Évaluation simultanée de la parenté, du numéro de division et du phénotype par cytométrie en flux pour les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices

Peu de méthodes permettent d’évaluer rapidement la fonctionnalité des progéniteurs hématopoïétiques. Ce protocole mesure l’impact des premières divisions cellulaires sur le devenir et l’engagement cellulaire. Ce protocole permet de mesurer simultanément la division et la différenciation au niveau d’une cellule unique et avec un débit élevé sans nécessiter de manipulation complexe et étendue.

Cette méthode convient à toute population hématopoïétique pouvant être maintenue en culture. Il peut donc être facilement appliqué à la biologie du cancer, à l’immunologie et à la biologie du développement. Pour commencer, aliquote 250 microlitres de la fraction CD34+ également dans quatre tubes en polypropylène de 15 millilitres.

Étiquetez les tubes comme décrit dans le manuscrit textuel. Aliquote 250 microlitres de la fraction CD34 dans quatre autres tubes en polypropylène de 15 millilitres et étiqueter les tubes. Préparer des solutions CFSE high et CSFE low telles que décrites dans le manuscrit textuel.

Ajouter 250 microlitres de la solution haute CFSE dans le tube CF et CV, 250 microlitres de la solution basse CFSE dans le tube VC et 250 microlitres dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco, ou DMEM, sans sérum bovin fœtal, ou FBS, dans le tube VI. Pour assurer un mélange efficace de suspension cellulaire dans le colorant cellulaire, inclinez le tube de 90 degrés et déposez les solutions CFSE sur la paroi du tube. Ensuite, tenez le tube verticalement et mélangez trois ou quatre fois pour assurer un mélange rapide des solutions CFSE avec les cellules en repos.

Incuber la suspension à 37 degrés Celsius pendant huit minutes. Après l’incubation, ajoutez cinq millilitres de DMEM contenant 10% FBS et placez les tubes à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Faire tourner les tubes à 300 G pendant cinq minutes.

Retirer le surnageant par aspiration sans déranger le granulé et laver le granulé avec cinq millilitres de PBS, ETDA. Faites tourner à nouveau les tubes et jetez le surnageant avant de remettre la pastille en suspension dans 40 microlitres de PBS, ETDA. Pour colorer les cellules CD34+, préparez un mélange principal d’anticorps dans un seul tube de 0,5 millilitre.

Ajouter sept microlitres du mélange principal d’anticorps à chacune des quatre conditions CD34+. Remettez les cellules en suspension dans un tampon de coloration en utilisant environ 500 microlitres chacune pour les billes dans les cellules CD34+ et un millilitre pour les tubes CD34. Pour le tri des cellules, définissez la stratégie de contrôle en créant des diagrammes de tracé de points.

Tout d’abord, visualisez les cellules sur un diagramme à points FSCA versus SSCA et double-cliquez sur l’outil de contrôle Polygone pour sélectionner la population avec une faible dispersion latérale. Étiquetez cette porte nouvellement créée en tant que cellules. Dans le diagramme à points suivant, FSCA versus FSCH, cliquez avec le bouton droit de la souris sur le graphique et sélectionnez les cellules de porte dans le menu déroulant en cliquant dessus.

Utilisez le même outil de contrôle pour sélectionner une population serrée sur la diagonale entre les deux axes. Étiquetez cette porte comme Cellules uniques. Dans le troisième diagramme à points, APC versus FSH-H, afficher les cellules individuelles de la population et les cellules de porte négatives pour l’expression de la lignée APC.

Étiquetez cette population nouvellement créée comme Lignée négative. Dans le quatrième graphique, CFSE versus CTV, affichez la population Lignée négative et créez quatre portes distinctes, une pour chaque combinaison de colorants. La porte VI est présentée ici à titre d’exemple.

Utilisez les cinquième et sixième diagrammes pour identifier les ancêtres d’intérêt. Porte généreusement la population CD34+CD38 et la CD34+CD38+dans la cinquième placette. Ensuite, sélectionnez la population CD34+CD38 dans le sixième graphique et tracez trois portes pour LMPP, HSC et MPP.

Exécutez les fractions CD34+, en enregistrant au moins 5 000 événements dans la porte à cellule unique. Ajustez la porte pour chaque combinaison de colorants, en définissant une porte serrée pour sélectionner une population homogène. Préparez le modèle de tri des plaques à l’aide de la mise en page Tri d’expérience.

Les puits nommés CD34-contiennent 5 000 à 10 000 cellules triées sur la porte CF, CV, VC, VI. Les puits en vrac contiennent 500 cellules triées sur la grille CD34+CD38-Les puits unicellulaires ne contiennent qu’un seul événement par combinaison de colorants par division cellulaire par puits, donc quatre événements par puits au total. Ensuite, commencez par trier le CD34-CF en mode Pureté de rendement.

Cliquez sur le bouton Acquérir, puis sur le bouton Trier. Cliquez sur Acquérir, puis sur le bouton Trier, en vous assurant d’avoir coché 0160 comme grade de pureté. Enfin, triez les cellules d’intérêt, une cellule par puits, en pureté unicellulaire, en vous assurant d’avoir coché l’option de tri par indice.

Centrifuger la plaque à 300 G pendant cinq minutes et retirer le surnageant en retournant rapidement la plaque sous le capot sur une serviette en papier. Ajouter huit microlitres de tampon permanent aux puits A1 à A4, puis ajouter huit microlitres du mélange aux autres puits. Lavez les cellules en ajoutant 100 microlitres de tampon de coloration par puits à l’aide d’une pipette multicanaux.

Centrifuger et retirer le surnageant avant de remettre les cellules en suspension dans 85 microlitres de tampon de coloration. Lancez l’analyse sur le cytomètre en flux en mode Acquisition à l’aide du modèle dédié et en cliquant sur Personnalisé. Après avoir sélectionné les fluorophores d’intérêt dans la liste, définissez la configuration de la plaque en suivant le gabarit de plaque corrigé du nombre de puits contenant au moins une cellule.

Cochez l’option Agitation et sélectionnez 100 microlitres comme limite de volume d’acquisition. Ensuite, définissez le taux d’acquisition non supérieur à un microlitre par seconde, car une vitesse plus faible améliore le volume total analysé par puits. Pour des points de contrôle représentatifs, concaténez les différents puits en vrac dans un seul fichier.

Après avoir cliqué sur l’option Concaténer les populations, sélectionnez Tous les paramètres non compensés dans le menu Paramètres, puis cliquez sur Concaténer. Téléchargez le fichier concaténé dans l’espace de travail, puis appliquez la matrice de compensation par glisser-déposer. Les étiquettes de cellules avec CV et VC ont besoin d’une valeur transformée.

Cliquez sur Outils et dériver le paramètre pour obtenir la valeur transformée. Collez la formule indiquée dans la zone de formule. Appliquez le point de contrôle à chaque couleur individuellement sous forme de tracé d’histogramme.

Pour CF et VI, réglez CFSE-A et CTV-A sur l’axe des X, respectivement. Pour CV et VC, définissez le paramètre nouvellement dérivé sur l’axe X, puis définissez les portes correspondant à chaque pic. Appliquez bien le point de contrôle à chaque cellule.

Assurez-vous d’ajouter le paramètre dérivé à chaque puits analysé. Vérifiez manuellement chaque porte de couleur pour chaque puits afin de détecter les événements qui sont incorrectement affectés à un pic donné. L’analyse par cytométrie en flux après culture cellulaire nécessite un contrôle précis pour établir la parenté de chaque cellule individuelle ainsi que le phénotypage cellulaire.

La définition et l’affectation des pics sont des aspects cruciaux de l’analyse de cytométrie en flux. Les histogrammes montrent deux exemples de familles réparties sur plusieurs pics, l’un de deux pics d’intensité similaires et l’autre avec deux pics d’intensité différents. Différents types de représentation des données et de tests statistiques sont présentés ici pour deux expériences distinctes effectuées après 72 heures pour les CSH et les MPP.

La carte thermique pour la différenciation HSC représente différentes familles cellulaires, à la fois dans les destins cellulaires et les divisions cellulaires. L’histogramme comparant le devenir des familles cellulaires dérivées des CSH et des MPP est montré ici. Pour les deux types de cellules, la comparaison entre la condition GT et la différenciation de condition est affichée avec les tests statistiques effectués pour les MPP.

Des histogrammes comparant le pourcentage de familles cellulaires par génération et le type de symétrie ou d’asymétrie dans le devenir pour la première division sont présentés ici. La distribution des destins par génération pour les MPP et la différenciation des conditions sont présentées ici. Cette procédure nécessite d’isoler les cellules en vrac pour définir la stratégie de contrôle appropriée.

Il est donc préférable de commencer la coloration avec au moins 10 000 cellules. La combinaison de cette méthode avec une mesure continue, comme l’imagination des cellules vivantes, peut être très puissante, car les deux ensemble peuvent fournir une description détaillée des premiers progéniteurs de la dynamique cellulaire. Cette approche a d’abord été développée pour la biologie des lymphocytes T par les laboratoires Hopkins.

Cette version, adaptée aux cellules souches sanguines, s’étend maintenant au cancer et à la biologie des cellules souches.