Caractérisation fonctionnelle et visualisation de fibroblastes œsophagiens à l’aide de co-cultures organoïdes

Ainsi, les cellules progénitrices interagissent avec l’environnement pour maintenir l’homéostasie des tissus. Et en utilisant ce protocole, nous pouvons commencer à comprendre comment les fibroblastes affectent le comportement des cellules progénitrices de l’œsophage. Le système de co-culture utilise d’abord des cellules isolées qui imitent la niche normale des progéniteurs de l’œsophage.

L’élimination des organoïdes avant l’imagerie permet d’analyser à la fois les interactions cellulaires et la morphologie organoïde. Cette méthode pourrait être appliquée aux organoïdes œsophagiens humains. Par exemple, en utilisant des matériaux provenant de patients en bonne santé ou cancéreux.

Ce faisant, nous pouvons obtenir des informations sur la fonction spécifique des fibroblastes associés au cancer. La dissociation des cellules épithéliales et stromales est essentielle pour obtenir des organoïdes viables. La sous-digestion entraînera un faible rendement cellulaire, où la surdigestion réduira la viabilité cellulaire et la capacité de formation d’organoïdes.

Pour commencer, retirez mécaniquement la musculeuse externe de l’œsophage à l’aide d’un microscope à dissection et d’une pince. Tenez l’extrémité distale de l’œsophage disséqué à l’aide d’une paire de pinces et utilisez l’autre forceps pour saisir et tirer le muscle de l’extrémité distale à l’extrémité proximale de l’œsophage. Retirez et jetez la couche musculaire.

Pour ouvrir l’œsophage longitudinalement, tenez une extrémité de l’œsophage et insérez la boule des ciseaux à ressort de microdissection dans la lumière pour prévenir les dommages tissulaires. Coupez l’œsophage tout en le tenant à l’extrémité et placez-le dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre ou une plaque de 24 puits. Immergez l’œsophage ouvert dans 0,5 milligramme par millilitre de thermolysine dans HBSS et incuber à 37 degrés Celsius sur un agitateur à bascule pendant 15 minutes.

Après avoir retiré l’œsophage de la solution de thermolysine, séparez soigneusement l’épithélium œsophagien du stroma. Transférer la couche épithéliale et stromale dans deux tubes microcentrifuges séparés de 1,5 millilitre avec 200 microlitres de solution de dissociation dans HBSS et les placer sur de la glace. Hachez l’épithélium œsophagien à l’aide d’un scalpel pointu et collectez le tissu émincé de la boîte de Petri avec 200 microlitres de solution de dissociation.

Transférez-le dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ajouter 800 microlitres de solution de dissociation fraîche et placer le tube avec la couche épithéliale émincée sur un agitateur à bascule à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes. Pipeter la solution de haut en bas environ 20 fois à l’aide d’un embout de pipette de 200 microlitres toutes les 15 minutes.

Couper la couche stromale en petits morceaux dans un tube de 1,5 millilitre contenant 200 microlitres de solution de dissociation à l’aide de ciseaux de dissection et ajouter 800 microlitres de solution de dissociation fraîche. Placez le tube sur un agitateur à bascule à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après 30 minutes d’incubation pour la solution stromale et 60 minutes d’incubation pour la solution épithéliale, pipeter la solution de haut en bas pendant encore 20 fois.

Faire passer la solution stromale à travers une crépine cellulaire de 70 micromètres, et la solution épithéliale à travers une crépine cellulaire de 40 micromètres dans de nouveaux tubes microcentrifuges de 1,5 millimètre. Centrifuger à 300G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant en retirant l’excès de liquide avec une pipette d’un millilitre. Remettez la pastille en suspension dans 200 microlitres de mélange d’anticorps.

Après avoir transféré le mélange dans un tube de cytométrie en flux, incuber les cellules pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Ajouter trois millilitres de FBS à 1% et centrifuger à nouveau pendant cinq minutes. Remettez ensuite les cellules en suspension dans un minimum de 200 microlitres de FBS à 1%.

Ajouter un à 10 000 marqueurs de coloration de cellules mortes diluées, cinq minutes avant le tri par télécopieur pour isoler les cellules vivantes. Mélanger les cellules épithéliales triées et les fibroblastes dans un rapport de un à deux dans un tube. Après centrifugation à 300 G pendant cinq minutes, jeter le surnageant en le retirant délicatement avec une pipette de 200 microlitres.

Lavez les cellules une fois en remettant la pastille en suspension dans un milieu organoïde basique froid et en centrifugeant à nouveau pendant cinq minutes. Placez les cellules sur de la glace et jetez le surnageant en le retirant soigneusement avec une pipette de 200 microlitres. Remettez les cellules en suspension dans 10 microlitres de mélange matriciel par dôme et remettez le tube sur de la glace.

Prenez la plaque préchauffée de 48 puits de l’incubateur de 37 degrés Celsius et faites un dôme matriciel par puits. À l’aide d’une pipette de 20 microlitres, ajoutez 200 microlitres de milieu ER faible préchauffé aux dômes matriciels contenant des co-cultures organoïdes et un milieu ENR aux dômes matriciels respectifs contenant uniquement des organoïdes épithéliaux. Placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.

Et pendant les deux premiers jours, complétez le milieu avec 10 inhibiteurs de roche micromolaires. Retirez le milieu organoïde et ajoutez 200 microlitres de PBS glacé aux dômes de la matrice. Après avoir placé la plaque sur de la glace pendant cinq à 10 minutes, pipeter de haut en bas et transférer la solution dans un tube non adhérent de 0,6 millilitre.

Centrifuger brièvement pendant 30 à 60 secondes à 100G pour laisser les organoïdes se déposer dans le fond. Après avoir retiré l’excès de liquide, ajoutez du PBS glacé dans le tube et centrifugez à nouveau pendant 30 à 60 secondes. Retirez l’excès de liquide comme indiqué précédemment et fixez l’organoïde avec 200 microlitres de formaldéhyde froid à 4% dans une solution de PBS pendant 30 minutes sur de la glace.

Placez le tube à la verticale pour laisser couler l’organoïde et retirez le formaldéhyde. Ajouter 500 microlitres de PBS froid pour éliminer le formaldéhyde restant. Après avoir retiré l’excès de PBS, ajoutez 500 microlitres de tampon de blocage.

Placez le tube sur un agitateur à bascule pendant 60 minutes à température ambiante. Retirez le tampon de blocage et remettez les organoïdes en suspension dans 200 microlitres de tampon de blocage avec des anticorps primaires. Placez à nouveau les organoïdes sur un agitateur à bascule pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Retirez le mélange d’anticorps primaires et lavez les organoïdes en utilisant 500 microlitres de 0,02% Triton X 100 dans du PBS pendant 60 minutes à température ambiante. Répétez cette opération trois fois. De même, retirez le tampon de lavage et ajoutez 200 microlitres d’anticorps secondaire conjugué à la fluorescence dans le tampon de blocage pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Relavez les organoïdes en utilisant 0,02% Triton X 100 dans PBS suivi de 500 microlitres de PBS. Après avoir éliminé tout l’excès de liquide, ajoutez 10 microlitres de solution de nettoyage aux organoïdes et incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Placez une entretoise collante à quatre puits double face de 0,05 millimètre sur une lame de microscope.

Ajouter les 10 microlitres de solution de nettoyage avec les organoïdes dans un puits et placer un couvercle sur le dessus de l’entretoise. Acquérir des images à l’aide d’un système de microscopie confocale. Les cellules progénitrices œsophagiennes sont triées en fonction de leur expression bêta quatre et e-cadhérine hautement intégrées.

Le graphique de cytométrie en flux représentatif de l’isolement des cellules épithéliales montre le pourcentage de cellules vivantes de toutes les cellules individuelles. Le pourcentage de cellules isolées d’intégrine bêta quatre et de progéniteurs de l’e-cadhérine de toutes les cellules vivantes est indiqué ici. Les diagrammes de cytométrie en flux présentés ici représentent le pourcentage de fibroblastes alpha positifs isolés pour les récepteurs DPP4+ et Pdgf.

Les images en champ clair avec les organoïdes co-cultivés avec le récepteur Pdgf alpha H2 BEGFP positif montrent le signal EGFP nucléaire. Les images en champ lumineux de l’ensemble du dôme matriciel du sixième jour sont montrées ici. L’efficacité de formation des organoïdes est présentée par cette image graphique.

Chaque point représente un dôme matriciel et la barre représente la moyenne de tous les points par condition. Les images en champ clair et fluorescentes de la co-culture d’organoïdes du sixième jour avec les fibroblastes positifs du récepteur alpha Pdgf sont montrées ici. Les images de montage entier des organoïdes en co-culture montrent les surfaces 3D des organoïdes avec des fibroblastes positifs à la vimentine enroulés autour et en contact étroit avec l’organoïde.

La coloration complète des organoïdes mono et co-cultivés avec des fibroblastes alpha positifs du récepteur Pdgf révèle des populations de cellules basales et suprabasales distinctes. L’efficacité de formation des organoïdes ainsi que la taille des organoïdes sont influencées par le fibroblaste inclus dans la co-culture. Des variations et des résultats sont à prévoir lors de l’utilisation de différentes sous-populations de fibroblastes.

La même stratégie peut être utilisée pour caractériser les fibroblastes associés aux tumeurs chez la souris et l’homme.