Culture d’organoïdes 3D intestinaux de porcelet à partir de cryptes épithéliales cryoconservées et établissement de monocouches cellulaires

Notre protocole fournit des outils pour étudier l’épithélium intestinal du porc pour la recherche vétérinaire et biomédicale. Les organoïdes intestinaux des porcs peuvent être utilisés pour étudier le transport des nutriments, la fonction de barrière et les interactions hôte-microbe. Grâce à la préservation de l’intestin du porc, les cryptes épithéliales permettent de créer un stock important de cellules souches qui peuvent ensuite être utilisées pour la culture d’organoïdes en monocouches 3D ou 2D.

Ce protocole est détaillé pour le jéjunum, mais il peut également être utilisé pour d’autres segments intestinaux tels que le duodénum, l’iléon et le côlon. Pour commencer, décongelez rapidement une fiole contenant 900 cryptes gelées dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Transférer la solution cryptique dans un tube conique de 15 millilitres.

Centrifuger à 300 x g pendant cinq minutes à température ambiante et retirer le surnageant. Ajouter 150 microlitres de la matrice extracellulaire ou ECM avec une pointe refroidie pour obtenir une concentration finale de 150 cryptes pour 25 microlitres d’ECM. Pipet de haut en bas 10 fois pour obtenir une suspension homogène des cryptes dans l’ECM.

Ensemencez six puits avec une goutte de 25 microlitres par puits dans une plaque préchauffée de 48 puits. Incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pour la polymérisation de l’ECM. Ajouter 250 microlitres par puits de culture de milieu à température ambiante et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.

Changez le milieu de culture tous les deux ou trois jours. Pour faire passer les organoïdes 3D dérivés de cryptes gelées 10 jours après l’ensemencement, retirez le milieu de culture et ajoutez 250 microlitres de PBS préchauffé à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, remplacer le PBS par 250 microlitres de réactif de dissociation enzymatique préchauffé complété par 10 inhibiteurs de roche micromolaires à 37 degrés Celsius dans chaque puits.

Détacher les organoïdes dans l’ECM en grattant avec une pipette P-1000 et homogénéiser soigneusement en pipetant cinq fois. Incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone avant de dissocier les cellules en pipetant de haut en bas 10 fois. Ajouter 500 microlitres de DMEMc dans chaque puits contenant des cellules dissociées et tirer jusqu’à 12 puits dans un tube conique de 15 millilitres contenant trois millilitres de DMEMc froid.

Centrifuger à 500 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans un millilitre de DMEMc froid. Compter les cellules avec une dilution de un à deux dans le bleu de trypan avec un compteur de cellules.

Centrifuger le volume nécessaire de la solution cellulaire pour avoir 3000 cellules vivantes par dôme. Remettez en suspension la pastille avec 17 microlitres de DMEMc froid par 3000 cellules vivantes sur glace. Ajustez le volume au nombre de puits requis.

Ajouter lentement 33 microlitres d’ECM froid pour 3000 cellules vivantes. Ajustez le volume au nombre requis de puits et homogénéisez sans faire de bulles. Ensuite, voir les puits avec 50 microlitres de suspension cellulaire ECM par puits dans une plaque préchauffée de 24 puits et incuber pendant 30 minutes pour la polymérisation de l’ECM.

Ajouter 500 microlitres du milieu de culture par puits. Ensuite, incuber et changer le milieu de culture tous les deux à trois jours. Pour enduire l’insert de culture, préparer la solution d’enrobage contenant du collagène IV dilué à 50 microgrammes par millilitre dans du PBS froid.

Ajouter 150 microlitres de la solution d’enrobage diluée à chaque insert de culture cellulaire et incuber pendant une nuit ou pendant trois heures. Cinq jours après la fendille, détacher les organoïdes avec l’ECM en les grattant avec une pipette P-1000. Homogénéiser soigneusement par pipetage dans le milieu de culture et transférer dans un tube conique de 15 millilitres contenant cinq millilitres de DMEMc froid sur glace.

Centrifuger les organoïdes collectés à 500 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Aspirer soigneusement le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de réactif de dissociation enzymatique préchauffé complété par 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK. Pipeter de haut en bas 10 fois pour initier la dissociation des organoïdes.

Incuber pendant cinq minutes dans un bain-marie de 37 degrés Celsius pour la digestion enzymatique. Perturber mécaniquement les organoïdes en pipetant 10 fois et ajouter quatre millilitres de DMEMc glacé. Centrifuger et jeter le surnageant avant de remettre en suspension la pastille de cellule organoïde dans un millilitre de DMEMc.

Compter les cellules dans le bleu de trypan avec un compteur de cellules et calculer le volume nécessaire pour ensemencer 2,5 fois 10 à la cinquième cellule par insert de culture. Centrifuger le volume nécessaire de la suspension cellulaire correspondant à 2,5 fois 10 des cinquièmes cellules par insert de culture. Pendant la centrifugation, aspirez soigneusement la solution de revêtement des inserts de culture et laissez-la sécher sous le capot sans couvercle pendant cinq minutes.

Après centrifugation, jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans le volume nécessaire de milieu 2D complété par 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK. Ensemencez 200 microlitres de la suspension cellulaire sur la membrane perméable revêtue. Ajouter 500 microlitres du milieu 2D complété par 10 micromolaires inhibiteurs de ROCK dans le compartiment inférieur et incuber.

Une forte densité de cellules doit être observée sur la membrane. Un jour après l’ensemencement, remplacez les milieux épiques et basaux par des milieux 2D frais sans inhibiteur de ROCK. Changez de média chaque jour.

La monocouche devient confluente un jour après l’ensemencement et peut être utilisée pour ses expériences. Dans cette étude, des cryptes épithéliales ont été obtenues à partir de l’intestin du porc et cryoconservées pour un stockage à long terme dans de l’azote liquide. Après décongélation, les cellules souches cryptiques ont été ensemencées dans l’ECM.

Les organoïdes ont été observés en trois à quatre jours et ont rapidement grandi et développé des structures bourgeonnantes. Environ 10 jours après la décongélation, le passage des organoïdes a été effectué pour étendre la culture. Pour un maintien optimal de la culture, les organoïdes utilisés pour l’emballage doivent présenter une lumière claire et vide et des bords bien définis sans débris noirs dans la lumière comme observé chez les organoïdes matures.

Les cellules se fixent et forment une monocouche entièrement confluente en une journée, ce qui est confirmé par la résistance électrique transépithéliale élevée, ou TEER, d’environ 700 centimètres carrés de dômes. Le TEER reste élevé pendant trois jours. La coloration à l’actine indique que la face apicale des cellules épithéliales est orientée vers la lumière dans les organoïdes 3D.

Les cellules organoïdes ensemencées dans des inserts de culture forment une couche unique confluente de cellules épithéliales avec la face apicale orientée vers le compartiment supérieur. La coloration à l’occludine révèle la présence de jonctions serrées du côté apical des cellules épithéliales dans les organoïdes 3D et dans les monocouches cellulaires. Il est important de se rappeler que les organoïdes utilisés pour ensemencer les monocouches cellulaires doivent apparaître clairs avec une lumière vide sans débris noirs correspondant à une accumulation de cellules mortes.

Les monocouches d’organoïdes intestinaux de porc peuvent être utilisées pour tester les effets des métabolites ou des microbes sur la fonction de barrière épithéliale en utilisant des tests fonctionnels, l’imagerie et l’analyse de l’expression génique.