Diélectrophorèse induite par la lumière pour caractériser le comportement électrique des cellules souches mésenchymateuses humaines

Ce protocole de diélectrophorèse induite par la lumière ou LiDEP fournit une méthode étape par étape pour la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses humaines. Cette méthode peut aider à fournir des réponses sur l’hétérogénéité des échantillons de cellules souches. L’avantage du LiDEP est la possibilité d’apporter des modifications en temps réel à la configuration de l’électrode virtuelle en réponse à l’hétérogénéité des cellules souches, ce qui n’est pas possible pour les méthodes DEP traditionnelles.

Un nouvel utilisateur de cette technique peut avoir du mal à condenser suffisamment la lumière du projecteur sur le micro-dispositif fluidique pour fabriquer l’électrode virtuelle. Nous vous conseillons de reconfigurer la configuration jusqu’à ce qu’elle fonctionne. Zuri Rashad, une étudiante diplômée de mon laboratoire, aidera à démontrer la procédure.

Pour commencer, préparez le microcanal en perforant des trous de quatre millimètres de diamètre sur un ruban double face à environ cinq à six millimètres du bord de la dimension la plus courte et centré entre les côtés les plus longs de la bande. À l’aide d’un scalpel, coupez deux lignes droites espacées de trois millimètres à travers les trous en vous assurant que les feuilles de protection sur les deux faces du ruban sont allumées pendant toute la coupe du microcanal. Marquez l’ensemble de l’emplacement avec un marqueur lavable garantissant que les trous percés s’alignent avec les trous perforés dans le ruban adhésif double face.

Ces deux trous seront utilisés comme trous d’entrée et de sortie du dispositif microfluidique. Percez deux trous de trois millimètres de diamètre dans la glissière de verre ITO supérieure. Ensuite, sur le dessus du verre revêtu ITO percé, placez le long bord du ruban aligné sur le long bord du verre.

Retirez un côté du film protecteur sur le ruban adhésif double face. Alignez les trous de la bande dans la lame de verre ITO supérieure et pressez-les doucement ensemble en enlevant les poches d’air, en particulier près du microcanal. Retirez l’autre film protecteur du ruban adhésif double face.

Appuyez sur la lame de verre ITO revêtue de molybdène et de silicium amorphe correspondant au bord de la lame photoconductrice opposée au côté de dégagement de deux millimètres avec le bord du ruban adhésif double face vers le centre de la lame de verre ITO supérieure. De cette façon, une gueule de bois existe entre l’ITO et la diapositive ITO photoconductrice. Appuyez sur une surface plane pour assurer une bonne adhérence et coupez l’excès de ruban sur les côtés.

Pour connecter le générateur de fonctions, appliquez du ruban de cuivre sur les bords de la couche de verre ITO et de la couche de verre ITO revêtue de photoconductrice. Enroulez le ruban sur le côté de l’ITO ou du matériau photoconducteur du bord du ruban double face jusqu’à environ trois centimètres sur le côté non revêtu du substrat de verre. Pour assurer la réussite de la fabrication de l’appareil, utilisez un altimètre pour tester la lecture de la résistance entre les lames revêtues des deux substrats de verre et le ruban de cuivre qui a été fixé au verre.

Ajouter 25 millilitres d’eau ultrapure dans un tube conique de 50 millilitres contenant 4,25 grammes de saccharose et 0,15 gramme de glucose. Bien mélanger jusqu’à ce que la moitié du saccharose et du glucose se dissolve et compléter avec de l’eau ultrapure jusqu’à la marque de 50 millilitres. Ensuite, mélanger vigoureusement ce tampon DEP jusqu’à dissolution complète.

Placez 20 millilitres de la solution préparée de saccharose et de glucose dans un tube conique de 50 millilitres. Ajouter 0,1 gramme d’albumine sérique bovine, BSA, dans le tube. Vortex bien jusqu’à ce que toute la BSA se dissolve pour obtenir une concentration finale de 0,5% BSA dans le tampon DEP.

Placer une fois 10 aux six cellules souches mésenchymateuses humaines ou HMSC ou rein embryonnaire humain, HEK293 en suspension dans un millilitre de milieu de croissance dans un tube à centrifuger de 10 millilitres. Centrifugeuse, les cellules HEK293 à 201 G pendant cinq minutes et les HMSC à 290 G pendant 10 minutes. Après centrifugation, aspirer le surnageant.

01 Et remettre doucement les cellules en suspension dans une solution tampon DEP d’un millilitre avec 0,5% de BSA. Répétez la centrifugation deux fois de plus et remettez en suspension les cellules dans le tampon DEP avec 0,5% BSA. Préparez les éléments de configuration expérimentale tels qu’un ordinateur portable, un projecteur, une lentille d’objectif, un microscope numérique et un générateur de fonctions pour quantifier les réponses cellulaires au LiDEP.

Placez l’objectif 10x, la puce LiDEP et le support sur l’objectif du projecteur. Utilisez l’ordinateur portable pour concevoir des projections lumineuses telles que l’étoile, le losange, les trois lignes et l’ovale et connectez l’ordinateur portable au projecteur. Connectez la puce LiDEP au générateur de fonctions pour appliquer le champ électrique AC.

Pour observer les cellules subissant la force LiDEP, utilisez un microscope numérique pour l’imagerie de l’enregistrement NVIDIA. Une fois la configuration terminée, rincer le microcanal avec de l’éthanol à 70%, puis rincer une solution BSA à 0,5% pour éliminer l’éthanol dans les cellules précédentes. Répétez le rinçage trois fois pour vous assurer d’un lavage complet, car les cellules précédemment exposées au champ DEP réagiront différemment des cellules fraîches et pourraient perturber la collecte de données.

Retirer la solution BSA à 0,5 % à l’aide d’une pipette. Ensuite, réglez le générateur de fonctions sur la tension et la fréquence souhaitées. Ajoutez soigneusement 70 microlitres de la suspension cellulaire préparée dans le microcanal de l’appareil à l’aide d’une pointe de pipette plus petite, en l’inclinant légèrement dans le trou vers le microcanal pour éviter les déversements dus à la minceur du microcanal.

Essuyez la solution d’accès avec des lingettes en papier à usage unique et jetez-les dans les déchets biologiques. Ensuite, projetez les cercles électrogéométriques virtuels, les diamants, les étoiles ou les lignes parallèles souhaités sur la puce LiDEP. Dans le logiciel de microscope numérique, réglez la durée de la vidéo sur trois minutes.

Réglez une minuterie de laboratoire sur deux minutes et 30 secondes. Une fois que les cellules sont stationnaires dans le microcanal de la puce LiDEP, appuyez sur Start dans le logiciel de microscope numérique pour commencer le processus d’enregistrement vidéo. Après 10 secondes, appuyez sur le bouton On de la sortie du canal du générateur de fonction pour appliquer le champ électrique AC et appuyez sur Start pour la minuterie.

Surveillez le comportement DEP de la cellule à l’aide du microscope numérique et empêchez les secousses ou les mouvements autour de la configuration. Une fois la minuterie désactivée, appuyez sur le bouton On de la sortie du canal du générateur de fonction qui éteint la sortie du canal et le champ électrique CA n’est plus fourni par les électrodes. Arrêtez l’enregistrement vidéo après trois minutes et enregistrez-le pour une analyse ultérieure.

Pipeter les cellules hors de l’extrémité de sortie de la puce LiDEP en poussant lentement 60 microlitres de tampon DEP avec 0,5% BSA dans le microcanal et en collectant simultanément la sortie. Continuez jusqu’à ce qu’il y ait peu ou pas de cellules dans le microcanal et répétez la DEP avec toutes les fréquences démontrées. Les réponses du PED en termes de vitesse pour les HMSC et leur pourcentage de viabilité ont été déterminées.

Les mesures des réponses DEP positives à cinq, 10, et 20 tension crête à crête ou VPP ont montré que les cellules se déplaçaient à une vitesse moyenne de 0,025, 0,036 et 0,051 micromètre par seconde respectivement. Les résultats de viabilité des CSSM après avoir subi la force DEP ont montré que les tensions plus élevées entraînaient généralement une viabilité cellulaire plus faible, 57 % des cellules étant viables à 20 VPP. Des électrodes de couleur blanche, jaune, rouge et bleue ont été choisies pour cette étude, mais l’éclairage à travers la puce de profondeur LiDEP a été affecté par la couche photoconductrice, qui avait une couleur rouge orange.

Par conséquent, l’électrode blanche projetée apparaissait jaune avec un intérieur blanc, l’électrode rouge apparaissait orange avec un contour rouge et l’électrode bleue apparaissait vert clair. Ce phénomène suggère que le jaune et le blanc avaient le champ DEP le plus fort tandis que le bleu et le rouge étaient plus faibles. Les réponses DEP des HMC ont été mesurées avec LiDEP dans un analyseur à trois profondeurs à 10 VPP.

Avec le LiDEP, il y a eu une diminution de la réponse positive du DEP de 30 kilohertz à 20 mégahertz. À partir des trois analyseurs, les cellules ont augmenté dans la DEP positive de 37 à 255 kilohertz et ont diminué dans la DEP positive de 1 772 kilohertz à 20 mégahertz. Deux composants importants de cette méthode sont une source lumineuse puissante et une connexion électrique solide pour assurer la production du champ électrique et la manipulation de la cellule.

Nous avons observé la rotation des cellules en réponse à des électrodes virtuelles. Ainsi, l’électro-rotation est une autre méthode d’analyse cellulaire qui peut être effectuée. L’électrorotation fournirait de l’information sur l’hétérogénéité des CSSM et les sous-populations rares.