Name: Démonstration du test de fibre d’ADN pour étudier les dommages à l’ADN et la dynamique de réparation induits par les nanoparticules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T13:43:00.000+00:00
Duration: 13 min 9 s
Description: Découvrez l'analyse de fibres d'ADN pour étudier les dommages à l'ADN et la réparation induits par les nanoparticules. Cette méthode aide à développer des agents thérapeutiques plus sûrs en nanomédecine.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Les auteurs reconnaissent le soutien financier de la fondation Blazer, du programme de biotechnologie médicale des sciences biomédicales, UIC Rockford, et du Département de l’éducation en sciences de la santé, UIC Rockford. Les auteurs remercient Ananya Sangineni et James Bradley pour leurs contributions au projet.

1. Préparation des anticorps et du tampon
<ol><li>Préparer la solution d’anticorps primaire, l’anti-BrdU de souris à une dilution de 1:300 dans du BSA à 5 % et l’anti-BrdU chez le rat à une dilution de 1:500 dans du BSA à 5 %.</li>
	<li>Préparer la solution d’anticorps secondaires, alexafluor 594 lapin anti-souris à une dilution de 1:300 dans 5% BSA et alexafluor 488 poulet anti-rat à une dilution de 1:500 dans 5% BSA.</li>
	<li>Préparer la solution d’anticorps tertiaires, alexafluor 594 chèvre anti-lapin à une dilution de 1:1 000 dans 5% BSA et alexafluor 488 chèvre anti-poulet à une dilution de 1:1 000 dans 5% BSA.</li>
	<li>Préparer 10 mL de tampon de lyse dans duddH2Oavec 2 mL de 1M Tris (pH 7,4), 1 mL de 0,5 M EDTA et 0,5 mL de SDS à 10 %.</li>
</ol>2. Préparation pour le dosage des fibres
<ol><li>Jour 1 : Culture cellulaire et traitement des nanomatériaux pour le dosage des fibres<ol><li>Plaquer RAW 264.5 macrophages cellules ou les cellules d’intérêt, de sorte que les cellules sont dans la phase logarithmique de leur croissance le jour de l’expérience. Pour les cellules RAW, ajouter 5 x 104 cellules/puits à des plaques de 24 puits pour chaque condition. Maintenir les cellules dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO2 et 98% d’humidité. Le tableau 1 décrit les constituants des milieux utilisés. Permettre aux cellules de croître jusqu’à 75%-80% de confluence17,37.</li>
		<li>Une fois que les cellules ont atteint le niveau de confluence de 75% à 80%, retirez le milieu des plaques, prenez la moitié du milieu et réservez-le pour l’impulsion CldU (réserve CldU) et ajoutez 5 μL d’IdU à l’autre moitié à une concentration finale de 50 μM. Mélanger et ajouter le milieu contenant de l’IdU dans les plaques. Placez les cellules contenant de l’IdU dans l’incubateur pendant 20 min.</li>
		<li>Placer le milieu de réserve CldU à 37 °C pour le maintenir préchauffé. Ajouter CldU à ce milieu juste avant l’impulsion CldU.</li>
		<li>Après 20 min, aspirer le mélange IdU-milieu et laver doucement les cellules avec 500 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) en tournant doucement la plaque. Jetez le PBS.</li>
		<li>Traiter les cellules avec diverses concentrations de nanoparticules dans 500 μL du milieu, et incuber pendant encore 30 min. Pour cette étude, utilisez des nanoparticules d’oxyde de graphène traitées à une concentration de 25 μg/mL.</li>
		<li>Aspirer le mélange milieu de traitement et laver doucement les cellules avec 500 μL de PBS en tournant doucement la plaque. Jetez le PBS. Ajouter 5 μL de CldU (100 μM final</li>
		<li>concentration) dans le milieu de réserve CldU, et couvrir les cellules avec le milieu de réserve CldU. Placez les cellules dans l’incubateur pendant la durée de l’impulsion CldU pendant 20 min.</li>
		<li>Lavez les cellules avec du PBS, grattez ou trypsinisez pendant 3-4 minutes, puis ajoutez 5 ml de milieu dans la plaque et recueillez les cellules.</li>
		<li>Faire tourner à 264 x g pendant 4 min. Retirer le milieu et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de PBS glacé. Déterminez le nombre de cellules à l’aide d’un dosage au bleu de trypan (comptage hémocytométrique), puis diluez les cellules à ~200-400 cellules / μL. Gardez la suspension cellulaire sur de la glace pendant le comptage cellulaire. REMARQUE : Si possible, limitez le temps pendant lequel les cellules restent sur la glace. Cela peut aider à obtenir un cordon de solution cellulaire le long du haut de la lame. S’ils sont gardés sur la glace, gardez-les pendant moins de 30 minutes.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 1 : Préparation des fibres d’ADN<ol><li>À l’aide d’un crayon, étiquetez les lames (lame de verre, 75 mm x 25 mm) avec la condition expérimentale et la date.</li>
		<li>Prenez 2 μL de cellules dans une pipette, tenez la pipette à un angle de ~45°, placez la pipette à environ 1 cm sous l’étiquette de la lame et déplacez la pipette horizontalement sur l’étiquette de la lame. Au fur et à mesure que la pipette se déplace sur la lame, relâchez un peu de la solution cellulaire à la fois. Créez plusieurs lignes de cellules sur chaque diapositive (étape critique). REMARQUE: Il devrait y avoir une ligne horizontale de suspension cellulaire à travers la glissière. Si la suspension cellulaire perle, ajoutez 5 à 10 μL de milieu cellulaire dans le récipient contenant la suspension cellulaire, car cela peut aider la solution à adhérer à la lame lors de l’application à nouveau.</li>
		<li>Laissez la solution avec les cellules s’évaporer jusqu’à ce que la solution semble collante et collante. À ce stade, un peu de liquide est associé aux cellules, mais pas beaucoup. Cette étape dure de 8 à 20 minutes et varie en fonction de la quantité d’humidité dans l’air. REMARQUE: Assurez-vous que toute la solution ne s’est pas évaporée, car cela rend très difficile l’obtention de fibres d’ADN droites et alignées car la plupart, sinon la totalité, de l’ADN sera collée ensemble et incapable de se séparer.</li>
		<li>Lorsque la solution est collante, recouvrir les cellules de 15 μL de tampon d’étalement (lyse) par ligne de cellules, en prenant soin de ne pas laisser l’embout de la pipette toucher la lame. Attendez 10 min. Inclinez la glissière à un angle de 25° et placez l’étiquette de la glissière horizontalement contre le bord d’un support de tube (la partie inférieure de l’étiquette doit s’aligner avec le bord du support de tube).</li>
		<li>Laissez sécher l’ADN à l’air libre pendant au moins 4 heures à partir du moment où les dernières lames ont été faites. NOTE: Une période de 4 h à 12 h est bonne pour le séchage. Cependant, ne les laissez pas sécher pendant la nuit. Si on le laisse sécher pendant la nuit, il y aura beaucoup d’ADN détendu, mais très peu de fibres d’ADN droites et alignées.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 1 : Fixation des fibres d’ADN et congélation<ol><li>Une fois les lames séchées, fixez-les avec du méthanol:acide acétique (3:1) en immergeant les lames pendant 2 min. Effectuez cette étape sous un capot et laissez les lames sécher pendant la nuit dans un endroit où l’exposition à la lumière est limitée, ou couvrez les lames avec une tente en papier d’aluminium.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 2<ol><li>Placez les lames dans un support de lames en verre. Placer les lames à −20 °C pendant un minimum de 24 h. Cette étape améliore la résolution ou la netteté de l’image.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Réalisation du test de fibre d’ADN
<ol><li>Dénaturation de l’ADN<ol><li>Préparez une chambre humidifiée à l’aide de petites boîtes à pipettes avec couvercles. Remplissez à moitié les récipients d’eau et placez-les dans un bain-marie à 37 °C pendant au moins 1 h.</li>
		<li>Retirez les lames à −20 °C et décongelez-les pendant quelques secondes. Placez soigneusement les lames dans un pot Coplin contenant de l’eau désionisée (DI) afin que les surfaces enduites ne touchent pas les parois du pot. Incuber la lame pendant 20 s, puis verser soigneusement l’eau.</li>
		<li>Ajouter 2,5 M HCL au pot Coplin de sorte qu’il couvre toutes les lames. Attendez 80 min. Il s’agit d’une étape cruciale du protocole. Un changement dans l’heure peut changer le résultat de l’image.</li>
		<li>Lavez les lames 1x avec PBS plus Tween (PBS + 0,1% Tween [concentration finale]), puis 2x avec PBS pendant 3 min chacune à température ambiante (RT).</li>
	</ol></li>
	<li>Immunomarquage<ol><li>Conservez les lames dans la chambre humidifiée pour les étapes suivantes. Bloquez les lames dans 5% BSA dans PBS pendant 30 minutes à RT, et couvrez-les avec des lamelles de couverture, des lamelles de couverture faites d’un sac Western blot ou des feuilles de plastique transparentes.</li>
		<li>Après le blocage, retirez délicatement la lame, retirez la solution de blocage et épongez la lame sur une serviette en papier (appuyez sur la lame sur la serviette) pour enlever l’excès de solution de blocage.</li>
		<li>Ajouter 100 μL de la solution d’anticorps primaires le long de la lame. Ajoutez un nouveau couvercle en plastique et attendez 2 h. Lors de l’ajout de la lame, assurez-vous qu’aucune bulle ne se forme.</li>
		<li>Après 2 h, faire tomber la solution d’anticorps et rincer les lames dans un pot de Coplin rempli de PBS 2x à TA. Utilisez du PBS frais à chaque fois pour laver les lames.</li>
		<li>Bloquez à nouveau les lames en ajoutant 200 μL (trois à quatre gouttes) de BSA à 5% le long de chaque lame, et ajoutez une lamelle de couverture en plastique. Attendez 15 min.</li>
		<li>Enlevez la lame, faites tomber l’excès de BSA sur une serviette en papier et ajoutez 100 μL de la solution d’anticorps secondaires sur toute la longueur de la lame. Ajoutez un nouveau couvercle en plastique et attendez 1 h.</li>
		<li>Enlevez la lame, faites tomber l’excès de BSA sur une serviette en papier et lavez les lames 2x dans PBS à RT.</li>
		<li>Bloquez à nouveau les lames en ajoutant 200 μL (trois à quatre gouttes) de BSA à 5% le long de chaque lame, et ajoutez une lamelle de couverture en plastique. Attendez 15 min.</li>
		<li>Si nécessaire, retirez la lame, retirez l’excès de BSA sur une serviette en papier et ajoutez 100 μL de solution d’anticorps tertiaires sur toute la longueur de la lame. Ajoutez de nouveaux couvercles en plastique et attendez 30 min.</li>
		<li>Lavez les lames avec PBS 3x. Retirez l’excès de PBS et laissez-les sécher complètement.</li>
		<li>Une fois sec, ajoutez le support de montage et placez soigneusement des lamelles de verre (24 mm x 60 mm) sur le support de montage afin d’éviter les bulles. Renommez les diapositives et laissez-les dans l’obscurité pendant la nuit.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Acquisition d’images
<ol><li>Visualisez les fibres d’ADN immunocolorées à l’aide d’un microscope immunofluorescent équipé d’une caméra, d’un objectif 60x et d’ensembles de filtres appropriés pour détecter les colorants alexafluor 488 et 594.</li>
	<li>Prenez des images pour l’analyse dans les régions où les fibres sont bien séparées et non enchevêtrées. Il est important de capturer des images dans différentes zones de la diapositive, car la prise d’images dans une seule partie de la diapositive peut ne pas fournir de données représentatives concernant tous les intermédiaires de réplication trouvés sur la diapositive.</li>
	<li>Si possible, obtenez des images de fibre de 20 régions différentes sur une diapositive. Utilisez un seul canal pour sélectionner les zones de prise d’images afin d’éviter les biais.</li>
</ol>

<ol><li>Waga, S., Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+replication+fork+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The DNA replication fork in eukaryotic cells.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 721-751 (1998).</li>
<li>Gambus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Termination+of+eukaryotic+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Replication%22%5BJournal%5D)">Termination of eukaryotic replication forks.</a> DNA Replication. 1042, 163-187 (2017).</li>
<li>Berti, M., Cortez, D., Lopes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasticity+of+DNA+replication+forks+in+response+to+clinically+relevant+genotoxic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The plasticity of DNA replication forks in response to clinically relevant genotoxic stress.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 633-651 (2020).</li>
<li>Carr, A. M., Lambert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+stress-induced+genome+instability%3A+The+dark+side+of+replication+maintenance+by+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Replication stress-induced genome instability: The dark side of replication maintenance by homologous recombination.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4733-4744 (2013).</li>
<li>Berti, M., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+stress%3A+Getting+back+on+track%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Replication stress: Getting back on track.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 23 (2), 103-109 (2016).</li>
<li>Montes-Burgos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+nanoparticle+size+and+state+prior+to+nanotoxicological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanoparticle+Research%22%5BJournal%5D)">Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies.</a> Journal of Nanoparticle Research. 12 (1), 47-53 (2010).</li>
<li>Khan, I., Saeed, K., Khan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles%3A+Properties%2C+applications+and+toxicities%5BTitle%5D)+AND+%22Arabian+Journal+of+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles: Properties, applications and toxicities.</a> Arabian Journal of Chemistry. 12 (7), 908-931 (2019).</li>
<li>Ealia, S. A. M., Saravanakumar, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+the+classification%2C+characterisation%2C+synthesis+of+nanoparticles+and+their+application%5BTitle%5D)+AND+%22IOP+Conference+Series%3A+Materials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">A review on the classification, characterisation, synthesis of nanoparticles and their application.</a> IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 263 (3), 032019(2017).</li>
<li>Bijukumar, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+toxicity+of+processed+and+non-processed+states+of+CoCrMo+degradation+products+generated+from+a+hip+simulator+on+neural+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Differential toxicity of processed and non-processed states of CoCrMo degradation products generated from a hip simulator on neural cells.</a> Nanotoxicology. 12 (9), 941-956 (2018).</li>
<li>Bijukumar, D., Segu, A., Chastain, P., Mathew, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implant-derived+CoCrMo+alloy+nanoparticle+disrupts+DNA+replication+dynamics+in+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Implant-derived CoCrMo alloy nanoparticle disrupts DNA replication dynamics in neuronal cells.</a> Cell Biology and Toxicology. 37 (6), 833-847 (2021).</li>
<li>Shekhar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+pathways+for+evaluation+of+nanotoxicity%3A+Stumbling+block+in+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Cleaner+Engineering+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the pathways for evaluation of nanotoxicity: Stumbling block in nanotechnology.</a> Cleaner Engineering and Technology. 5, 100311(2021).</li>
<li>Bhabra, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+can+cause+DNA+damage+across+a+cellular+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles can cause DNA damage across a cellular barrier.</a> Nature Nanotechnology. 4 (12), 876-883 (2009).</li>
<li>Técher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+dynamics%3A+Biases+and+robustness+of+DNA+fiber+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).</li>
<li>Chastain, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+checkpoint+responses+in+the+S+phase+of+synchronized+diploid+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">DNA damage checkpoint responses in the S phase of synchronized diploid human fibroblasts.</a> Photochemistry and Photobiology. 91 (1), 109-116 (2015).</li>
<li>Frum, R. A., Deb, S., Deb, S. P. Use of the DNA fiber spreading technique to detect the effects of mutant p53 on DNA replication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFrum%2C+RA+%22p53+Protocols%22">p53 Protocols</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. 147-155 (2013).</li>
<li>Ord, M. G., Stocken, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+in+synthesis+of+deoxyribonucleic+acid%3A+Radiobiochemical+lesion+in+animal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Studies in synthesis of deoxyribonucleic acid: Radiobiochemical lesion in animal cells.</a> Nature. 182 (4652), 1787-1788 (1958).</li>
<li>Moore, G., Sainz, J. J., Jensen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+fiber+combing+protocol+using+in-house+reagents+and+coverslips+to+analyze+replication+fork+dynamics+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">DNA fiber combing protocol using in-house reagents and coverslips to analyze replication fork dynamics in mammalian cells.</a> STAR Protocols. 3 (2), 101371(2022).</li>
<li>Blin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-dependent+regulation+of+replication+dynamics+modulates+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription-dependent regulation of replication dynamics modulates genome stability.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 58-66 (2019).</li>
<li>Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. 2D gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZardoni%2C+L+%22DNA+Electrophoresis%22">DNA Electrophoresis</a>. , Humana. New York, NY. 43-59 (2020).</li>
<li>Painter, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioresistant+DNA+synthesis%3A+An+intrinsic+feature+of+ataxia+telangiectasia%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FFundamental+and+Molecular+Mechanisms+of+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Radioresistant DNA synthesis: An intrinsic feature of ataxia telangiectasia.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 84 (1), 183-190 (1981).</li>
<li>Aten, J. A., Bakker, P. J. M., Stap, J., Boschman, G. A., Veenhof, C. H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double+labelling+with+IdUrd+and+CldUrd+for+spatial+and+temporal+analysis+of+cell+proliferation+and+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22The+Histochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">DNA double labelling with IdUrd and CldUrd for spatial and temporal analysis of cell proliferation and DNA replication.</a> The Histochemical Journal. 24 (5), 251-259 (1992).</li>
<li>Gratzner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+to+5-bromo-and+5-iododeoxyuridine%3A+A+new+reagent+for+detection+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody to 5-bromo-and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication.</a> Science. 218 (4571), 474-475 (1982).</li>
<li>Huberman, J. A., Riggs, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoradiography+of+chromosomal+DNA+fibers+from+Chinese+hamster+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Autoradiography of chromosomal DNA fibers from Chinese hamster cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 55 (3), 599-606 (1966).</li>
<li>Ockey, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+replicon+behavior+between+X-irradiation-sensitive+L5178Y+mouse+lymphoma+cells+and+AT+fibroblasts+using+DNA+fiber+autoradiography%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Differences in replicon behavior between X-irradiation-sensitive L5178Y mouse lymphoma cells and AT fibroblasts using DNA fiber autoradiography.</a> Radiation Research. 94 (2), 427-438 (1983).</li>
<li>Brayner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+toxicological+impact+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">The toxicological impact of nanoparticles.</a> Nano Today. 3 (1-2), 48-55 (2008).</li>
<li>Mendez-Bermudez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+control+of+heterochromatin+replication+by+the+telomere+capping+protein+TRF2%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide control of heterochromatin replication by the telomere capping protein TRF2.</a> Molecular Cell. 70 (3), 449-461 (2018).</li>
<li>Vindigni, A., Lopes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+electron+microscopy+with+single+molecule+DNA+fiber+approaches+to+study+DNA+replication+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Combining electron microscopy with single molecule DNA fiber approaches to study DNA replication dynamics.</a> Biophysical Chemistry. 225, 3-9 (2017).</li>
<li>Herrick, J., Bensimon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+analysis+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Single molecule analysis of DNA replication.</a> Biochimie. 81 (8-9), 859-871 (1999).</li>
<li>Taylor, J. H., Miner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Units+of+DNA+replication+in+mammalian+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Units of DNA replication in mammalian chromosomes.</a> Cancer Research. 28 (9), 1810-1814 (1968).</li>
<li>Nieminuszczy, J., Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+fibre+technique-tracking+helicases+at+work%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The DNA fibre technique-tracking helicases at work.</a> Methods. 108, 92-98 (2016).</li>
<li>Lemaçon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRE11+and+EXO1+nucleases+degrade+reversed+forks+and+elicit+MUS81-dependent+fork+rescue+in+BRCA2-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MRE11 and EXO1 nucleases degrade reversed forks and elicit MUS81-dependent fork rescue in BRCA2-deficient cells.</a> Nature Communications. 8, 860(2017).</li>
<li>Vindigni Lab. Replication Fork Protection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Washington+University+School+of+Medicine%22">Washington University School of Medicine</a>. , https://vindignilab.wustl.edu/research/replication-fork-protection (2020).</li>
<li>Mimitou, E. P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+end+resection%3A+Many+nucleases+make+light+work%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">DNA end resection: Many nucleases make light work.</a> DNA Repair. 8 (9), 983-995 (2009).</li>
<li>Schlacher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+break+repair-independent+role+for+BRCA2+in+blocking+stalled+replication+fork+degradation+by+MRE11%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Double-strand break repair-independent role for BRCA2 in blocking stalled replication fork degradation by MRE11.</a> Cell. 145 (4), 529-542 (2011).</li>
<li>Prado, F., Aguilera, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+replication+fork+progression+mediates+RNA+polII+transcription-associated+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Impairment of replication fork progression mediates RNA polII transcription-associated recombination.</a> The EMBO Journal. 24 (6), 1267-1276 (2005).</li>
<li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure%3A+Evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: Evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).</li>
<li>Halliwell, J. A., Gravells, P., Bryant, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+fiber+assay+for+the+analysis+of+DNA+replication+progression+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA fiber assay for the analysis of DNA replication progression in human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 115(2020).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+DNA+fiber+tracking+and+measurement%5BTitle%5D)+AND+%222011+IEEE+International+Symposium+on+Biomedical+Imaging%3A+From+Nano+to+Macro%22%5BJournal%5D)">Automated DNA fiber tracking and measurement.</a> 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 1349-1352 (2011).</li>
<li>Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+fiber+analysis%3A+Mind+the+gap%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">DNA fiber analysis: Mind the gap.</a> Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).</li>
<li>Técher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+dynamics%3A+Biases+and+robustness+of+DNA+fiber+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).</li>
<li>Martins, D. J., Tirman, S., Quinet, A., Menck, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+post-replicative+gaps+accumulation+and+repair+in+human+cells+using+the+DNA+fiber+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the DNA fiber assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e63448(2022).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Nous discutons ici d’une méthode pour aider à l’analyse de la variation de la dynamique de réplication de l’ADN en présence de nanoparticules par le biais du test de la fibre d’ADN. Les principales étapes critiques impliquées dans l’essai standard sont décrites dans le protocole (étape 2.2.2 et étape 3.1.3). Il est toujours recommandé d’utiliser une zone avec une exposition limitée à la lumière zénithale et un flux d’air constant pour éviter les cassures d’ADN induites par la lumière dans les lames ainsi que pour amélior...

Au cours de chaque cycle cellulaire, la réplication de l’ADN assure une duplication précise du génome1. La réplication chromosomique eucaryote dépend essentiellement de trois facteurs: le moment du déclenchement de plusieurs origines de réplication, la vitesse des fourches qui émergent des origines déclenchées et la fin du processus de réplication lorsque deux fourches de réplication d’origines adjacentes se rencontrent2. Pour la transmission haute fidélité de l’information génétique aux cellules filles, ainsi que pour la préservation de l’intégrité génétique, une réplication précise de l’ADN est cruciale. Les agents qui se développent à partir d’un métabolisme régulier ou qui sont dus à des matériaux environnementaux artificiels ou naturels attaquent constamment le génome. Ces agents endogènes et exogènes provoquent le ralentissement ou l’arrêt des fourches de réplication en raison de dommages à l’ADN causés par ces agents, et les fourches ralentissant ou s’arrêtant temporairement en réponse à ces difficultés sont appelées stress de réplication3. En réponse au stress de réplication, les cellules ont développé plusieurs voies moléculaires qui maintiennent la stabilité des fourches de réplication perturbées et leur permettent de redémarrer4. En termes de stabilité génétique, de survie cellulaire et de maladie humaine, ces mécanismes de réponse au stress de réplication sont apparus comme les facteurs clés pour maintenir un génome sain, assurer la survie des cellules et réduire la probabilité de formation de la maladie5.
L’un des agents exogènes capables de produire un stress de réplication est les nanoparticules. Les nanoparticules sont des particules dont la taille varie de 1 nm à 100 nm6. En raison de leurs surfaces élevées, de leurs formes distinctives et de leurs propriétés chimiques uniques, les nanoparticules sont utilisées dans diverses applications médicales, pharmaceutiques, environnementales et industrielles 7,8. Bien que les nanoparticules aient de nombreux avantages potentiels, certaines d’entre elles (en raison de leur nature héréditaire ou de leur longévité) peuvent devenir toxiques. Des nanoparticules peuvent également se former en raison de l’usure naturelle des implants médicaux et être libérées dans la région péri-prothétique 9,10.
En raison de l’exposition des humains à une myriade de nanoparticules produites pour diverses applications, la recherche dans le domaine de la toxicité des nanoparticules a considérablement augmenté au cours des 10 dernières années11. Bien que ces efforts de recherche aient révélé une abondance d’informations sur la menace potentielle que représentent les nanoparticules pour la santé humaine, les connaissances sur le potentiel de génotoxicité des nanoparticules sont encore limitées. Ce qui a été découvert jusqu’à présent, c’est que ces nanoparticules peuvent interagir physiquement avec l’ADN, favoriser les dommages à l’ADN et endommager ou interférer avec les protéines responsables de la réparation ou de la réplication de l’ADN12. Pour détecter comment ils interfèrent avec la réplication de l’ADN, le peignage des fibres d’ADN, la synthèse d’ADN radiorésistante (RDS) et l’analyse des fibres d’ADN sont généralement utilisés13,14,15,16.
La méthode de peignage des fibres d’ADN est flexible et donne des informations sur la dynamique de la fourche de réplication au niveau de la molécule unique17. En substance, une lamelle de couverture salinisée est délicatement retirée de la solution d’ADN une fois que l’ADN se lie à elle. Les molécules d’ADN sont redressées et alignées par le ménisque de la solution. L’homogénéité, l’espacement et l’alignement des fibres d’ADN permettent des mesures précises et fiables de la longueur des faisceaux de fibres. En ajustant la durée et la séquence des traitements et des médicaments utilisés pour causer du stress ou des dommages, de nombreux aspects de l’avancement de la fourchette peuvent être surveillés à l’aide de cette application. Dans cette méthode, un système de double étiquetage est utilisé, grâce auquel la vitesse et la progression de la fourche de réplication sont évaluées17,18. D’autre part, l’électrophorèse sur gel 2D tire parti du fait que, dans l’électrophorèse sur gel d’agarose, les structures d’ADN ramifiées se déplacent plus lentement que les molécules d’ADN linéaires de même masse, ce qui permet la séparation nette des deux dans un cycle 2D. En fait, cette méthode est étudiée pour séparer les molécules d’ADN en fonction de leur masse lors de la première exécution et en fonction de leur forme lors de la deuxième exécution orthogonale. Après la fragmentation de l’ADN génomique, les intermédiaires de réplication et de recombinaison peu communs développent une forme ramifiée, et ils peuvent être distingués des molécules linéaires plus courantes dans le gel 2D19.
La méthode RDS est utilisée pour déterminer comment la synthèse globale de l’ADN est affectée. Dans cette méthode, le degré d’inhibition de la réplication globale est déterminé en comparant la quantité de nucléotides marqués radioactivement incorporés, tels que la thymidine [14C], dans les cellules non traitées par rapport aux cellules traitées14,20. La différence en pourcentage de radiomarquage entre les cellules non traitées et traitées représente la mesure dans laquelle l’agent endommageant l’ADN affecte la synthèse de l’ADN. De même, une autre méthode utilise la capacité des cellules à intégrer des analogues nucléotidiques comme BrdU (5-bromo-2′-désoxyuridine) pour la cytométrie en flux afin de mesurer les taux globaux de synthèse de l’ADN21,22. Bien que ces méthodes démontrent comment les agents endommageant l’ADN ont un impact sur la synthèse globale de l’ADN, elles ne montrent pas comment les réplicons individuels sont affectés. En effet, les tests au niveau du réplicon sont impératifs pour mieux comprendre l’initiation et l’étendue de l’instabilité génomique en cas d’exposition à des particules toxiques (nanomatériaux). L’autoradiographie sur fibre d’ADN et la microscopie électronique sont quelques méthodes utilisées pour déterminer ce23,24,25,26.
Les concepts de bulles de réplication et de réplication bidirectionnelle à partir de sources inégalement espacées ont d’abord été développés à l’aide de tests à molécule unique comme la microscopie électronique et l’autoradiographie sur fibre d’ADN27,28. L’observation directe des intermédiaires de réplication ramifiée sur des molécules spécifiques dispersées sur une grille recouverte de carbone est grandement facilitée par la microscopie électronique. Cette méthode, qui est encore utilisée aujourd’hui pour suivre les changements pathologiques aux fourches de réplication, a été utilisée pour localiser la première origine eucaryote de la réplication de l’ADN28. L’autoradiographie par fibre est centrée sur le concept de l’identification autoradiographique des zones nouvellement répliquées et le marquage des chromosomes avec la thymidine tritiée. La première évaluation quantitative des densités d’origine et des taux de fourche de réplication dans les séquences génomiques métazoaires a été rendue possible par l’autoradiographie des fibres d’ADN29.
Actuellement, les méthodes de fluorographie par fibre ont pris la place de l’autoradiographie, principalement parce que la fluorographie par fibre est beaucoup plus rapide que l’autoradiographie. Dans la fluorographie par fibres, deux dérivés nucléotidiques halogénés, tels que le bromo- (Br), le chloro- (Cl) ou l’iododésoxyuridine (IdU), sont incorporés séquentiellement dans l’ADN fraîchement répliqué, puis identifiés par immunofluorescence indirecte à l’aide d’anticorps30. L’observation microscopique de l’ADN naissant qui a incorporé l’un ou les deux analogues est rendue possible par immunomarquage de l’un des analogues dans une couleur et l’autre analogue dans une couleur différente (p. ex., immunomarquage de l’ADN naissant avec rouge IdU incorporé et vert CldU incorporé) (Figure 1)21. De nombreux types différents d’intermédiaires de réplication peuvent être identifiés par l’analyse des fibres d’ADN. Les plus couramment étudiés sont les fourches allongées individuelles, les initiations et les terminaisons. Les fourches allongées individuelles ont un motif de réplication de rouge suivi de vert (rouge-vert; Figure 2A). 13 Les longueurs de ces intermédiaires sont fréquemment utilisées pour mesurer la vitesse de la fourche (c.-à-d. la longueur de la fourche/temps d’impulsion) ou la dégradation exonucléolytique de l’ADN naissant par raccourcissement de la piste (figure 2E)30,31,32. Dans une étude de Mimitou et al., il a été constaté que lors d’une exposition à long terme à l’hydroxyurée, un poison de réplication qui provoque des cassures double brin dans l’ADN, RE11 a été recruté33. MRE11 est une exonucléase connue pour son activité exonucléase 3'-5', et elle est capable de couper les extrémités de l’ADN pour la réparation. Par conséquent, lorsqu’il est exposé à des agents toxiques, on peut observer une dégradation exonucléolytique de l’ADN naissant, qui est le raccourcissement du brin d’ADN dû à l’exposition à un agent endommageant l’ADN34.
Les ruptures de fourche de réplication provoquées par des obstructions physiques (complexes ADN-protéines ou lésions ADN), des obstacles chimiques ou des mutations peuvent arrêter la réplication et nécessiter une recombinaison homologue pour la redémarrer. C’est ce qu’on appelle la progression altérée de la fourche. De nombreuses études in vitro et in vivo ont indiqué que la transcription peut, à l’occasion, empêcher l’avancement de la fourchette de réplication de cette manière35.
Les initiations sont des origines de réplication qui initient et se déclenchent pendant la première ou la deuxième impulsion. Les origines qui se déclenchent lors de la première impulsion et ont des fourches de réplication qui continuent d’être actives ont un motif vert-rouge-vert (Figure 2B, ci-dessous). Les origines qui commencent au cours de la deuxième impulsion ont un motif vert seulement (Figure 2B, ci-dessus) et sont parfois appelées origines nouvellement initiées, de sorte que ces origines peuvent être différenciées de celles qui commencent pendant la première impulsion. La comparaison des pourcentages relatifs d’origines nouvellement déclenchées entre deux conditions expérimentales permet de comprendre comment une cellule répond à un agent endommageant l’ADN ou à la présence ou à l’absence d’une protéine. Les terminaisons sont créées lorsque deux fourches de réplication de réplicons adjacents fusionnent et qu’elles ont un motif rouge-vert-rouge (Figure 2D)30.
Sur la base des faits décrits ci-dessus, l’analyse des fibres d’ADN est actuellement considérée comme une méthode privilégiée pour étudier la variation de la dynamique de réplication de l’ADN causée par des agents toxiques tels que les nanomatériaux. Les chercheurs ont maintenant une bonne compréhension et connaissance de la dynamique de la réplication de l’ADN à l’échelle du génome chez les eucaryotes, à la fois quantitativement et qualitativement, grâce à la découverte de cette technologie36. Sur la base des variables de résultat, plusieurs méthodologies peuvent être adoptées. Quelques exemples de méthodes pour étudier les variations des dommages à l’ADN induits par des agents externes/nanoparticules sont présentés à la figure 3. L’objectif global de la méthode d’analyse des fibres d’ADN décrite dans cette étude est de déterminer comment les nanoparticules affectent le processus de réplication in vitro et comment elles affectent différentiellement divers tissus.

<table><tbody><tr><td>Plaque 24 puits</td><td>de marque Fisher</td><td>FB012929</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Alexa farine 594 chèvre anti-lapin&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 poulet anti-rat&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>A21470</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 chèvre anti-poulet&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 594 lapin anti-souris&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>A11062</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>CldU</td><td>Sigma Aldrich</td><td>50-90-8</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles (22 x 50 mm)</td><td>Marque Fisher</td><td>12-545-EP</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope givrées Marque</td><td>Fisher</td><td>12-550-11</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>IdU&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>54-42-2</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BrdU&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td></td></tr><tr><td>Tampon Phosphate Saline</td><td>Gibco</td><td>10010072</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-BrdU&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>BU1--75(ICR1)</td><td></td></tr><tr><td>Cellules macrophages brutes 264.5</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Silane-Prep diapositives</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4651-72EA&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost gold plus lames</td><td>Fischer scientific</td><td>22-035813</td><td></td></tr><tr><td>Tris pH 7.4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77861</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

démonstration du test de fibre d’adn pour étudier les dommages à l’adn et la dynamique de réparation induits par les nanoparticules

Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles

L’exposition aux nanomatériaux peut provoquer un stress de réplication et une instabilité génomique dans les cellules. Le degré d’instabilité dépend de la chimie, de la taille et de la concentration des nanomatériaux, du temps d’exposition et du type de cellule exposée. Plusieurs méthodes établies ont été utilisées pour élucider l’impact des agents endogènes/exogènes sur la réplication mondiale. Cependant, les tests au niveau du réplicon, tels que le test de la fibre d’ADN, sont essentiels pour comprendre comment ces agents influencent l’initiation de la réplication, les terminaisons et la progression de la fourche de réplication. Savoir cela permet de mieux comprendre comment les nanomatériaux augmentent les risques de fixation des mutations et d’instabilité génomique. Nous avons utilisé des macrophages RAW 264.7 comme cellules modèles pour étudier la dynamique de réplication sous exposition à des nanoparticules d’oxyde de graphène. Ici, nous démontrons le protocole de base pour le test des fibres d’ADN, qui comprend le marquage par impulsions avec des analogues nucléotidiques, la lyse cellulaire, l’étalement des fibres d’ADN marquées par impulsions sur des lames, l’immunomarquage fluorescent des analogues nucléotidiques dans les fibres d’ADN, l’imagerie des intermédiaires de réplication dans les fibres d’ADN à l’aide de la microscopie confocale et l’analyse intermédiaire de réplication à l’aide d’un logiciel de notation et d’analyse assisté par ordinateur (CASA).

Après avoir obtenu suffisamment d’images (de 20 à 100 images par condition), les intermédiaires de réplication doivent être identifiés, mesurés et comptés. Qu’il s’agisse d’analyser les fibres manuellement ou automatiquement via un programme38, il est nécessaire de définir clairement quelles caractéristiques une fibre doit avoir pour qu’elle soit comptée ou notée (ou non comptée ou mesurée)39. Par exemple, les questions suivantes peuvent être examinées. (1) Faut-il...

La méthodologie aide à l’analyse de la variation de la dynamique de réplication de l’ADN en présence de nanoparticules. Différentes méthodologies peuvent être adoptées en fonction du niveau de cytotoxicité du matériau d’intérêt. En outre, une description de l’analyse de l’image est fournie pour aider à l’analyse des fibres d’ADN.

Démonstration du test de fibre d’ADN pour étudier les dommages à l’ADN et la dynamique de réparation induits par les nanoparticules

Nanomaterial exposure can cause replication stress and genomic instability in cells. The degree of instability depends on the chemistry, size, and ...

L’analyse des fibres d’ADN nous permet de comprendre l’impact des nanomatériaux sur l’ADN au niveau moléculaire. Et cette information permettra d’élaborer des stratégies qui réduiront la nanotoxicité. Cette technique nous permet de comprendre la dynamique de l’ADN et son impact lorsque les cellules ou les tissus sont exposés à des agents endommageant l’ADN, exogènes ou endogènes, et nous pouvons examiner la réplication de l’ADN, la réparation de l’ADN et la dynamique de la chromatine. L’étude de la dynamique de réplication de l’ADN et du mécanisme de réparation aidera à développer des stratégies qui amélioreront l’efficacité du matériel thérapeutique ou réduiront l’effet hors cible de la nanomédecine.Ce que nous voulons vraiment que les gens sachent à propos de cette technique, c’est que ce sont les différentes choses que nous pouvons ou qu’une personne peut faire. L’une consiste à comprendre comment de nouveaux agents chimiothérapeutiques peuvent avoir un impact sur la santé d’une cellule, pour voir si vous pouvez les tuer plus rapidement ou plus efficacement. La prochaine chose est de penser à quand vous ajoutez un agent, dis-le est un nouvel agent thérapeutique ou pharmaceutique

demonstration-dna-fiber-assay-for-investigating-dna-damage-repair

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Les lasers sont fréquemment utilisés dans les études de la réponse cellulaire aux dommages de l'ADN. Cependant, ils génèrent des lésions dont l'espacement, la fréquence et les collisions avec les fourches de réplication sont rarement caractérisés. Nous décrivons ici une approche qui permet la détermination de ces paramètres avec réticule laser localisé interbrins.

Analyse des molécule laser Localisés psoralène adduits

Ici, il est démontré comment le dosage in situ de ligature de proximité (PLA) peut être utilisé pour détecter et visualiser les interactions directes protéines-protéines entre ATM et p53 dans des cultures de cellules en suspension exposées au stress génotoxique.

Détection et visualisation des complexes protéiques induits par endommagement de l&#39;ADN dans des cultures cellulaires en suspension utilisant l&#39;essai de ligature de proximité

Laser microirradiation est un outil utile pour l’étude de la réparation de l’ADN dans les cellules vivantes. Une approche méthodologique pour l’utilisation des lasers UVA pour induire diverses lésions de l’ADN est montrée. Nous avons optimisé une méthode pour microirradiation locale qui gère le cycle cellulaire normal ; ainsi, les cellules irradiées passent par mitose.

Avancée des Techniques de microscopie confocale afin d’étudier les interactions entre protéines et cinétique aux lésions de l’ADN

Ce protocole vise à décrire l’utilisation de laser microirradiation d’induire différents types de lésions de l’ADN, y compris relativement simples brins et lésions complexes, afin d’étudier l’ADN des dommages de signalisation et de réparation facteur Assemblée à sites de dommages in vivo .

Laser Microirradiation à l’étude In Vivo des réponses cellulaires aux dommages d’ADN simples et complexes

Étude cinétique de réparation des dommages ADN nécessite un système d’induire des lésions à des régions sub nucléaires définies. Les auteurs décrivent une méthode pour créer des sauts de double-brin localisées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser équipé d’un laser à 405 nm et fournir des procédures automatisées afin de quantifier la dynamique des facteurs de réparation à ces lésions.

Enquête sur le recrutement de protéines aux lésions de l’ADN à l’aide de 405 Nm Laser Micro-irradiation

La réponse aux dommages causés par l’ADN par rayonnement activé par le faisceau mixte de neutrons utilisé dans la thérapie de capture de neutrons de bore (BNCT) n’a pas été entièrement établie. Ce protocole fournit une procédure étape par étape pour détecter les foyers induits par rayonnement (RIF) des protéines de réparation par la coloration d’immunofluorescence dans les lignées cellulaires du cancer du côlon humain après irradiation avec le faisceau mélangé à neutrons.

Imagerie d’immunofluorescence des dommages d’ADN et des foyers de réparation dans les cellules cancéreuses du côlon humain

Suite à des dommages à l’ADN, les cellules humaines activent des voies de réparation essentielles pour restaurer l’intégrité de leur génome. Ici, nous décrivons la méthode de l’immunofluorescence indirecte comme un moyen de détecter les protéines de réparation de l’ADN, d’analyser leur recrutement spatial et temporel, et d’aider à interroger l’interaction protéine-protéine sur les sites de dommages à l’ADN.

Visualisation de l’ADN Réparation des protéines Interaction par immunofluorescence

Cet article présente les étapes essentielles de immunoprecipitation d’immunostaining et de chromatine. Ces protocoles sont couramment utilisés pour étudier les processus cellulaires liés aux dommages à l’ADN et pour visualiser et quantifier le recrutement des protéines impliquées dans la réparation de l’ADN.

Visualisation et quantification des dommages à l’ADN spécifiques au site à base d’endonucléase

Nous décrivons ici deux modifications du test de la fibre d’ADN pour étudier les lacunes de l’ADN monocaténaire dans la réplication de l’ADN après l’induction de la lésion. Le test de fibre S1 permet la détection des lacunes post-réplicatives à l’aide de l’endonucléase S1 spécifique à l’ADNSS, tandis que le test de remplissage des lacunes permet la visualisation et la quantification de la réparation des lacunes.

Détection de l’accumulation et de la réparation des lacunes post-réplicatives dans les cellules humaines à l’aide du test de fibre d’ADN

Nous présentons des protocoles pour l’évaluation de la compétence de la voie de réparation des cassures double brin dans les cellules à l’aide d’une série de substrats rapporteurs extrachromosomiques basés sur la luminescence.

Évaluation de l’activité de réparation des cassures double brin de l’ADN à l’aide de dosages rapporteurs à haut débit et quantitatifs basés sur la luminescence

Découvrez l'analyse de fibres d'ADN pour étudier les dommages à l'ADN et la réparation induits par les nanoparticules. Cette méthode aide à développer des agents thérapeutiques plus sûrs en nanomédecine.

Démonstration du test de fibre d’ADN pour étudier les dommages à l’ADN et la dynamique de réparation induits par les nanoparticules (Vidéo) | JoVE Journal

Démonstration du test de fibre d’ADN pour étudier les dommages à l’ADN et la dynamique de réparation induits par les nanoparticules

Explorer plus de vidéos