Name: Caractérisation fonctionnelle et visualisation de fibroblastes œsophagiens à l’aide de co-cultures organoïdes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Découvrez la caractérisation fonctionnelle des fibroblastes œsophagiens par co-cultures organoïdes et imagerie en montage total. Ce modèle permet d'étudier les interactions entre fibroblastes et cellules souches.

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Cette étude a été soutenue par ERC StG TroyCAN (851241). E.E. est un associé postdoctoral de Cancerfonden. M.G. est boursier Ragnar Söderberg et chercheur junior Cancerfonden. Nous sommes reconnaissants de l’assistance technique des installations principales du Karolinska Institutet, y compris l’installation centrale de cytométrie en flux Biomedicum, la centrale d’imagerie Biomedicum (BIC) et l’installation vétérinaire Comparative Medicine Biomedicum (KMB). Nous remercions les membres du laboratoire Genander d’avoir lu attentivement et commenté le protocole.

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<li>Lohmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+cervical+tissue+dynamics+and+viral+oncogenesis+in+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer.</a> Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).</li>
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<li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+murine+esophageal+organoid+culture+method+and+organoid-based+model+of+esophageal+squamous+cell+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia.</a> iScience. 24 (12), 103440(2021).</li>
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<li>Kasagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+esophageal+organoid+system+reveals+functional+interplay+between+notch+and+cytokines+in+reactive+epithelial+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The esophageal organoid system reveals functional interplay between notch and cytokines in reactive epithelial changes.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (3), 333-352 (2018).</li>
<li>Plikus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts%3A+Origins%2C+definitions%2C+and+functions+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts: Origins, definitions, and functions in health and disease.</a> Cell. 184 (15), 3852-3872 (2021).</li>
<li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mesenchymal+cell+populations+generate+the+essential+intestinal+BMP+signaling+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct mesenchymal cell populations generate the essential intestinal BMP signaling gradient.</a> Cell Stem Cell. 26 (3), 391-402 (2020).</li>
<li>Cordero-Espinoza, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cell+contacts+between+periportal+mesenchyme+and+ductal+epithelium+act+as+a+rheostat+for+liver+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic cell contacts between periportal mesenchyme and ductal epithelium act as a rheostat for liver cell proliferation.</a> Cell Stem Cell. 28 (11), 1907-1921 (2021).</li>
<li>Pastula, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+gastrointestinal+organoid+culture+in+combination+with+nerves+or+fibroblasts%3A+a+method+to+characterize+the+gastrointestinal+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional gastrointestinal organoid culture in combination with nerves or fibroblasts: a method to characterize the gastrointestinal stem cell niche.</a> Stem Cells International. 2016, 3710836(2016).</li>
<li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).</li>
<li>McGinn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomechanical+switch+regulates+the+transition+towards+homeostasis+in+oesophageal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A biomechanical switch regulates the transition towards homeostasis in oesophageal epithelium.</a> Nature Cell Biology. 23 (5), 511-525 (2021).</li>
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<li>Ohlund, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+inflammatory+fibroblasts+and+myofibroblasts+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).</li>
<li>Pentinmikko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notum+produced+by+Paneth+cells+attenuates+regeneration+of+aged+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notum produced by Paneth cells attenuates regeneration of aged intestinal epithelium.</a> Nature. 571 (7765), 398-402 (2019).</li>
<li>Janson, D., Rietveld, M., Willemze, R., El Ghalbzouri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+serially+passaged+fibroblasts+on+dermal+and+epidermal+morphogenesis+in+human+skin+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Effects of serially passaged fibroblasts on dermal and epidermal morphogenesis in human skin equivalents.</a> Biogerontology. 14 (2), 131-140 (2013).</li>
<li>Landry, N. M., Rattan, S. G., Dixon, I. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+maintaining+primary+murine+cardiac+fibroblasts+in+two-dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An improved method of maintaining primary murine cardiac fibroblasts in two-dimensional cell culture.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12889(2019).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Le protocole présenté ici établit un modèle in vitro pour étudier les interactions fonctionnelles entre l’épithélium et les fibroblastes de l’œsophage.
La couche épithéliale est séparée du stroma, ce qui permet un protocole de dissociation optimisé pour le compartiment épithélial et stromal. Malgré l’optimisation du protocole de dissociation épithéliale, des amas tissulaires restent apparents. Pipeter de haut en bas vigoureusement toutes les 15 minutes diminue considérablement le nombre et la taille des touffes. D’autres protocoles utilisent la trypsine pour dissocier davantage la couche épithéliale 5,6. Ici, l’utilisation de trypsine, ou l’augmentation du temps de dissociation, n’est pas recommandée, car cela tend à entraîner une diminution de la viabilité des cellules épithéliales et de l’efficacité de la formation organoïde. Contrairement à l’épithélium, le stroma est facilement dissociable, et 30 min en solution de dissociation donnent une suspension unicellulaire avec ~90% de viabilité des fibroblastes (Figure 1E). L’exclusion de l’étape de séparation épithéliale-stomale dans le protocole augmente considérablement le temps de dissociation, ce qui entraîne une diminution de la viabilité des fibroblastes et un rendement plus faible des cellules épithéliales. De plus, la séparation de l’épithélium du stroma permet de déterminer le nombre de cellules de chaque population et de mélanger les cellules épithéliales et les fibroblastes de différentes lignées de souris lors de la mise en place des co-cultures.
L’étude de la fonction des fibroblastes sur la croissance organoïde est une méthode couramment utilisée en biologie des cellules souches 9,10,11,15,16. Les milieux de coculture établis sont soit du DMEM complété par 10% de sérum de veau fœtal (FCS)9,15 ou un milieu réduit en facteur de croissance10,16. Dans ce protocole, le milieu réduit du facteur de croissance est utilisé pour imiter les conditions dans la niche des cellules souches in vivo, où les fibroblastes sont en grande partie au repos. Le FCS est un sérum riche en facteur de croissance qui entraîne l’activation et la prolifération des fibroblastes dans les co-cultures, correspondant probablement à un état cellulaire de fibroblastes distinct de l’état in vivo. En excluant le FCS et en réduisant les facteurs de croissance, de sorte que le milieu seul (ERfaible) ne favorise pas la croissance organoïde et ne stimule pas la prolifération des fibroblastes, il est possible d’isoler l’effet des fibroblastes sur la croissance organoïde. Dans ce milieu, NOGGIN est supprimé et RSPO réduit au minimum (10% RPSO). Il a été démontré que NOGGIN et RSPO sont essentiels à la croissance des organoïdes œsophagiens6. L’EGF a été retenu dans le milieu de coculture, car il ne supporte pas la croissance organoïde par lui-même. Cependant, les fibroblastes sont également capables de soutenir la croissance organoïde dans un milieu réduit en EGF (E faible Rfaible; Figure 2B, D).
Les co-cultures organoïdes ne peuvent pas être maintenues par passage car les fibroblastes sont perdus lors de la trypsinisation. Cependant, le passage organoïde a été inclus dans le protocole puisque les organoïdes œsophagiens peuvent être maintenus, étendus et utilisés pour d’autres expériences en mono-cultures. Les organoïdes passés issus de monocultures peuvent être utilisés pour mettre en place des co-cultures avec des fibroblastes fraîchement isolés. Un inconvénient de l’utilisation de cellules primaires est le nombre de souris nécessaires pour mettre en place plusieurs co-cultures organoïdes. Lorsque l’on se concentre sur de petites sous-populations de fibroblastes, le nombre de co-cultures obtenues est limité. Dans d’autres protocoles, les fibroblastes sont d’abord développés en culture avant de les utiliser pour mettre en place des co-cultures organoïdes10. Cependant, les fibroblastes changent de morphologie et d’identité au cours du passage, comme le montrent l’utilisation de fibroblastes primitifs de la peau et du cœur17,18. La transmission 2D conventionnelle des fibroblastes œsophagiens entraîne à la fois des changements de morphologie et de phénotype, démontrant que l’enrichissement in vitro des fibroblastes ne convient pas aux co-cultures visant à phénocopier la niche des cellules souches endogènes.
La coloration de montage entier fournit un outil pour maintenir et visualiser l’interaction fibroblaste-organoïde. Il convient de noter que, bien que tous les organoïdes n’aient pas de fibroblastes directement attachés, la plupart des organoïdes sont en contact avec des fibroblastes (voir la figure 2C). Pour maintenir les interactions épithéliale-fibroblaste, il est important de manipuler les organoïdes avec soin et d’éviter le pipetage vigoureux, le vortex et la rotation à grande vitesse. Une fixation optimale est importante pour maintenir l’architecture tissulaire 3D, ainsi que pour maintenir la fluorescence endogène. Une fixation de 30 minutes suffit à retenir le signal H2BeGFP et est optimale pour les anticorps utilisés dans ce protocole, mais cela peut varier entre les fluorophores et les anticorps utilisés. Le nettoyage des organoïdes réduit la diffusion de la lumière et améliore considérablement la visualisation de l’ensemble de la structure 3D. Comme les organoïdes sont petits, le défrichage est facile et rapide; cependant, l’imagerie d’organoïdes entiers à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser peut prendre beaucoup de temps, car plusieurs piles Z doivent être fabriquées. Les microscopes confocaux, comme le disque rotatif, peuvent être utilisés pour réduire le temps d’imagerie.
Dans l’ensemble, les organoïdes œsophagiens cultivés en présence de fibroblastes constituent un outil précieux pour comprendre certains aspects de la niche des cellules souches œsophagiennes. De plus, le nettoyage de monture entière fournit une méthode accessible pour visualiser l’interaction entre les fibroblastes et les organoïdes.

Les organoïdes sont utilisés comme tests 3D in vitro pour caractériser les cellules souches et progénitrices, ainsi que pour comprendre les signaux de signalisation dérivés des composants cellulaires de la niche des cellules souches 1,2,3,4. Les organoïdes œsophagiens de souris ont été décrits pour la première fois en 2014 et plusieurs articles ont identifié des facteurs de croissance, tels que la R-Spondine (RSPO), NOGGIN et le facteur de croissance épidermique (EGF), nécessaires au maintien et au passage des organoïdes œsophagiens 5,6,7, faisant valoir que des signaux de signalisation similaires sont nécessaires pour in vivo renouvellement des cellules progénitrices. Cependant, des facteurs de croissance sont généralement ajoutés à des concentrations non physiologiques, ce qui entraîne des conditions de croissance organoïdes qui ne reflètent pas nécessairement l’environnement de signalisation in vivo.
Les fibroblastes sont des populations de cellules stromales hétérogènes qui soutiennent les propriétés des cellules progénitrices dans de nombreuses niches de cellules souches8. La combinaison de cellules progénitrices épithéliales et de fibroblastes dans la même culture organoïde permet la formation d’organoïdes à des concentrations réduites de facteurs de croissance exogènes. Des systèmes de co-culture organoïdes provenant d’épithélium intestinal et hépatique sont décrits, mais un protocole pour établir des co-cultures organoïdes-fibroblastes œsophagiennes est toujours en suspens 9,10,11.
Dans ce protocole, deux stratégies de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour les fibroblastes de l’œsophage, utilisant soit des souris transgéniques PdgfrαH2BeGFP 12 ou des souris de type sauvage avec une coloration classique par anticorps, sont décrites. Différentes sous-populations de fibroblastes peuvent être isolées à l’aide de marqueurs de surface cellulaire de choix, offrant ainsi une flexibilité au protocole. De plus, une technique d’imagerie par fluorescence 3D préservant la morphologie organoïde est utilisée pour caractériser les interactions fibroblastes-organoïdes. Le nettoyage organoïde fournit une méthode rapide pour augmenter la profondeur de pénétration de la lumière dans les organoïdes, améliorant la visualisation des connexions organoïdes-fibroblastes et permettant la récapitulation de la structure organoïde dans son intégralité. Ce protocole combine la co-culture organoïde œsophagienne avec une stratégie d’imagerie complète de montage, permettant une caractérisation fonctionnelle de l’interaction fibroblaste-organoïde.

<table><tbody><tr><td>Supplément B-27 (50X), sans sérum</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp ; Matrigel&nbsp ; Facteur de croissance réduit (DFG) Membrane basale Matrix</td><td>Fisher</td><td>scientifique 356231</td><td></td></tr><tr><td>Diméthyl sulfoxyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplément</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénol</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>14175-129</td><td></td></tr><tr><td>Sérum d’âne normal</td><td>Jackson Immuno</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 solution</td><td>Merck</td><td>93443-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td><fort>Produits chimiques, peptides et protéines recombinantes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>solution DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Solution de dissociation : 0,25 mg/ml Liberase TM, 0,25 mg/ml Dnase dans HBSS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>11284932001</tr><tr><td>Formaldéhyde, 37 %, avec 10-15 % de méthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401127001</td><td></td></tr><tr><td>N-Acétyl-cystéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-25G</td><td></td></tr><tr><td>Noggin murine</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear 1.47</td><td>SunJin Lab</td><td>#RC147001</td><td></td></tr><tr><td>Protéine EGF de souris recombinante, CF</td><td>R& D systems</td><td>2028-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin-1 murin</td><td>Peprotech</td><td>315-32</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Blue Dead Cell Stain</td><td>Thermo Fisher</td><td>S34857</td><td></td></tr><tr><td>Thermolysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7902-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorhydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Plastique & Verrerie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Filtres à cellules stériles 40um</td><td>VWR</td><td>15360801</td><td></td></tr><tr><td>Corning Filtres à cellules stériles 70um</td><td>VWR</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Menzel Deckgl&auml ; Thermo</td><td>Fisher</td><td>Q10143263NR15</td><td></td></tr><tr><td>Tube à réaction SafeSeal, 1,5 mL, PP</td><td>Sarstedt</td><td>72.706</td><td></td></tr><tr><td>Snap Cap Tubes de microcentrifugation à faible rétention 0,6 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3446</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Slides</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td></td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.05 mm 4 puits circulaire iSpacer</td><td>SunJin Lab</td><td>#IS204</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pince, pointe de biologie</td><td>F.S.T</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Pen</td><td>VectorLaboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort inclinés vers le côté pointe sphérique 8mm Cutting Edge</td><td>F.S.T</td><td>15033-09</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal Stellaris 5&nbsp ;</td><td>Microscope de dissection Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Stemi 305</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS ARIA III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorps conjugués pour FACSAlexa</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Fluor 647 anti-souris CD104 Clone Clone : 346-11A</td><td>123608</td><td>123608</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-souris CD26 (DPP-4) APC</td><td>H194-112</td><td>H194-112</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-souris/humain CD324 (E-Cadhérine) Anticorps</td><td>147310</td><td>147310</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps pour l’immunofluorescence</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD104 (&szlig ;-integrine 4) Clone : 346-11A</td><td>BioLegend</td><td>553745</td><td></td></tr><tr><td>Cytokératine 14</td><td>Acris Anticorps (AbD Serotec)</td><td>BP5009</td><td></td></tr><tr><td>Cytokératine13 Clone : EPR3671</td><td>abcam</td><td>ab92551</td><td></td></tr><tr><td>E-cadhérine (CD324) Clone : 2.40E+11</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>3195</td><td></td></tr><tr><td>Keratin 5 Anticorps polyclonal de poulet, purifié Clone : Poly9059</td><td>BioLegend</td><td>905901</td><td></td></tr><tr><td>p63 Clone : 4a4</td><td>abcam</td><td>ab735</td><td></td></tr><tr><td>Clone recombinant anti-KLF4 antibod : EPR20753-25</td><td>abcam</td><td>ab214666</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5733</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaires</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-species* avec fluorophore au choix</td><td>Jackson Immuno</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

caractérisation fonctionnelle et visualisation de fibroblastes œsophagiens à l’aide de co-cultures organoïdes

Functional Characterization and Visualization of Esophageal Fibroblasts Using Organoid Co-Cultures

Les cellules souches épithéliales et progénitrices contribuent à la formation et au maintien de la barrière épithéliale tout au long de la vie. La plupart des populations de cellules souches et progénitrices sont cachées dans des endroits anatomiquement distincts, ce qui permet des interactions exclusives avec des signaux de niche qui maintiennent la souche. Alors que le développement de cultures organoïdes épithéliales fournit un outil puissant pour comprendre le rôle des cellules souches et progénitrices dans l’homéostasie et la maladie, l’interaction dans l’environnement de niche est largement absente, entravant ainsi l’identification des facteurs influençant le comportement des cellules souches. Les fibroblastes jouent un rôle clé dans la direction du destin de la tige épithéliale et des progéniteurs. Ici, un protocole complet de co-culture organoïde-fibroblaste permettant la délimitation des sous-populations de fibroblastes dans le renouvellement et la différenciation des cellules progénitrices de l’œsophage est présenté. Dans ce protocole, une méthode pour isoler à la fois les cellules épithéliales et les fibroblastes en parallèle de l’œsophage est décrite. Des stratégies distinctes de tri cellulaire activées par fluorescence pour isoler à la fois les cellules progénitrices de l’œsophage ainsi que les sous-populations de fibroblastes de souris rapporteures transgéniques ou de souris de type sauvage sont décrites. Ce protocole fournit une approche polyvalente qui peut être adaptée pour permettre l’isolement de sous-populations spécifiques de fibroblastes. L’établissement et la transmission de monocultures organoïdes épithéliales œsophagiennes sont inclus dans ce protocole, ce qui permet une comparaison directe avec le système de co-culture. En outre, une approche de nettoyage 3D permettant une analyse détaillée des images des interactions épithélio-fibroblastes est décrite. Collectivement, ce protocole décrit une méthode comparative et à débit relativement élevé pour identifier et comprendre les composants de niche des cellules souches œsophagiennes in vitro.

L’œsophage est divisé en différentes couches : épithélium, lamina propria, sous-muqueuse et musculeuse externe (figure 1A). Les fibroblastes résident dans la sous-muqueuse et la lamina propria, appelée stroma. Dans ce protocole, la musculeuse externe est enlevée mécaniquement (Figure 1B), ce qui n’entraîne pas de perte de fibroblastes (PdgfrαH2BeGFP+) résidant dans le stroma (Figure 1C). Avant la dissociation, l’épithélium est séparé du stroma, ce qui donne deux segments tissulaires (Figure 1B). La séparation des deux couches offre la possibilité d’augmenter le temps de dissociation de la couche épithéliale plus robuste par rapport à la couche stromale fragile. De cette façon, un protocole d’isolement efficace produisant à la fois des cellules progénitrices épithéliales viables ainsi que des fibroblastes stromaux est établi (Figure 1B). Les cellules progénitrices œsophagiennes sont triées en fonction de leur expression élevée en INTEGRIN-β4 et E-CADHERIN (Figure 1C,D).
Les sous-populations de fibroblastes peuvent être isolées à l’aide de marqueurs distincts. Dans ce protocole, une stratégie d’isolement des fibroblastes basée sur les marqueurs de fibroblastes couramment utilisés PDGFRα et DPP4 (CD26) est fournie. L’isolement par l’expression du rapporteur PdgfrαH2BeGFP ou l’anticorps DPP4 montre qu’environ 50% des cellules isolées sont des fibroblastes (Figure 1E,F). De plus, 70 % des fibroblastes PDGFRα+ sont DPP4+, ce qui indique qu’une population de fibroblastes qui se chevauche largement, mais pas identique, est obtenue. Après avoir isolé les populations de cellules épithéliales et stromales, les cellules progénitrices de l’œsophage sont cultivées seules ou avec des fibroblastes dans un dôme matriciel. Pour étudier la contribution des fibroblastes à la formation d’organoïdes, la co-culture est maintenue dans un milieu de croissance réduit (Figure 1G).
Les cellules progénitrices œsophagiennes forment des organoïdes en présence d’EGF, NOGGIN et RSPO (ENR). Élimination de NOGGIN et réduction de la quantité de RSPO (25 ng/μL; ERfaible) est suffisant pour empêcher la formation d’organoïdes (figure 2A). Fait intéressant, l’ajout de fibroblastes DPP4+ ou PDGFRα+ aux cellules progénitrices œsophagiennes dans le milieufaible ER restaure la capacité de formation d’organoïdes, démontrant une fonction de soutien pour les deux populations de fibroblastes (Figure 2A-D). La visualisation du transgène PdgfrαH2BeGFP montre que les fibroblastes sont en contact étroit avec les cellules progénitrices épithéliales lors de la formation organoïde (Figure 2A). Au jour 6, les fibroblastes PdgfrαH2BeGFP+ sont encore abondamment présents dans la co-culture. Les fibroblastes sont présents dans tout le dôme, près et en contact avec les organoïdes (flèche pleine), ou attachés aux organoïdes (pointe de flèche; Figure 2D).
La coloration de l’ensemble du support montre une représentation 3D de l’interaction des fibroblastes avec les organoïdes (Figure 3). Bien qu’il soit possible d’effectuer l’ensemble du protocole de montage sans utiliser de solution de nettoyage, cela diminue la transparence et la pénétration laser de l’organoïde (Figure 3B, z-view). Lors du montage d’organoïdes, l’entretoise aide à maintenir la morphologie organoïde. En revanche, le placage de la lamelle de couverture directement sur les organoïdes (sans entretoise) aplatit les organoïdes et entraîne une perte de structure organoïde (Figure 3A,B).
Les fibroblastes DPP4+ et PDGFRα+ sont enroulés autour des organoïdes (Figure 3C, Vidéo1 et Vidéo 2). La différenciation des organoïdes œsophagiens peut être évaluée à l’aide de différents marqueurs. La figure 4 montre que le protocole de coloration fourni convient aux kératines plus faciles à colorer (KRT14/13) ainsi qu’aux facteurs de transcription plus difficiles à colorer (TRP63/KLF4). Le protocole de co-culture génère des organoïdes avec un schéma de différenciation similaire, comme démontré in vivo13,14 et comme on l’a vu dans les organoïdes cultivés en milieu ENR ; Les cellules progénitrices KRT14+ ou TRP63+ forment la couche externe et les cellules différenciées KRT13+ ou KLF4+ s’orientent vers l’intérieur.
Ce protocole fournit un outil pour étudier la niche des cellules souches œsophagiennes in vitro et visualise l’interaction entre les organoïdes et les fibroblastes. En mettant en œuvre un protocole pour l’isolement des fibroblastes à l’aide d’anticorps, la méthode est adaptable et peut être utilisée pour étudier les sous-populations de fibroblastes sans avoir besoin de souris transgéniques.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig01.jpg"> Figure 1 : Isolement des cellules progénitrices et des sous-populations de fibroblastes de l’œsophage. (A) Vue d’ensemble schématique des différentes couches de l’œsophage. Le stroma contient la lamina propria et la sous-muqueuse. B) Vue d’ensemble schématique du protocole d’isolement. Le muscle (musculeux externe) est enlevé mécaniquement à l’aide d’une pince; L’œsophage restant est ouvert et incubé dans de la thermolysine pour séparer la couche épithéliale du stroma. L’épithélium et le stroma sont séparés, hachés mécaniquement et digérés enzymatiquement en suspensions unicellulaires. Les cellules dissociées sont ensuite colorées et préparées pour la FACS. (C) Coupe transversale de l’œsophage arrachée de la musculeuse externe montrant des fibroblastes PdgfrαH2BeGFP+ dans le stroma. Les cellules doubles positives de l’intégrine-β4 (ITGβ4) et de la e-cadhérine (ECAD) sont les cellules progénitrices épithéliales de l’œsophage. Barre d’échelle = 100 μm. (D) Diagramme représentatif de cytométrie en flux de l’isolement des cellules épithéliales montrant le pourcentage de cellules vivantes (panneau supérieur) de toutes les cellules individuelles. Le panneau inférieur montre le pourcentage de cellules progénitrices ITGβ4+ ECAD+ (Prog.) isolées de toutes les cellules vivantes. (E) Diagramme représentatif de cytométrie en flux de l’isolement des cellules stromales montrant le pourcentage de cellules vivantes (panneau supérieur gauche). Graphiques représentatifs de cytométrie en flux montrant le pourcentage de fibroblastes DPP4+ isolés (Fibr.; panneau supérieur droit) et de fibroblastes Pdgfrα+ (panneau inférieur gauche) de toutes les cellules vivantes. 70% des fibroblastes Pdgfrα+ sont également DPP4+ (panneau inférieur droit). (F) Tracé représentatif de la cytométrie en flux du stroma montrant les cellules DPP4+ seulement (2,5%), les cellules DPP4+ PDGFRα+ (37,5%) et les cellules PDGFRα+ seules (17,7%). Les pourcentages sont de toutes les cellules vivantes. (G) Les cellules épithéliales seules sont plaquées dans un dôme matriciel en présence de 50 ng/μL d’EGF, 100 ng/μL de NOGGIN et 250 ng/μL RSPO (ENR), ou avec des fibroblastes en présence d’EGF et d’une faible concentration de RSPO (25 ng/μL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig02.jpg"> Figure 2 : Résultats représentatifs des co-cultures organoïdes. (A) Images en fond clair montrant la croissance des organoïdes du jour 1 au jour 6. Les images en fond clair avec les organoïdes co-cultivés avec les fibroblastes PdgfrαH2BeGFP+ montrent également le signal eGFP nucléaire. Barre d’échelle = 25 μm. (B) Images en fond clair de l’ensemble du dôme de la matrice au jour 6. La colonne de gauche montre des co-cultures organoïdes cultivées en présence de fibroblastes Pdgfrα+ dans un milieu ER faibleou Efaible Rbas. La colonne du milieu montre les co-cultures organoïdes cultivées en présence de fibroblastes DPP4+ dans un milieu ER faibleou Efaible Rbas. La colonne de droite montre les monocultures organoïdes cultivées en milieu ENR. milieu ENR = EGF (50 ng/μL), NOGGIN (100 ng/μL) et RSPO (250 ng/μL). ERfaible = EGF et 25 ng/μL RSPO. E faibleRfaible = 5 ng/μL EGF et 25 ng/μL RSPO. Barre d’échelle = 500 μm. (C) Graphique montrant l’efficacité de formation des organoïdes (%) (c.-à-d. le pourcentage de cellules formant des organoïdes dans différentes conditions de culture). Chaque point représente un dôme matriciel et la barre représente la moyenne de tous les points par condition. (D) Image en fond clair et fluorescente des organoïdes du jour 6 co-cultivés avec des fibroblastes PdgfrαH2BeGFP+. Les fibroblastes PdgfrαH2BeGFP+ sont présents dans tout le dôme, attachés aux organoïdes (pointe de flèche) et non attachés mais en contact avec les organoïdes (flèche pleine). Barre d’échelle = 250 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig03.jpg"> Figure 3 : Protocole de coloration du montage entier pour l’étude des interactions fibroblastes-organoïdes. (A) Vue d’ensemble schématique de l’ensemble du protocole d’immunofluorescence du monture. AB = anticorps. (B) Image d’immunofluorescence de la coloration de monture entière non effacée montrant une diminution de la transparence et de la pénétration de la lumière laser par rapport aux organoïdes effacés. L’absence d’espaceur entraîne l’aplatissement de l’organoïde et la perte de morphologie organoïde. (C) Des images de montage entier des organoïdes en co-culture montrent les surfaces 3D des organoïdes avec des fibroblastes VIMENTIN+ (Fibr.) enroulés autour et en contact étroit avec l’organoïde. Les coupes transversales 3D et les images planes 2D montrent la lumière de l’organoïde. Barre d’échelle = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig04.jpg"> Figure 4 : Les images de monture entière révèlent des populations distinctes de cellules basales et suprabasales. (A) Coloration en monture entière d’organoïdes mono et co-cultivés avec des fibroblastes PdgfrαH2BeGFP+ montrant des cellules basales KRT14+ dans la couche externe et des cellules suprabasales différenciées KRT13+. Barre d’échelle = 50 μm. (B) Coloration sur montage entier d’organoïdes mono et co-cultivés avec des fibroblastes PdgfrαH2BeGFP+ montrant des cellules basales TRP63+ dans la couche externe et des cellules suprabasales différenciées KLF4+. Barre d’échelle = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Tableau décrivant les composants des milieux de culture organoïdes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Table1_revised_RE.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Vidéo 1: PdgfrαH2BeGFP+ fibroblaste enroulé autour et en contact étroit avec l’organoïde. La vidéo accompagne le panneau supérieur de la figure 3C. La barre d’échelle de la figure 3C est de 50 μm et l’organoïde a un diamètre de ~120 μm. VIMENTIN est représenté en blanc, E-CADHERIN en rouge, PdgfrαH2BeGFP en vert et DAPI en bleu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Video%201_Re.avi" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.</a>
Vidéo 2 : Fibroblaste DPP4+ enroulé autour et en contact étroit avec l’organoïde. La vidéo accompagne le panneau inférieur de la figure 3C. La barre d’échelle de la figure 3C est de 50 μm et l’organoïde a un diamètre de ~120 μm. VIMENTIN est représenté en blanc, E-CADHERIN en rouge et DAPI en bleu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Video%202_RE.avi" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.</a>

Les co-cultures organoïdes-fibroblastes fournissent un modèle pour étudier la niche des cellules souches in vivo . Ici, un protocole pour les co-cultures organoïdes-fibroblastes œsophagiennes est décrit. De plus, l’imagerie de monture entière est utilisée pour visualiser l’interaction fibroblaste-organoïde.

Caractérisation fonctionnelle et visualisation de fibroblastes œsophagiens à l’aide de co-cultures organoïdes

Epithelial stem and progenitor cells contribute to the formation and maintenance of the epithelial barrier throughout life. Most stem and progenitor cell ...

Ainsi, les cellules progénitrices interagissent avec l’environnement pour maintenir l’homéostasie des tissus. Et en utilisant ce protocole, nous pouvons commencer à comprendre comment les fibroblastes affectent le comportement des cellules progénitrices de l’œsophage. Le système de co-culture utilise d’abord des cellules isolées qui imitent la niche normale des progéniteurs de l’œsophage.L’élimination des organoïdes avant l’imagerie permet d’analyser à la fois les interactions cellulaires et la morphologie organoïde. Cette méthode pourrait être appliquée aux organoïdes œsophagiens humains. Par exemple, en utilisant des matériaux provenant de patients en bonne santé ou cancéreux.Ce faisant, nous pouvons obtenir des informations sur la fonction spécifique des fibroblastes associés au cancer. La dissociation des cellules épithéliales et stromales est essentielle pour obtenir des organoïdes viables. La sous-digestion entraînera un faible rendement cellulaire, où la surdigestion réduira la viabilité cellulaire et la capacité de formation d’organoïdes.Pour commencer, retirez mécaniquement la musculeuse externe de l’œsophage à l’aide d’un microscope à dissection et d’une pince. Tenez l’extrémité distale de l’œsophage disséqué à l’aide d’une paire de pinces et utilisez l’autre forceps pour saisir et tirer le muscle de l’extrémité distale à l’extrémité proximale de l’œsophage. Retirez et jetez la couche musculaire.Pour ouvrir l’œsophage longitudinalement, tenez une extrémité de l’œsophage et insérez la boule des ciseaux à ressort de microdissection dans la lumière pour prévenir les dommages tissulaires. Coupez l’œsophage tout en le tenant à l’extrémité et placez-le dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre ou une plaque de 24 puits. Immergez l’œsophage ouvert dans 0,5 milligramme par millilitre de thermolysine dans HBSS et incuber à 37 degrés Celsius sur un agitateur à bascule pendant 15 minutes.Après avoir retiré l’œsophage de la solution de thermolysine, séparez soigneusement l’épithélium œsophagien du stroma. Transférer la couche épithéliale et stromale dans deux tubes microcentrifuges séparés de 1,5 millilitre avec 200 microlitres de solution de dissociation dans HBSS et les placer sur de la glace. Hachez l’épithélium œsophagien à l’aide d’un scalpel pointu et collectez le tissu émincé de la boîte de Petri avec 200 microlitres de solution de dissociation.Transférez-le dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ajouter 800 microlitres de solution de dissociation fraîche et placer le tube avec la couche épithéliale émincée sur un agitateur à bascule à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes. Pipeter la solution de haut en bas environ 20 fois à l’aide d’un embout de pipette de 200 microlitres toutes les 15 minutes.Couper la couche stromale en petits morceaux dans un tube de 1,5 millilitre contenant 200 microlitres de solution de dissociation à l’aide de ciseaux de dissection et ajouter 800 microlitres de solution de dissociation fraîche. Placez le tube sur un agitateur à bascule à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après 30 minutes d’incubation pour la solution stromale et 60 minutes d’incubation pour la solution épithéliale, pipeter la solution de haut en bas pendant encore 20 fois.Faire passer la solution stromale à travers une crépine cellulaire de 70 micromètres, et la solution épithéliale à travers une crépine cellulaire de 40 micromètres dans de nouveaux tubes microcentrifuges de 1,5 millimètre. Centrifuger à 300G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant en retirant l’excès de liquide avec une pipette d’un millilitre. Remettez la pastille en suspension dans 200 microlitres de mélange d’anticorps.Après avoir transféré le mélange dans un tube de cytométrie en flux, incuber les cellules pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Ajouter trois millilitres de FBS à 1% et centrifuger à nouveau pendant cinq minutes. Remettez ensuite les cellules en suspension dans un minimum de 200 microlitres de FBS à 1%.Ajouter un à 10 000 marqueurs de coloration de cellules mortes diluées, cinq minutes avant le tri par télécopieur pour isoler les cellules vivantes. Mélanger les cellules épithéliales triées et les fibroblastes dans un rapport de un à deux dans un tube. Après centrifugation à 300 G pendant cinq minutes, jeter le surnageant en le retirant délicatement avec une pipette de 200 microlitres.Lavez les cellules une fois en remettant la pastille en suspension dans un milieu organoïde basique froid et en centrifugeant à nouveau pendant cinq minutes. Placez les cellules sur de la glace et jetez le surnageant en le retirant soigneusement avec une pipette de 200 microlitres. Remettez les cellules en suspension dans 10 microlitres de mélange matriciel par dôme et remettez le tube sur de la glace.Prenez la plaque préchauffée de 48 puits de l’incubateur de 37 degrés Celsius et faites un dôme matriciel par puits. À l’aide d’une pipette de 20 microlitres, ajoutez 200 microlitres de milieu ER faible préchauffé aux dômes matriciels contenant des co-cultures organoïdes et un milieu ENR aux dômes matriciels respectifs contenant uniquement des organoïdes épithéliaux. Placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Et pendant les deux premiers jours, complétez le milieu avec 10 inhibiteurs de roche micromolaires. Retirez le milieu organoïde et ajoutez 200 microlitres de PBS glacé aux dômes de la matrice. Après avoir placé la plaque sur de la glace pendant cinq à 10 minutes, pipeter de haut en bas et transférer la solution dans un tube non adhérent de 0,6 millilitre.Centrifuger brièvement pendant 30 à 60 secondes à 100G pour laisser les organoïdes se déposer dans le fond. Après avoir retiré l’excès de liquide, ajoutez du PBS glacé dans le tube et centrifugez à nouveau pendant 30 à 60 secondes. Retirez l’excès de liquide comme indiqué précédemment et fixez l’organoïde avec 200 microlitres de formaldéhyde froid à 4% dans une solution de PBS pendant 30 minutes sur de la glace.Placez le tube à la verticale pour laisser couler l’organoïde et retirez le formaldéhyde. Ajouter 500 microlitres de PBS froid pour éliminer le formaldéhyde restant. Après avoir retiré l’excès de PBS, ajoutez 500 microlitres de tampon de blocage.Placez le tube sur un agitateur à bascule pendant 60 minutes à température ambiante. Retirez le tampon de blocage et remettez les organoïdes en suspension dans 200 microlitres de tampon de blocage avec des anticorps primaires. Placez à nouveau les organoïdes sur un agitateur à bascule pendant la nuit à quatre degrés Celsius.Retirez le mélange d’anticorps primaires et lavez les organoïdes en utilisant 500 microlitres de 0,02% Triton X 100 dans du PBS pendant 60 minutes à température ambiante. Répétez cette opération trois fois. De même, retirez le tampon de lavage et ajoutez 200 microlitres d’anticorps secondaire conjugué à la fluorescence dans le tampon de blocage pendant la nuit à quatre degrés Celsius.Relavez les organoïdes en utilisant 0,02% Triton X 100 dans PBS suivi de 500 microlitres de PBS. Après avoir éliminé tout l’excès de liquide, ajoutez 10 microlitres de solution de nettoyage aux organoïdes et incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Placez une entretoise collante à quatre puits double face de 0,05 millimètre sur une lame de microscope.Ajouter les 10 microlitres de solution de nettoyage avec les organoïdes dans un puits et placer un couvercle sur le dessus de l’entretoise. Acquérir des images à l’aide d’un système de microscopie confocale. Les cellules progénitrices œsophagiennes sont triées en fonction de leur expression bêta quatre et e-cadhérine hautement intégrées.Le graphique de cytométrie en flux représentatif de l’isolement des cellules épithéliales montre le pourcentage de cellules vivantes de toutes les cellules individuelles. Le pourcentage de cellules isolées d’intégrine bêta quatre et de progéniteurs de l’e-cadhérine de toutes les cellules vivantes est indiqué ici. Les diagrammes de cytométrie en flux présentés ici représentent le pourcentage de fibroblastes alpha positifs isolés pour les récepteurs DPP4+ et Pdgf.Les images en champ clair avec les organoïdes co-cultivés avec le récepteur Pdgf alpha H2 BEGFP positif montrent le signal EGFP nucléaire. Les images en champ lumineux de l’ensemble du dôme matriciel du sixième jour sont montrées ici. L’efficacité de formation des organoïdes est présentée par cette image graphique.Chaque point représente un dôme matriciel et la barre représente la moyenne de tous les points par condition. Les images en champ clair et fluorescentes de la co-culture d’organoïdes du sixième jour avec les fibroblastes positifs du récepteur alpha Pdgf sont montrées ici. Les images de montage entier des organoïdes en co-culture montrent les surfaces 3D des organoïdes avec des fibroblastes positifs à la vimentine enroulés autour et en contact étroit avec l’organoïde.La coloration complète des organoïdes mono et co-cultivés avec des fibroblastes alpha positifs du récepteur Pdgf révèle des populations de cellules basales et suprabasales distinctes. L’efficacité de formation des organoïdes ainsi que la taille des organoïdes sont influencées par le fibroblaste inclus dans la co-culture. Des variations et des résultats sont à prévoir lors de l’utilisation de différentes sous-populations de fibroblastes.La même stratégie peut être utilisée pour caractériser les fibroblastes associés aux tumeurs chez la souris et l’homme.

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