Production et maintien de cellules souches pluripotentes induites par les primates dérivées de l’urine

Les IPSC sur les primates sont utiles mais souvent difficiles à obtenir en raison de problèmes éthiques et techniques. Ce protocole offre la voie la plus accessible pour la génération et la maintenance des IPSC des primates. L’utilisation de cellules urinaires comme source primaire de CSPI présente un grand avantage car elles peuvent être obtenues de manière totalement non invasive sans aucune technique particulière.

Jessica Radmer, doctorante du Wolfgang M.S.Laboratory, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, centrifuger le tube contenant l’urine à 400G pendant 10 minutes. Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant, en laissant environ un millilitre dans le tube et en y remettant en suspension la pastille.

Lavez les cellules en ajoutant 10 millilitres de tampon de lavage urinaire contenant de l’amphotéricine et mélangez soigneusement la suspension à l’aide d’une pipette sérologique. Après centrifugation, aspirer soigneusement le surnageant, en laissant environ moins de 0,2 millilitre dans le tube. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu urinaire primaire contenant de l’amphotéricine par 50 millilitres d’urine initialement traitée.

Retirer la gélatine et ajouter un millilitre de suspension dans un puits de plaque de 12 puits recouverte de gélatine. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Pour préparer une plaque de 12 puits revêtue d’une matrice membranaire basale, ajoutez 500 microlitres de matrice membranaire basale par puits.

Déplacez la plaque pour distribuer le liquide et incuberez-la à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après l’incubation, remplacez la matrice membranaire basale par 900 microlitres de milieu REMC et conservez-la à 37 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Calculez le volume de virus Sendai nécessaire pour une multiplicité d’infection de cinq en utilisant l’équation.

Décongelez rapidement les composants du kit de reprogrammation Sendai au bain-marie tempéré à 37 degrés Celsius. Ajouter le milieu REMC pour un total de 100 microlitres dans un tube avant d’ajouter le volume calculé de virus Sendai et de mélanger. Après dissociation des cellules urinaires comme décrit dans le manuscrit, comptez les cellules à l’aide du compteur de cellules et transférez le nombre souhaité de cellules dans un tube de 1,5 millilitre.

Obtenir la pastille par centrifugation et la remettre en suspension dans 100 microlitres du mélange de virus Sendai préparé. Incuber le tube pendant une heure à 37 degrés Celsius pour l’infection en suspension. Après l’incubation, ajouter le REMC à un total d’un millilitre avant d’ensemencer la suspension cellulaire dans la plaque de 12 puits recouverte de matrice membranaire basale.

Après la transduction, changer le milieu tous les deux jours jusqu’au développement de colonies de cellules souches pluripotentes induites, ou CISP, avec passage au milieu de génération de CSP le cinquième jour. Lorsque les colonies IPSC deviennent suffisamment grandes pour le passage des touffes, aspirez le milieu des cellules cultivées et lavez soigneusement les cellules avec 500 microlitres de DPBS. Après avoir retiré le DPBS, ajoutez 500 microlitres d’EDTA 0,5 millimolaire dans le puits et incuber pendant deux à cinq minutes.

Observez attentivement les cellules au microscope jusqu’à ce que les colonies commencent à se détacher. Lorsque les bords des colonies commencent à se décoller et que les espaces entre les cellules deviennent visibles, retirez l’EDTA et ajoutez soigneusement 500 microlitres de DPBS. Aspirer le DPBS et rincer le puits avec 500 microlitres de milieu de culture PSC à l’aide d’une pipette P-1000.

Pipeter de haut en bas pour disperser les colonies en touffes de taille appropriée. En fonction de la confluence, de la densité souhaitée des cellules ensemencées et de la préférence clonale IPSC, transférer 1/10 à 1/50 de la suspension d’amas cellulaires vers les nouveaux puits. Déplacez doucement la plaque d’avant en arrière plusieurs fois pour répartir les touffes uniformément dans le puits.

Incuber la plaque pendant au moins 30 minutes à 37 degrés Celsius pour laisser les touffes se fixer. Changez le milieu tous les deux ou trois jours jusqu’à ce que les colonies deviennent assez grandes pour passer. Après l’isolement, on peut voir des cellules malpighiennes et diverses cellules rondes plus petites qui ont été excrétées avec l’urine.

Les premières cellules adhérentes proliférant peuvent être vues, et ces cellules se développent en grandes colonies qui peuvent être traversées. Deux types de cellules distincts peuvent être observés, l’un ayant un phénotype épithélial et l’autre montrant un phénotype plus mésenchymateux avec une forme allongée. Après le premier passage, les cellules urinaires se développent comme une monocouche.

Au cours de la génération de l’IPSC, certaines cellules adhérentes peuvent être vues et ces cellules commencent à montrer des changements morphologiques, indiquant une reprogrammation des cellules. De plus, les cellules qui forment les colonies présentent la morphologie typique des cellules souches embryonnaires. Tous les IPSC générés partagent la morphologie typique des colonies de cellules souches embryonnaires, caractérisées par des cellules serrées avec des bords clairement définis.

L’immunocytochimie a été utilisée pour tester l’expression de marqueurs associés à la pluripotence dans les IPSC des gorilles. De plus, l’analyse par cytométrie de flux a montré que les IPSC des orangs-outans analysés sont positifs pour TRA-1-60. De plus, les IPSC des gorilles sont capables de se différencier en lignées endodermiques, mésodermiques et ectodermiques.

Un nombre accru de cellules différenciées et une perte d’intégrité et d’uniformité des frontières indiquent une mauvaise qualité du CISP. En revanche, des frontières définies, un emballage cellulaire serré et des nucléoles proéminents signifient des IPSC de haute qualité. En raison de la variabilité coronale, il faut optimiser les conditions spécifiques du clone, telles que le taux de fractionnement, le temps de passage et la taille des amas pour maintenir la croissance des IPSC des primates en bonne santé.

En tant que contrôles de qualité des IPSC établis, on peut vérifier la pré-puissance par induction directe ou indirecte de différenciation telle que la différenciation in vitro EV, en plus de vérifier l’expression génique marqueur.