Une analyse quantitative optimisée des protéines de liaison à l’ARN à l’aide d’ARN biotinylé court

Ce protocole permet d’identifier les partenaires de liaison aux protéines d’une séquence d’ARN connue en les tirant vers le bas à partir de l’extrait cellulaire à l’aide d’oligonucléotides d’ARN biotinylés. Par rapport aux méthodes qui nécessitent des détergents ou des températures élevées pour détacher les protéines de l’ARN, ces protocoles utilisent plutôt des conditions très douces qui permettent également de préserver les complexes protéiques potentiels. La démonstration de la procédure sera Jakob Rupert, un étudiant au doctorat sous ma disposition.

Commencez la récolte totale de protéines en retirant le milieu des puits de la plaque cellulaire HEK 293T et lavez les puits des six plaques de puits avec un millilitre de PBS. Jeter le PBS et transférer les plaques dans de la glace, avant d’ajouter 200 microlitres de tampon de lyse à chaque puits. Détacher et casser les cellules à l’aide d’un grattoir de cellules avant de transférer l’extrait de cellule dérivé de deux puits dans le même tube de 1,5 millilitre.

Après 30 minutes d’incubation sur glace et de centrifugation, transférer le surnageant dans un tube prérefroidi. Ensuite, calculez le volume d’extrait de protéines correspondant à 1,5 milligramme de protéines. Amenez ensuite tous les échantillons à un volume final de 600 microlitres à l’aide d’un tampon de lyse.

Conservez les échantillons sur la glace jusqu’à utilisation. Pour préparer les perles, mélangez-les dans le tampon de stockage en agitant le tube. Après avoir calculé les 100 microlitres de fluide de lisier par échantillon, placez le volume calculé de la boue dans une grille magnétique.

Pour laver les billes, retirez la solution de stockage et lavez les perles en ajoutant un millilitre de tampon de lyse et en l’inversant manuellement. Retirez ensuite le tampon à l’aide de la grille magnétique et répétez l’étape de lavage. Ajoutez aux billes un volume de tampon de lyse égal au volume initial de milieu de boue et mélangez-le en agitant le tube avant de distribuer le milieu uniformément dans autant de tubes de 1,5 millilitre que d’échantillons.

Pour le blocage des billes, retirez le tampon à l’aide du support magnétique et ajoutez 600 microlitres de 0,25 milligramme par millilitre de solution d’ARNt de levure préparée dans un tampon de lyse. Incuber pendant une heure à température ambiante sur une roue tournante. Retirez la solution d’ARNt à l’aide de la grille magnétique avant d’ajouter 600 microlitres de tampon de lyse et lavez-la en mélangeant manuellement.

Répétez l’étape de lavage et jetez le tampon. Pour chaque tube contenant les 100 microlitres initiaux du milieu de la boue, préparer 200 microgrammes d’oligonucléotide d’ARN dans 600 microlitres de tampon de lyse. Ajouter l’oligo aux billes et incuber pendant une heure à température ambiante pendant la rotation.

Retirer la solution des billes et laver deux fois avec 600 microlitres de tampon de lyse en tournant les tubes pendant cinq minutes chacun à température ambiante. Supprimez la mémoire tampon. Pour la liaison aux protéines sur les billes, séparez 5% ou 30 microlitres de volume de la solution protéique de 600 microlitres et conservez-la en entrée ou IN pour une analyse plus approfondie.

Ajouter le mélange de protéines restant à chaque tube de billes chargées et incuber avec des rotations lentes pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Retirez la fraction protéique non liée des billes à l’aide du support magnétique. Économisez 5% ou 30 microlitres de son volume et étiquetez-le à travers ou FT. Ajoutez un millilitre de tampon de lavage 1 aux perles et faites-le tourner pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Jetez le tampon et répétez ce lavage une fois. Ajouter un millilitre de tampon de lavage 2 aux perles. Et après avoir incubé à quatre degrés Celsius sur un rotateur pendant cinq minutes, jetez le surnageant.

Pour éluer les liants spécifiques, ajoutez 100 microlitres de tampon d’élution 1 aux billes. Après avoir mélangé manuellement en agitant le feuillage, incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Placez les tubes dans un mélangeur thermique et agitez vigoureusement pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius.

Placez ensuite le tube dans le rack magnétique et collectez la fraction éluée dans un tube propre. Une fois cela fait, faites tourner rapidement les billes avec une centrifugeuse de banc pour maximiser la récupération de l’éluat. Et économisez 5% ou cinq microlitres du volume total d’éluat ou de EL pour des analyses ultérieures.

Les protéines éluées ont été identifiées par spectrométrie de masse. Le tracé des protéines significativement enrichies dans un tracé de volcan a révélé que la teneur totale en protéines et les protéines enrichies éluées à partir de l’ARN étaient significativement plus élevées que l’ARN, ce qui suggère que l’ARN peut établir un plus grand nombre d’interactions spécifiques. À titre d’exemples de l’accord entre les résultats prédits et obtenus, les scores d’interaction pour l’ARN plus et l’ARN moins avec les protéines du protéome humain ont montré que HNRNPH3 devait se lier sélectivement à l’ARN plus, et que le PCBP2 interagirait spécifiquement avec l’ARN.

De plus, la protéine RBM41 a été prédite comme étant une promiscuité pour les deux oligonucléotides d’ARN. L’analyse par spectroscopie de masse d’échantillons d’essai de traction de protéines a confirmé la présence de HNRNPH3 dans l’ARN et de PCBP2 dans l’ARN moins. Alors que RBM41 a été trouvé pour interagir avec les deux.

Le transfert Western a été utilisé pour détecter la présence de TDP-43 dans les résultats et les étapes d’optimisation du protocole. Dans l’ARN, TDP-43 a été observé dans l’échantillon d’entrée et l’éluat, indiquant sa présence dès le début. TDP-43 a été retenu par l’ARN pendant les étapes de lavage et a été élué à la fin avec un tampon de sel élevé.

En cartographiant les interactions de l’ARN des protéines, cette méthode peut révéler des réseaux macromoléculaires derrière de nombreuses voies physiologiques. Par exemple, la régulation transcriptionnelle ou les mécanismes pathologiques incluant le cancer et la neurodégénérescence.