseng, W. W., Hsu, C. M., Wei, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+analysis+of+the+mitochondrial+network+morphology+with+applications+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research.</a> Frontiers in Physics. 10, 289(2022).</li>
<li>Xue, F., Li, J., Blu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+three-dimensional+point+spread+function+computation+for+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Optical+Society+of+America+A%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate three-dimensional point spread function computation for fluorescence microscopy.</a> Journal of the Optical Society of America A. 34 (6), 1029-1034 (2017).</li>
<li>Lanni, F., Gibson, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffraction+by+a+circular+aperture+as+a+model+for+three-dimensional+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Optical+Society+of+America+A%22%5BJournal%5D)">Diffraction by a circular aperture as a model for three-dimensional optical microscopy.</a> Journal of the Optical Society of America A. 6 (9), 1357-1367 (1989).</li>
<li>Sekh, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physics+based+machine+learning+for+sub-cellular+segmentation+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Machine+Intelligence%22%5BJournal%5D)">Physics based machine learning for sub-cellular segmentation in living cells.</a> Nature Machine Intelligence. 3, 1071-1080 (2021).</li>
<li>Liu, Y., Song, X. D., Liu, W., Zhang, T. Y., Zuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+deprivation+induces+mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+PC12+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glucose deprivation induces mitochondrial dysfunction and oxidative stress in PC12 cell line.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 7 (1), 49-56 (2003).</li>
<li>Dott, W., Mistry, P., Wright, J., Cain, K., Herbert, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mitochondrial+bioenergetics+in+a+skeletal+muscle+cell+line+model+of+mitochondrial+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Modulation of mitochondrial bioenergetics in a skeletal muscle cell line model of mitochondrial toxicity.</a> Redox Biology. 2, 224-233 (2014).</li>
<li>Ishihara, N., Jofuku, A., Eura, Y., Mihara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+morphology+by+membrane+potential%2C+and+DRP1-dependent+division+and+FZO1-dependent+fusion+reaction+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial morphology by membrane potential, and DRP1-dependent division and FZO1-dependent fusion reaction in mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (4), 891-898 (2003).</li>
<li>Miyazono, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupled+mitochondria+quickly+shorten+along+their+long+axis+to+form+indented+spheroids%2C+instead+of+rings%2C+in+a+fission-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner.</a> Scientific Reports. 8, 350(2018).</li>
<li>Ganote, C. E., Armstrong, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+CCCP-induced+mitochondrial+uncoupling+and+cyclosporin+A+on+cell+volume%2C+cell+injury+and+preconditioning+protection+of+isolated+rabbit+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Effects of CCCP-induced mitochondrial uncoupling and cyclosporin A on cell volume, cell injury and preconditioning protection of isolated rabbit cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (7), 749-759 (2003).</li>
<li>Nunez-Iglesias, J., Blanch, A. J., Looker, O., Dixon, M. W., Tilley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+Python+library+to+analyse+skeleton+images+confirms+malaria+parasite+remodelling+of+the+red+blood+cell+membrane+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">A new Python library to analyse skeleton images confirms malaria parasite remodelling of the red blood cell membrane skeleton.</a> PeerJ. 2018, 4312(2018).</li>
<li>Sage, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fight+club%3A+Assessment+of+2D+and+3D+single-molecule+localization+microscopy+software%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fight club: Assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software.</a> Nature Methods. 16, 387-395 (2019).</li>
<li>Yin, Z., Kanade, T., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+phase+contrast+optics+to+restore+artifact-free+microscopy+images+for+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Image+Analysis%22%5BJournal%5D)">Understanding the phase contrast optics to restore artifact-free microscopy images for segmentation.</a> Medical Image Analysis. 16 (5), 1047-1062 (2012).</li>
<li>Malm, P., Brun, A., Bengtsson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulation+of+bright-field+microscopy+images+depicting+pap-smear+specimen%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Simulation of bright-field microscopy images depicting pap-smear specimen.</a> Cytometry. Part A. 87 (3), 212-226 (2015).</li>
<li>Bifano, T., Ünlü, S., Lu, Y., Goldberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberration+compensation+in+aplanatic+solid+immersion+lens+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optical+Express%22%5BJournal%5D)">Aberration compensation in aplanatic solid immersion lens microscopy.</a> Optical Express. 21 (23), 28189-28197 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts liés à cet article.

Nous discutons des précautions liées aux étapes critiques du protocole dans les paragraphes sur la « génération de géométrie » et les « paramètres du simulateur ». Le paragraphe intitulé « apprentissage par transfert » traite des modifications pour un débit plus élevé lors de l’adaptation à plusieurs microscopes. Les paragraphes sur « l’analyse des particules » et « la génération d’autres structures subcellulaires » font référence aux applications futures de cette méthode. Le paragraphe sur la « différence par rapport à la vérité biologique » discute des différentes raisons pour lesquelles les simulations pourraient différer des données réelles et si ces raisons ont un impact sur notre application. Enfin, nous discutons d’un scénario difficile pour notre méthode dans le paragraphe « structures densément emballées ».
Génération de géométrie Pour générer la géométrie 3D des mitochondries, une structure 2D simple créée à partir de courbes b-splines en tant que squelettes fonctionne bien pour la création de l’ensemble de données synthétiques. Ces formes synthétiques imitent étroitement les formes des mitochondries observées dans les cultures cellulaires 2D. Cependant, dans le cas de tissus 3D tels que le tissu cardiaque, la forme et la disposition des mitochondries sont très différentes. Dans de tels cas, les performances du modèle de segmentation peuvent s’améliorer avec l’ajout de la directionnalité dans les images simulées.
Paramètres du simulateur Des précautions doivent être prises lors de la définition des paramètres du simulateur pour s’assurer qu’ils correspondent à ceux des données sur lesquelles exécuter l’inférence, car ne pas le faire peut entraîner une baisse des performances lors de la segmentation. L’un de ces paramètres est la plage de rapport signal sur bruit (SNR). La plage du SNR des données à tester doit correspondre aux valeurs de l’ensemble de données simulé. De plus, le PSF utilisé doit correspondre à celui des données d’essai cibles. Par exemple, les images formées par modèle à partir d’une PSF confocale ne doivent pas être utilisées pour tester les images d’un microscope épifluorescent. Un autre paramètre à prendre en compte est l’utilisation d’un grossissement supplémentaire dans les données de test. Si un grossissement supplémentaire a été utilisé dans les données d’essai, le simulateur doit également être réglé de manière appropriée.
Apprentissage par transfert L’apprentissage par transfert est le phénomène consistant à tirer parti d’un modèle appris entraîné sur une tâche pour une utilisation dans une autre tâche. Ce phénomène est également applicable à notre problème en ce qui concerne différents types de données de microscope. Les poids du modèle de segmentation (fourni avec le code source) qui est entraîné sur un type de données de microscopie peuvent être utilisés pour initialiser un modèle de segmentation à utiliser sur un autre type de données de microscope optique. Cela nous permet de nous entraîner sur un sous-ensemble beaucoup plus petit de l’ensemble de données d’apprentissage (3 000 images contre 10 000), réduisant ainsi les coûts de calcul de la simulation.
Analyse des particules L’analyse des particules peut également être effectuée sur les masques segmentés. Cela peut fournir des informations sur la zone et la courbure, etc., des mitochondries individuelles. Ces informations peuvent également servir de métriques pour la comparaison quantitative des mitochondries (non utilisées pour cette expérience). Par exemple, à l’heure actuelle, nous définissons la morphologie des points à l’aide d’un seuil basé sur la longueur des mitochondries. Il peut être utile, dans certains cas, d’incorporer l’ellipticité pour mieux séparer les petites mitochondries en forme de bâtonnets des puncta ou des mitochondries en forme de points. Alternativement, si certaines conditions biologiques provoquent l’enroulement des mitochondries, la quantification de la courbure peut être intéressante pour analyser la population mitochondriale.
Génération d’autres structures sous-cellulaires La segmentation physique des structures subcellulaires a été démontrée pour les mitochondries et les vésicules1. Bien que les vésicules présentent des formes variables, leurs tailles sont plus petites et elles apparaissent comme de simples sphères lorsqu’elles sont observées au microscope à fluorescence. Par conséquent, la géométrie des vésicules est simulée à l’aide de structures sphériques d’une gamme de diamètre appropriée. Cela implique un changement dans la fonction génère la géométrie (cylindres dans le cas des mitochondries et sphères dans le cas des vésicules) des structures et les paramètres respectifs (étape 5.4 dans la section protocole). Géométriquement, le réticulum endoplasmique et les microtubules ont également été simulés en tant que structures tubulaires17. La modélisation du réticulum endoplasmique avec un diamètre de 150 nm et des microtubules avec un diamètre extérieur moyen de 25 nm et un tube creux interne de 15 nm de diamètre fournit des approximations des formes de ces structures. Un autre paramètre qui variera pour chacune de ces structures sous-cellulaires est la densité fluorophore. Ceci est calculé en fonction de la distribution de la biomolécule à laquelle les fluorophores se lient et de la probabilité de liaison.
Différence par rapport à la réalité biologique du terrain Les données simulées utilisées pour l’entraînement supervisé par simulation du modèle d’apprentissage profond diffèrent des données réelles à bien des égards. i) L’absence d’étiquetage non spécifique dans les données simulées diffère des données réelles, car il y a souvent des fluorophores flottant librement dans les données réelles. Cela entraîne une valeur d’arrière-plan moyenne plus élevée dans l’image réelle. Cette différence est atténuée en faisant correspondre le SNR et en définissant la valeur d’arrière-plan de telle sorte qu’elle corresponde aux valeurs réelles observées. (ii) Le mouvement des structures subcellulaires et la photocinétique sont deux sources de dynamique dans le système. Les structures en mouvement dans les cellules dynamiques (qui se déplacent dans la plage de quelques millisecondes) provoquent un flou de mouvement. Le temps d’exposition est réduit lors de l’acquisition de données réelles pour éviter l’effet de flou. D’autre part, nous ne simulons pas le timelapse et supposons des structures immobiles; Cette hypothèse est valable lorsque le temps d’exposition dans les données réelles est faible. Cependant, cette hypothèse peut produire une erreur dans la sortie si le temps d’exposition des données réelles est suffisamment important pour introduire un flou de mouvement. La photocinétique, d’autre part, est de l’ordre de nanosecondes à microsecondes et peut être omise dans la simulation, car les temps d’exposition habituels des expériences sont suffisamment longs (de l’ordre de la milliseconde) pour faire la moyenne des effets de la photocinétique. (iii) Le bruit dans les images au microscope a des sources différentes, et ces sources ont des fonctions de densité de probabilité différentes. Au lieu de modéliser ces sources de bruit individuelles, nous l’approximons comme un bruit gaussien sur un fond constant. Cette différence ne modifie pas de manière significative la distribution des données dans les conditions de faible rapport signal/bruit de fond (de l’ordre de 2 à 4) et lorsqu’il s’agit de la macrodensité des fluorophores1. (iv) Les artefacts en imagerie peuvent provenir d’aberrations, de dérives et de flous systématiques. Nous supposons que le microscope est bien aligné et que les régions choisies pour l’analyse dans les données réelles sont dépourvues de ces artefacts. Il est également possible de modéliser certains de ces artefacts dans le PSF18,19,20.
Structures densément tassées Les difficultés liées à l’impossibilité de différencier les tiges qui se chevauchent des réseaux constituent un problème persistant dans la segmentation des données de microscopie 2D. Un scénario extrêmement difficile est présenté à la figure 5, où les mitochondries sont densément emballées, ce qui conduit à des résultats sous-optimaux dans le modèle de segmentation et l’analyse suivante. Malgré ce défi, l’utilisation d’opérateurs morphologiques dans de telles situations pour amincir le squelettage peut aider à briser ces réseaux trop connectés tout en permettant de détecter des changements significatifs dans toutes les catégories de morphologie mitochondriale. De plus, l’utilisation d’un microscope confocal plutôt que d’un microscope à grand champ pour l’imagerie est une méthode pour atténuer partiellement ce problème en éliminant la lumière floue. De plus, à l’avenir, il serait utile d’effectuer une segmentation 3D pour différencier les mitochondries qui se croisent (c’est-à-dire forment physiquement un réseau) des mitochondries en forme de bâtonnets dont les projections dans un seul plan se chevauchent.
La segmentation par apprentissage profond est un outil prometteur qui offre d’étendre les capacités d’analyse des utilisateurs de microscopie, ouvrant ainsi la possibilité d’une analyse automatisée de données complexes et de grands ensembles de données quantitatives, ce qui aurait été auparavant ingérable.

Dans cet article, nous démontrons l’utilité d’un outil d’apprentissage automatique basé sur la physique pour la segmentation subcellulaire1 dans des images de microscopie à fluorescence de cardiomyoblastes fixes exprimant des marqueurs mitochondriaux fluorescents.
Les mitochondries sont les principaux organites producteurs d’énergie dans les cellules de mammifères. Plus précisément, les mitochondries sont des organites très dynamiques et se trouvent souvent dans des réseaux dont la longueur et la ramification changent constamment. La forme des mitochondries impacte leur fonction, et les cellules peuvent rapidement changer leur morphologie mitochondriale pour s’adapter à un changement dans l’environnement2. Pour comprendre ce phénomène, la classification morphologique des mitochondries sous forme de points, de bâtonnets ou de réseaux est très informative3.
La segmentation des mitochondries est cruciale pour l’analyse de la morphologie mitochondriale dans les cellules. Les méthodes actuelles de segmentation et d’analyse des images de microscopie à fluorescence des mitochondries reposent sur la segmentation manuelle ou des approches conventionnelles de traitement d’images. Les approches basées sur le seuillage telles que Otsu4 sont moins précises en raison des niveaux de bruit élevés dans les images de microscopie. En règle générale, les images pour l’analyse morphologique des mitochondries présentent un grand nombre de mitochondries, ce qui rend la segmentation manuelle fastidieuse. Les approches mathématiques comme MorphoLibJ5 et les approches semi-supervisées d’apprentissage automatique comme Weka6 sont très exigeantes et nécessitent des connaissances spécialisées. Un examen des techniques d’analyse d’images pour les mitochondries7 a montré que les techniques basées sur l’apprentissage profond peuvent être utiles pour la tâche. En effet, la segmentation des images dans les images de la vie quotidienne pour des applications telles que la conduite autonome a été révolutionnée avec l’utilisation de modèles basés sur l’apprentissage profond.
L’apprentissage profond est un sous-ensemble de l’apprentissage automatique qui fournit des algorithmes qui apprennent à partir de grandes quantités de données. Les algorithmes d’apprentissage profond supervisés apprennent les relations à partir de grands ensembles d’images annotées avec leurs étiquettes de vérité terrain (GT). Les défis liés à l’utilisation de l’apprentissage profond supervisé pour segmenter les mitochondries dans les images de microscopie à fluorescence sont doubles. Tout d’abord, l’apprentissage profond supervisé nécessite un grand ensemble de données d’images d’apprentissage et, dans le cas de la microscopie à fluorescence, fournir ce grand ensemble de données serait une tâche considérable par rapport à l’utilisation d’images traditionnelles plus facilement disponibles basées sur des caméras. Deuxièmement, les images de microscopie à fluorescence nécessitent des annotations GT des objets d’intérêt dans les images d’apprentissage, ce qui est une tâche fastidieuse qui nécessite des connaissances spécialisées. Cette tâche peut facilement prendre des heures ou des jours du temps de l’expert pour une seule image de cellules avec des structures subcellulaires marquées par fluorescence. De plus, les variations entre les annotateurs posent problème. Pour éliminer le besoin d’annotation manuelle et pour pouvoir tirer parti des performances supérieures des techniques d’apprentissage en profondeur, un modèle de segmentation basé sur l’apprentissage profond a été utilisé ici qui a été formé sur des images simulées. Les simulateurs basés sur la physique fournissent un moyen d’imiter et de contrôler le processus de formation d’images dans un microscope, permettant la création d’images de formes connues. À l’aide d’un simulateur basé sur la physique, un grand ensemble de données d’images de microscopie à fluorescence simulées de mitochondries a été créé à cette fin.
La simulation commence par la génération de la géométrie à l’aide de courbes paramétriques pour la génération de formes. Les émetteurs sont placés au hasard sur la surface de la forme d’une manière uniformément répartie de sorte que la densité corresponde aux valeurs expérimentales. Une fonction d’étalement de point (PSF) 3D du microscope est calculée à l’aide d’une approximation efficacede calcul 8 du modèle Gibson-Lanni9. Pour faire correspondre étroitement les images simulées avec des images expérimentales, le courant d’obscurité et le bruit de prise de vue sont émulés pour obtenir le réalisme photo. Le GT physique est généré sous la forme d’une carte binaire. Le code pour générer le jeu de données et former le modèle de simulation est disponible10, et l’étape de création de ce jeu de données simulé est décrite à la figure 1.
Nous montrons l’utilité de la segmentation basée sur l’apprentissage profond entièrement entraînée sur un ensemble de données simulées en analysant des images de microscopie confocale de cardiomyoblastes fixes. Ces cardiomyoblastes exprimaient un marqueur fluorescent dans la membrane externe mitochondriale, permettant la visualisation des mitochondries dans les images de microscopie à fluorescence. Avant de mener l’expérience donnée en exemple ici, les cellules ont été privées de glucose et adaptées au galactose pendant 7 jours en culture. Le remplacement du glucose dans le milieu de croissance par du galactose oblige les cellules en culture à devenir plus oxydatives et, par conséquent, dépendantes de leurs mitochondries pour la production d’énergie11,12. De plus, cela rend les cellules plus sensibles aux dommages mitochondriaux. Les modifications de la morphologie mitochondriale peuvent être induites expérimentalement par l’ajout d’un agent de découplage mitochondrial tel que le cyanure de carbonyle m-chlorophénylhydrazone (CCCP) au milieu de culture cellulaire13. Le PCCC entraîne une perte de potentiel membranaire mitochondrial (ΔΨm) et, par conséquent, entraîne des changements dans les mitochondries d’une morphologie plus tubulaire (en forme de bâtonnet) à une morphologie plus globulaire (en forme de point)14. De plus, les mitochondries ont tendance à gonfler pendant le traitement CCCP15. Nous affichons la distribution morphologique des changements mitochondriaux lorsque les cardiomyoblastes adaptés au galactose ont été traités avec le découpleur mitochondrial CCCP. Les segmentations d’apprentissage profond des mitochondries nous ont permis de les classer sous forme de points, de bâtonnets ou de réseaux. Nous avons ensuite dérivé des métriques quantitatives pour évaluer la longueur des branches et l’abondance des différents phénotypes mitochondriaux. Les étapes de l’analyse sont décrites à la figure 2, et les détails de la culture cellulaire, de l’imagerie, de la création d’ensembles de données pour la segmentation basée sur l’apprentissage profond, ainsi que l’analyse quantitative des mitochondries, sont donnés ci-dessous.

<table><tbody><tr><td>Plaque à 12 puits</td><td>FALCON</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde aqueux EM Grade 25 %</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>16200</td><td></td></tr><tr><td>Axio Vert.A1 Microscope</td> à <td>fond clair</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>Ordinateur</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Doit fonctionner sous Système d’exploitation Linux/Windows équipé d’un GPU NVIDIA avec au moins 4 Go de mémoire</td></tr><tr><td>Couvre-lames</td><td>VWR</td><td>631-0150</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (colorant)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>gibco</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Lames de verre (bord givré)</td><td>epredia</td><td>AA00000112E01MNZ10</td><td></td></tr><tr><td>H9c2 mCherry-EGFP-OMP25</td><td></td><td></td><td>Lignée cellulaire stable interne dérivée d’une lignée cellulaire achetée</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51033557</td><td></td></tr><tr><td>LSM 800</td> Média de montage du <td>microscope confocal</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>(verre)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36980</td><td></td></tr><tr><td>Solution de paraformaldéhyde, 4 % dans du PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J19943-K2</td><td></td></tr><tr><td>Objectif à huile Plan-Apochromat 63x (M27) avec une NA de 1,4</td><td>Zeiss</td><td>420782-9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Hotte stérile à flux laminaire</td><td>Labogene</td><td></td><td>SCANLAF MARS</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Système d’aspiration Vacuusafe</td><td>VACUUBRAND</td><td>20727400</td><td></td></tr><tr><td>ZEN 2.6</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analyse de la morphologie mitochondriale par simulation d’apprentissage supervisé

Analyzing Mitochondrial Morphology Through Simulation Supervised Learning

L’analyse quantitative d’organites subcellulaires tels que les mitochondries dans les images de microscopie à fluorescence cellulaire est une tâche exigeante en raison des défis inhérents à la segmentation de ces petites structures morphologiquement diverses. Dans cet article, nous démontrons l’utilisation d’un pipeline de segmentation et d’analyse assisté par l’apprentissage automatique pour la quantification de la morphologie mitochondriale dans des images de microscopie à fluorescence de cellules fixes. L’outil de segmentation basé sur l’apprentissage profond est formé sur des images simulées et élimine le besoin d’annotations de réalité de terrain pour l’apprentissage profond supervisé. Nous démontrons l’utilité de cet outil sur des images de microscopie à fluorescence de cardiomyoblastes fixes avec une expression stable de marqueurs mitochondriaux fluorescents et utilisons des conditions de culture cellulaire spécifiques pour induire des changements dans la morphologie mitochondriale.

Les résultats des segmentations d’apprentissage profond des mitochondries dans des images confocales de cardiomyoblastes fixes exprimant des marqueurs fluorescents des mitochondries montrent l’utilité de cette méthode. Cette méthode est compatible avec d’autres types de cellules et systèmes de microscopie, ne nécessitant qu’un recyclage.
Des cardiomyoblastes H9c2 adaptés au galactose avec mitochondries fluorescentes ont été traités avec ou sans CCCP pendant 2 h. Les cellules ont ensuite été fixées, colorées avec un colorant nucléaire et montées sur des lames de verre pour l’analyse par microscopie à fluorescence. Un microscope confocal a été utilisé pour acquérir des images des cellules témoins et des cellules traitées par CCCP. Nous avons effectué notre analyse sur 12 images confocales, avec environ 60 cellules par condition. L’état morphologique des mitochondries dans chaque image a ensuite été déterminé et quantifié. Les masques de segmentation obtenus à partir du modèle entraîné ont été squelettés pour permettre l’analyse de la topologie de chaque mitochondrie individuelle pour cette expérience. La longueur de la branche des mitochondries individuelles a été utilisée comme paramètre pour la classification. Les mitochondries individuelles ont été classées en classes morphologiques selon la règle suivante. Plus précisément, tout squelette mitochondrial d’une longueur inférieure à 1 500 nm était considéré comme un point, et les mitochondries les plus longues étaient en réseau ou en bâtonnet. S’il y avait au moins une jonction où deux branches ou plus se croisaient, cela était défini comme un réseau; Sinon, la mitochondrie a été classée comme un bâtonnet. Un exemple d’image avec les squelettes mitochondriaux étiquetés avec les classes de morphologie est montré à la figure 3.
La catégorisation de la morphologie mitochondriale de la figure 4A montre qu’il est possible de détecter des changements significatifs lorsque CCCP est appliqué pendant 2 h; cela est démontré le plus clairement par l’augmentation des points pour les cellules traitées par CCCP.
La longueur moyenne des branches de la figure 4B est une autre façon d’illustrer les changements détectables et significatifs de la morphologie. Comme prévu, les bâtonnets et les réseaux ont été considérablement réduits par rapport au contrôle lorsque les cellules ont été traitées avec CCCP. L’augmentation significative de la longueur moyenne des branches des points était également attendue étant donné le gonflement que subissent les mitochondries lorsqu’elles sont exposées au PCCC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64880/64880fig01.jpg"> Figure 1 : Pipeline pour la simulation d’images de microscopie à fluorescence. Le pipeline comprend (i) la génération de géométrie 3D, (ii) l’émulation des émetteurs et de la photocinétique, (iii) la convolution PSF 3D, (iv) l’ajout de bruit et (v) la binarisation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/64880fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64880/64880fig02.jpg"> Figure 2 : Étapes de l’analyse de la morphologie mitochondriale basée sur l’apprentissage automatique. (1) Les images à segmenter sont d’abord recadrées dans des tailles acceptables pour le modèle de segmentation. (2) La segmentation basée sur l’apprentissage profond est appliquée aux cultures d’images. (3) Les cultures de production segmentées sont recousues à leur taille d’origine. (4) Les segmentations montées sont squelettées. (6) L’analyse morphologique est effectuée sur la base de la topologie des squelettisations. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/64880fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64880/64880fig03.jpg"> Figure 3 : Squelette mitochondrial superposé à la sortie de segmentation des images de microscopie. (A) La sortie de segmentation. (B) Le squelette rectiligne (distance euclidienne entre les points de départ et d’arrivée d’une branche) est superposé au-dessus de la sortie de segmentation. Le code couleur du squelette représente la classe des mitochondries. Les réseaux sont rouges, les bâtonnets sont verts et les points sont de couleur violette. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/64880fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64880/64880fig04.jpg"> Figure 4 : Analyse de la morphologie mitochondriale. (A) Un aperçu du pourcentage relatif des différentes catégories morphologiques basé sur la longueur mitochondriale totale. (B) Comparaison de la longueur moyenne des branches mitochondriales entre les conditions expérimentales et entre les catégories morphologiques. L’axe des x affiche les catégorisations morphologiques et l’axe des y affiche la longueur moyenne des branches des mitochondries en nanomètres (nm). La signification statistique sous forme de valeurs p est indiquée comme suit : p &lt; 0,05, ** p &lt; 0,01, *** p &lt; 0,001 et **** p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/64880fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64880/64880fig05v2.jpg"> Figure 5 : Cas d’échec de la segmentation. Une forte densité de mitochondries est un scénario difficile pour le modèle de segmentation. Le squelette coloré montre la plus longue mitochondrie unique détectée dans l’image. En parcourant les mesures de longueur, ces scénarios peuvent être détectés et travaillés pour améliorer les résultats de segmentation en utilisant l’opérateur morphologique érode (amincit le squelette détecté). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/64880fig05laregv2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Cet article explique comment utiliser l’apprentissage automatique supervisé par simulation pour analyser la morphologie des mitochondries dans des images de microscopie à fluorescence de cellules fixes.

Analyse de la morphologie mitochondriale par simulation d’apprentissage supervisé

The quantitative analysis of subcellular organelles such as mitochondria in cell fluorescence microscopy images is a demanding task because of the ...

Nous démontrons l’utilisation d’un outil d’apprentissage automatique supervisé par simulation pour analyser les mitochondries dans des images de microscopie fluorescente de cellules fixes. Les méthodes actuelles de segmentation des mitochondries dans les images de microscopie comprennent des méthodes basées sur le seuillage automatique telles que Ostu ou la segmentation manuelle. Les techniques basées sur le seuillage fonctionnent mal lorsque le rapport signal / arrière-plan est faible.En règle générale, les images pour l’analyse morphologique présentent un grand nombre de mitochondries, ce qui rend la segmentation manuelle fastidieuse. Les méthodes d’apprentissage profond supervisées effectuent la segmentation avec une grande précision, mais nécessitent un grand nombre de données d’entrée de paires de vérité de terrain pour la formation. Cette approche utilise un simulateur basé sur la physique pour générer des paires d’images de microscopie et leur masque de forme de réalité de terrain 2D, éliminant ainsi le besoin d’annotation manuelle.Le modèle formé sur des images simulées est ensuite utilisé pour segmenter les mitochondries en images réelles au microscope. Nous utilisons un outil de segmentation basé sur l’apprentissage profond qui permet l’automatisation de cette tâche avec une grande précision et qui ne nécessite pas d’ensemble de données annotées de réalité sur le terrain pour la formation. La simulation commence par la génération de la géométrie à l’aide de courbes paramétriques pour la génération de formes.Les émetteurs sont uniformément répartis et placés aléatoirement sur la surface de la forme générée de sorte que la densité corresponde aux valeurs expérimentales. Une PSF 3D du microscope est calculée à l’aide du modèle Gibson-Lanni. Pour atteindre le photoréalisme entre les images simulées et les images expérimentales, nous imitons à la fois les bruits sombres et les bruits de prise de vue.La réalité de terrain de la physique est générée sous la forme d’une carte binaire. Nous évaluons l’effet du traitement CCCP sur la morphologie mitochondriale de cardiommyoblastes fixes imagés à l’aide d’un microscope confocal. Culture cellulaire.Préparer l’ensemencement des cellules, fonctionnant dans une hotte à flux laminaire stérile, en plaçant un couvercle pour chaque condition expérimentale dans un puits d’une plaque de 12 puits. Assurez-vous que la suspension cellulaire diluée est bien mélangée en pipetant le contenu du tube à centrifuger plusieurs fois de haut en bas avant de distribuer le volume approprié à chaque puits. Procédure expérimentale.Aspirer les milieux de culture cellulaire des puits de la plaque de 12 puits, puis appliquer rapidement des milieux préchauffés frais sur les puits témoins et les milieux préchauffés avec une solution CCCP micromolaire aux puits de condition d’essai. Incuber dans l’incubateur de 37 cellules Celsius pendant deux heures. Aspirer les milieux de culture cellulaire des puits et appliquer la solution de fixation préchauffée.Coloration et montage des cellules sur les lamelles de couverture. Ajoutez un support de montage de 10 microlitres à une lame de verre préparée pour monter un couvercle. Ramassez le bordereau de couverture de la plaque de 12 puits à l’aide d’une pince à épiler et tamponnez l’humidité des bordereaux de couverture en touchant brièvement le bord et l’arrière du bordereau de couverture à la serviette en papier non pelucheuse préparée.Abaissez doucement le couvercle sur la gouttelette de support de montage en attente. Microscope et imagerie. À l’aide des oculaires, ajustez manuellement le niveau Z pour que l’échantillon soit mis au point.Passez à l’onglet acquis dans le logiciel. Utilisez la configuration intelligente pour sélectionner le canal de fluorescence à utiliser pour l’imagerie. Array-centré sur le milieu du bordereau de couverture avec 12 positions totales à imager.Position RA centrée sur le centre du bordereau de couverture. Il est possible d’imager plusieurs emplacements de manière automatisée. Génération de données d’entraînement simulées.Téléchargez le code et décompressez le contenu. Suivez les instructions et le fichier readme pour configurer l’environnement. Accédez au dossier nommé src"Faire une copie ou utiliser le dossier 2.mitochondria simulation airy » et renommez-le. Ce dossier contient tous les fichiers liés à la simulation des données d’entraînement. Il y a trois ensembles de paramètres à définir pour la simulation.Tout d’abord, définissez les paramètres du nombre de mitochondries, de la plage de diamètre, de la plage de l’axe Z et de la densité des fluorophores pour le simulateur dans le fichier de configuration du lot. Ensuite, définissez les paramètres optiques de l’ouverture numérique, du grossissement et de la longueur d’onde minimale du jeu de données dans le fichier microscopePSFmode. py"Définissez la valeur souhaitée pour la taille des pixels et la longueur d’onde d’émission dans le generate_batch_parallel d’incendie.py"Définissez le troisième ensemble de paramètres concernant le jeu de données de sortie, tels que la taille des images de sortie, le nombre de tuiles dans chaque image et le nombre total d’images dans le fichier generate_batch_parallel. py"Exécutez le fichier generate_batch_parallel. py"pour démarrer la simulation.Pour obtenir l’image de taille finale, faites une copie du dossier nommé 5. Préparation des données et formation/préparation des données » et naviguez-y. Définissez les paramètres du numéro de lot et du nombre d’images par lot, de la plage de bruit à ajouter dans le fichier Data_generator.py"Exécutez le fichier Data_generator. py"Créez les images de montage. Copiez les dossiers nommés image"et segment"dans le dossier datatrain/train ».Segmentation basée sur le deep learning. Pour entraîner le modèle de segmentation pour un nouveau paramètre d’image de microscope, accédez au dossier nommé train"et définissez les paramètres de la taille de Bach, du modèle de base pour la segmentation, du nombre d’époques et du taux d’apprentissage pour l’entraînement dans le fichier nommé train_unet. py"Exécutez le fichier train_unet.py"pour commencer la formation. Le processus d’apprentissage affiche la métrique permettant d’évaluer le modèle de segmentation sur le jeu de validation simulé. Une fois la formation terminée, le modèle est enregistré en tant que best_model.h5"dans le dossier nommé train"Pour tester le modèle sur les images du microscope, les images doivent être divisées à la taille souhaitée par le modèle de train. Pour cela, accédez au dossier nommé 6. Préparer les données de test"et copier les fichiers au format PNG des données dans le dossier PNG"et exécuter le fichier split_1024_256.py"Cela créera des recadrages de taille 256 par 256 des images dans le dossier de données. Pour segmenter les rognages d’images, accédez au dossier nommé 7. Testez la segmentation » et exécutez le fichier nommé segment.py"après avoir défini le nom du modèle enregistré à utiliser. Les images segmentées sont enregistrées dans le dossier de sortie. Analyse morphologique.Placez le fichier nommé make_montage. py"dans le dossier nommé 7. Testez la segmentation » et exécutez le fichier pour assembler la sortie segmentée à la taille d’origine de l’image.Créez un nouveau dossier nommé 9. Analyse morphologique"dans le dossier source et naviguez dedans. Installez les bibliothèques skan et seaborn à l’aide de la commande pip install seaborn skan"Les masques de segmentation sont squelettés à l’aide de la bibliothèque nommée skan"pour permettre l’analyse de la topologie de la mitochondrie individuelle.Placez le fichier dans le dossier 9. Analyse morphologique"Organisez les images des différents groupes de l’expérience dans différents dossiers à l’intérieur du dossier 7. Tester la segmentation"Exécutez le fichier pour créer des graphiques pour l’analyse. Résultats.L’analyse quantitative à effectuer dépend des questions ou de l’hypothèse de recherche. Dans notre expérience, nous nous sommes intéressés aux trois morphologies différentes des mitochondries, à savoir les points « petits bits mitochondriaux, les bâtonnets « fibreux ou en forme de chaîne comme les mitochondries, et les réseaux multi ramifiés"Pour identifier la morphologie, nous squelettons d’abord la sortie de segmentation et analysons les liens de branche des différentes classes. Nous montrons les résultats de l’analyse pour les deux groupes de cellules adaptées aux galactoses, le groupe témoin et le groupe traité CCCP.Nous constatons une augmentation significative de la longueur moyenne des branches des points, ce qui est attendu, étant donné le gonflement que subissent les mitochondries lorsqu’elles sont exposées au CCCP. Le pourcentage de mitochondries dans les longueurs individuelles des bâtonnets et des classes de réseau est significativement réduit par rapport au témoin lorsque les cellules ont été traitées avec CCCP, ce qui confirme notre hypothèse. Un scénario difficile pour notre méthode est lorsque l’image a des mitochondries densément emballées.La couleur rose indique la mitochondrie unique la plus longue détectée dans l’image, ce qui est dû à l’erreur accrue dans les résultats de segmentation. Ces cas d’échec peuvent être détectés par un contrôle des longueurs des mitochondries et à l’aide d’opérateurs morphologiques. Bien que notre application soit un exemple de la façon dont nous avons effectué l’analyse de la morphologie mitochondriale, nous pensons qu’une telle analyse et des questions de recherche autour de celle-ci peuvent être formulées pour divers aspects de la mitophagie et des expériences biologiques connexes.

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Analyse de la morphologie mitochondriale par simulation d’apprentissage supervisé

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