Identification des gènes impliqués dans le développement stomatique par notation du phénotype épidermique

Les deux méthodes d’analyse phénotypique présentées ici offrent des images de haute qualité suffisantes pour effectuer une analyse phénotypique quantitative et pour démontrer les réponses phénotypiques du traitement peptidique avec des détails épidermiques. Par conséquent, ces deux méthodes peuvent être utilisées pour comprendre la structuration et le développement des cellules épidermiques. Ces deux méthodes sont des techniques relativement faciles et fiables car elles ne nécessitent aucun produit chimique toxique ou pièce épidermique largement utilisé pour l’analyse phénotypique épidermique.

Cependant, les techniques sont compliquées et nécessitent une formation spécialisée. Pour commencer, sélectionnez soigneusement et découpez l’un des cotylédons des plantules individuelles qui poussent uniformément avec les autres plantules dans l’assiette pour limiter la variabilité. Placer chaque cotylédon dans un tube microcentrifuge contenant un millilitre d’une solution de fixation à l’aide d’une pince et laisser l’échantillon dans la solution de fixation pendant la nuit à température ambiante.

Retirer la solution de fixation et ajouter un millilitre d’éthanol à 70%. Retourner le tube plusieurs fois et laisser le tube contenant les échantillons à température ambiante pendant environ 30 minutes. Répétez cette étape en utilisant un millilitre d’éthanol à 50%, puis 20% d’éthanol.

Remplacez le millilitre d’éthanol à 20% par un millilitre d’eau distillée, inversez le tube contenant les échantillons de cotylédons plusieurs fois et laissez-le pendant environ 30 minutes. Retirez toute l’eau distillée du tube et ajoutez immédiatement environ 200 microlitres de solution de coloration Toluidine Blue O ou TBO pendant environ deux minutes. Retirez la solution de coloration TBO aussi soigneusement que possible, puis lavez immédiatement les échantillons plusieurs fois en ajoutant un millilitre d’eau distillée fraîche.

Dans une hotte à flux laminaire, transplanter soigneusement 10 à 12 plantules d’Arabidopsis âgées d’un jour de chacune des deux plaques préparées dans une plaque de 24 puits contenant 1,5 millilitre de milieu liquide demi-MS dans chaque puits. Ajouter soit 50 millimolaires tris HCL tampon seul, soit deux concentrations différentes du peptide à chaque puits contenant les plantules germées sur des demi-plaques de gélose MS. Mélanger délicatement les plantules avec le tampon seul ou une solution peptidique à l’aide d’une pipette et sceller la plaque avec du ruban microporé.

Incuber la plaque d’essai dans de longues conditions de journée pendant cinq à sept jours à 22 degrés Celsius. Transférer les semis du puits sur une lame de couverture et disséquer le cotylédon du semis. Placez la face abaxiale du cotylédon à l’aide d’une pince et coupez-la en petits morceaux.

Prenez une autre lame de microscope propre et placez une goutte de solution d’iodure de propidium dessus. Placez l’un des petits morceaux de cotylédon dans la goutte à l’aide d’une pince et placez doucement le couvercle. Appliquez une solution supplémentaire d’iodure de propidium sur le bord de la lamelle de couverture pour éliminer les bulles d’air qui se forment.

Imagez la face abaxiale du cotylédon à l’aide d’un microscope confocal et comparez les images avec les images des plantules cultivées dans un milieu demi-SEP contenant uniquement un tampon. Des images de cotylédons abaxiaux provenant de semis âgés de 10 jours de trois génotypes d’Arabidopsis, de type sauvage, d’une lignée silencieuse STOMAGEN et de mutants epf1 epf2 sont présentées ici. Ici, la raie silencieuse de STOMAGEN représente les génotypes à faible nombre de stomates et les mutants epf1 epf2 représentent les génotypes à nombre élevé de stomates.

Les images représentatives de l’épiderme de cotylédons de plantules de 10 jours de lignées sauvages, tmm et transgéniques portant une construction de surexpression epf2 ou epf1 inductible par l’estradiol ont été utilisées pour l’analyse quantitative du phénotype épidermique. Les images confocales représentatives de l’épiderme de cotylédon de type sauvage et epf2 cultivé pendant six à sept jours dans une solution tampon et d’un épiderme de cotylédon epf2 cultivé avec deux lots différents de peptides epf2 sont présentées dans cette figure. En effectuant cette procédure, assurez-vous de couper l’un des cotylédons d’un semis individuel qui pousse déjà uniformément avec les autres plants.

Choisissez également un semis qui ne touche pas le milieu de la SEP pour limiter la variabilité. Un autre point à retenir est de ne pas placer plus de cinq cotylédons dans un seul tube microcentrifuge. De plus, agitez doucement le tube pour assurer une répartition uniforme des taches TBO autour des cotylédons pour les colorer bien.

Étant donné que plusieurs peptides structurels existent dans une solution peptidique, cette méthode de dosage biologique sera très utile pour l’identification des formes de peptide correctement repliées et bioactives et de leurs fonctions biologiques.