Name: Isolement et purification du β-glucane fongique comme stratégie d’immunothérapie pour le glioblastome (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Découvrez le protocole d'isolement et de purification des β-glucanes fongiques pour moduler les microglies contre le glioblastome. Cette méthode combine biotechnologie et culture cellulaire pour évaluer leur potentiel immunothérapeutique.

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Nous tenons à remercier le Dr Vasiliki Economopoulos pour son script interne permettant de mesurer le signal de fuluorescence dans ImageJ. Nous tenons également à remercier le CITIUS (Université de Séville) et tout leur personnel pour leur soutien lors de la manifestation. Ce travail a été soutenu par le FEDER espagnol I + D + i-USE, US-1264152 de l’Université de Séville, et le Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00

Les quatre variantes différentes de champignons décrites dans ce protocole ont été obtenues à partir d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux).
1. Isolement des β-glucanes fongiques
<ol><li>Extraction et isolement des polysaccharides solubles des champignons NOTE: Les polysaccharides solubles de champignons (SMP) ont été obtenus selon la procédure schématiquement illustrée à la figure 1.<ol><li>Rincer doucement les fructifications fraîches de P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus et G. lucidum (environ 2 000 g/champignon) dans de l’eau distillée cinq fois.</li>
		<li>Sécher les corps des fruits à 50 ± 2 °C dans une étuve de séchage à air conventionnelle jusqu’à ce qu’un poids constant soit atteint (~24 h).</li>
		<li>Broyer les champignons séchés dans un moulin à lames, en obtenant environ 200 g de poudre de chaque champignon.</li>
		<li>Suspendre 100 g de poudre de champignons (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus et G. lucidum) dans 1 000 mL deH2Od. Ensuite, autoclaver à 121 °C pendant 15 min, et enfin laisser à température ambiante pendant 30 min.</li>
		<li>Centrifuger la suspension obtenue à 6 000 x g pendant 10 min à 4 °C.</li>
		<li>Sécher le précipité contenant des polysaccharides de champignons insolubles (IMP) à 50 ± 2 °C dans une étuve de séchage à l’air pendant 24 h.</li>
		<li>Jeter le précipité et conserver le surnageant. Concentrer le surnageant 10 fois dans un évaporateur rotatif.</li>
		<li>Précipiter le concentré contenant des SMP avec de l’éthanol (concentration finale de 80 %) à 4 °C pendant une nuit.</li>
		<li>Centrifuger la suspension d’éthanol à 6 000 x g pendant 15 min à 4 °C, retenir la pastille (précipiter) et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.</li>
		<li>Laver le précipité trois fois avec de l’éthanol à 80% avant de le dissoudre dans H2Od (10% p/v). Ajuster le pH à 6,5/7 et la température à 37 °C, et traiter avec 2 u et 4 U de α-amylase et de glucoamylase, respectivement, pour solubiliser les α-glucanes en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).</li>
		<li>Après le traitement par α-amylase/glucoamylase, ajuster le pH et la température à 8,0 et 50 °C, respectivement, et traiter avec de l’alcalase (2,5 U/g de protéines) (voir le tableau des matières) pour solubiliser les protéines. REMARQUE: Ce traitement enzymatique séquentiel élimine la plupart des α-glucanes et des protéines qui coprécipitent avec les β-glucanes dans la précipitation de l’éthanol.</li>
		<li>Après hydrolyse, centrifuger l’hydrolysat à 6 000 x g pendant 15 min à 4 °C et le surnageant propre concentré cinq fois dans un évaporateur rotatif. Précipiter à nouveau avec de l’éthanol à 80%.</li>
		<li>Solubiliser le précipité résultant dansH2Odet dialyser dans de l’eau distillée pendant 24 h à l’aide de membranes de tubes en cellulose (membranes de coupure de 12 000 Da; voir le tableau des matériaux) pour éliminer les molécules de faible poids moléculaire. Récupérer la partie soluble dans l’eau et la lyophiliser pour produire des β-glucanes solubles (SβGs).</li>
	</ol></li>
	<li>Mesure du sucre et des protéines<ol><li>Mesurer la teneur totale en sucre de chaque fraction par la méthode de l’acide phénol-sulfurique, en utilisant le glucose comme norme8. NOTE: La quantification de la teneur en β-glucane peut également être effectuée à l’aide de la trousse de dosage du β-glucane (champignon et levure; voir le tableau des matériaux), basée sur l’hydrolyse enzymatique et l’activité des oxydoréductases: à savoir l’exo-1,3-β-glucanase, la glucose oxydase, la β-glucosidase et la peroxydase, avec formation ultérieure de la quinoneimine. Suivez les instructions du fabricant, avec de légères modifications.</li>
		<li>Utilisez 18 MH 2 SO4 au lieu de 12 MH2SO4.</li>
		<li>Évaluer séparément la teneur en glucanes totaux et en α-glucanes.</li>
		<li>Mesurez les valeurs de β-glucane résultantes comme la différence entre les valeurs de glucane total et de α-glucane (triplicate) selon le protocole de Kjeldahl. Dans certains cas, la teneur en protéines peut être déterminée par la méthode de Lowry, en utilisant l’albumine pour tracer la courbe d’étalonnage11,12.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse par spectroscopie d’absorption ultraviolette<ol><li>Obtenir les spectres ultraviolets (UV) SβG à l’aide d’un spectrophotomètre UV-visible (voir le tableau des matériaux) en balayant les échantillons dans la région de 200 à 400 nm (Figure 2).</li>
		<li>Préparer 1,0 mg/mL de chaque SβG dansH2O, transférer la solution dans une cuvette de quartz et scanner à température ambiante.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse de la distribution du poids moléculaire<ol><li>Estimer l’homogénéité des SβG et le poids moléculaire des polymères par chromatographie d’exclusion granulométrique (SEC) à l’aide d’un système de chromatographie liquide à haute performance (CLHP) (voir Tableau des matériaux) équipé d’un détecteur d’indice de réfraction et d’une colonne de filtration linéaire sur gel ultra-hydrogel (300 mm x 7,8 mm; Graphique 3).</li>
		<li>Effectuer l’essai à 40 °C en utilisant de l’eau désionisée comme éluant à un débit de 0,5 mL/min-1 et des dextranes (110, 80 et 50 kDa) comme étalons (voir le tableau des matériaux). Recueillir une fraction de 5 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse infrarouge à transformée de Fourier (FTIR)<ol><li>Enregistrer les spectres infrarouges (Figure 4) sur un spectromètre FTIR dans la plage de 4000-500 cm-1. Les échantillons doivent être préalablement mélangés avec du KBr pour former des films (procédure IRTF standard; voir les instructions du fabricant et le tableau des matériaux).</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse de la composition moléculaire<ol><li>Estimer les compositions moléculaires des SβG par chromatographie sur couche mince à haute performance (HPTLC) ainsi que par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS), en suivant les procédures standard12.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Étude in vitro de la stimulation microgliale induite par le β-glucane
<ol><li>Culture cellulaire de cellules de glioblastome et de microglie de souris dans des lames de chambre à 8 puits REMARQUE: Ce protocole est spécifique pour les lignées cellulaires GL261 (glioblastome) et BV2 (microglie). Cependant, avec de légères modifications, ces étapes pourraient potentiellement être utilisées pour étudier d’autres lignées cellulaires cancéreuses et immunitaires.<ol><li>Préparer le milieu complet Eagle’s medium modifié (DMEM) de Dulbecco modifié avec du L-glutamine, 4,5 g/L de D-glucose et sans pyruvate. Ajouter 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine (voir le tableau des matières). Préchauffer le matériau au bain-marie à 37 °C pendant 15 min.</li>
		<li>Décongeler les aliquotes BV2 et GL261 congelées dans un bain-marie (37 °C) pendant 2 min, et juste avant qu’elles ne décongèlent complètement, les transporter dans une hotte à flux laminaire et plaquer les cellules dans deux flacons T25 stériles différents (un pour chaque lignée cellulaire).</li>
		<li>Incuber les fioles T25 à 37 °C, 5% CO2 jusqu’à ce que la culture soit confluente. NOTE: Selon les conditions de congélation et le temps de cryoconservation, le temps jusqu’à la confluence peut varier. Ces lignées cellulaires ont généralement besoin de 3 à 5 jours pour atteindre la confluence dans un flacon T75.</li>
		<li>Une fois que la culture cellulaire BV2 devient confluente, transférez-la dans des lames de chambre à 8 puits 0,6 x 106 cellules / puits. Conservez les lames de chambre à 8 puits dans l’incubateur pendant 24 h.</li>
		<li>Une fois que les cellules microgliales sont plaquées dans les lames de chambre à 8 puits, répétez le même protocole avec les cellules GL261.</li>
	</ol></li>
	<li>Activation de la microglie avec des β-glucanes<ol><li>Enduisez les cellules BV2 de quatre β-glucanes différents (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum et H. erinaceus) à une concentration de 0,2 mg/mL pendant 72 h. Une condition expérimentale doit rester non traitée (milieu normal), agissant comme groupe témoin.</li>
		<li>Recueillir le surnageant à l’aide d’une pipette après 72 h et passer le volume restant à travers un filtre à seringue de 0,20 μm. Ensuite, congeler le surnageant à -80 °C pendant au moins 24 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Traitement du GL261 avec un milieu pré-activé conditionné par la microglie<ol><li>Une fois que le GL261 est confluent à 80 % dans les lames de la chambre à 8 puits, ajouter un milieu microglial traité au β-glucane (étape 2.2.2) à une concentration volumique finale de 25 % pendant 72 h (volume total : 250 μl/puits).</li>
		<li>Retirez le milieu après 72 h d’incubation et jetez-le.</li>
		<li>Laver les cellules avec une solution saline tampon phosphate (PBS; pH 7,4, 0,1 M) trois fois pendant 5 minutes.</li>
		<li>Fixez les cellules en ajoutant 200 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % à 4 °C pendant 15 min. REMARQUE: Selon les différents anticorps qui pourraient être utilisés pour l’immunofluorescence, les méthodes de fixation peuvent différer de la PFA typique à 4%. Les fixateurs à base d’alcool peuvent être plus efficaces pour préserver certains épitopes.</li>
	</ol></li>
	<li>Étude d’immunofluorescence<ol><li>Laver les échantillons avec du PBS avec du triton X (PBST; 0,01%) pendant 10 minutes trois fois.</li>
		<li>Retirer le PBST et ajouter le tampon bloquant l’albumine sérique bovine (BSA) à 10 % dans le PBST (tableau 1) pendant 30 min à température ambiante.</li>
		<li>Retirer le tampon de blocage et ajouter 200 μL par puits de PBS contenant le mélange d’anticorps primaires (anticorps monoclonal Ki-67 de rat 1:500 et anticorps de caspase-3 clivé de lapin 1:500; voir le tableau des matières). Incuber pendant une nuit à 4 °C.</li>
		<li>Après 24 h d’incubation à 4 °C, laisser les échantillons à température ambiante pendant 30 min.</li>
		<li>Lavez les puits trois fois pendant 10 min avec du PBS sur un agitateur (basse vitesse).</li>
		<li>Retirer le PBS et le remplacer par 200 μL par puits de PBS contenant le mélange d’anticorps secondaires (anticorps secondaires 1:200 IgG anti-rat d’âne (H + L) anticorps secondaire fortement adsorbé, Alexa Fluor 488 et 1:200 IgG anti-lapin (H + L) anticorps secondaire fortement adsorbé par des oreilles croisées, Alexa Fluor 647; voir Tableau des matériaux) pendant 45 minutes à température ambiante dans l’obscurité.</li>
		<li>Laver les échantillons avec du PBS pendant 10 min sur un agitateur polyvalent.</li>
		<li>Retirer le PBS et ajouter 200 μL par puits de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dilué dans du PBS (1:5 000) pendant 1 min.</li>
		<li>Retirer le DAPI (voir Tableau des matières) et laver les cellules pendant 5 min dans du PBS.</li>
		<li>Retirez le cadre du puits et ajoutez 50 μL de PBS:glycérol (1:1) sur chaque puits et couvrez avec une lamelle de couverture.</li>
		<li>Scellez les lames avec du vernis à ongles.</li>
		<li>Acquérir des images à 20x à l’aide d’un système de microscope confocal (voir Tableau des matériaux).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Quantification et analyse de la prolifération et de l’apoptose des cellules tumorales
REMARQUE : Afin de mesurer l’effet potentiel des différents β-glucanes sur la prolifération et l’apoptose des cellules tumorales, un script interne a été utilisé dans le logiciel ImageJ pour quantifier le nombre de pixels positifs de Ki67 (prolifération) et cCasp3 (apoptose)13.
<ol><li>Ouvrez ImageJ. Cliquez sur le bouton Plugins . Cliquez sur Coloc2, un plugin précédemment installé dans le dossier plugin, et enfin sélectionnez l’image à analyser11. REMARQUE: Ce plugin était disponible suite à un contact précédent avec le Dr Vasiliki Economopoulos (veconom@uwo.ca). Au lieu du script, les logiciels ImageJ et Fiji ont des outils différents pour l’analyse de la colocalisation (voir Tableau des matériaux), avec des propriétés similaires.</li>
	<li>Définissez des seuils en fonction des conditions de contrôle (non traité, DMEM uniquement). Cliquez sur le bouton OK . REMARQUE: Afin d’éviter les différences d’arrière-plan et d’intensité, toutes les images doivent être prises dans les mêmes conditions. De préférence, les séances d’imagerie doivent être effectuées le même jour et les paramètres du microscope ne sont pas modifiés d’une image à l’autre.</li>
	<li>Assurez-vous que les images résultantes des pixels colocalisés et une fenêtre récapitulative indiquant le pourcentage ou le nombre brut de pixels au-dessus du seuil apparaissent. Normaliser les résultats par rapport aux conditions de contrôle (non traitées). NOTE: Toutes les données sont données sous forme de moyenne ± MEB. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’un logiciel de représentation graphique et d’analyse (voir le tableau des matériaux). Une ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaison multiple de Tukey a été utilisée. Les erreurs sont représentées par l’erreur-type de la moyenne (s.e.m.) (*p < 0,05, **p < 0,01).</li>
</ol>

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<li>Holubec, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+apoptosis+by+immunohistochemical+markers+compared+to+cellular+morphology+in+ex+vivo-stressed+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).</li>
<li>Borges, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+polysaccharide+production+by+a+strain+of+Pleurotus+djamor+isolated+in+the+south+of+Brazil+and+antitumor+activity+on+Sarcoma+180%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).</li>
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</ol>

Il n’y a pas d’intérêts concurrents à déclarer.

Ce travail décrit l’utilisation de techniques bien établies pour isoler, purifier et caractériser avec succès la teneur en SβG de quatre champignons différents. Les résultats ont montré comment, après l’extraction à l’eau chaude des SMP, obtenue à partir de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum et H. erinaceus, suivie d’un traitement hydrolytique à la α-amylase, à la glucosidase et à la protéase, la teneur en α-glucane et en protéines a été réduite, enrichissant ainsi de manière significative la ...

Malgré l’avènement de nouvelles réalisations dans le domaine de la neuro-oncologie, l’espérance de vie des patients atteints de glioblastome reste maigre. Les thérapies de référence contre les tumeurs cérébrales sont basées sur la fusion de la chirurgie, de la radiothérapie et de la chimiothérapie. Cependant, au cours de la dernière décennie, l’immunothérapie est apparue comme une stratégie puissante pour traiter différents types de cancer1. Ainsi, la possibilité d’exploiter la réponse immunitaire de l’organisme contre les cellules tumorales est récemment devenue le quatrième pilier de l’oncologie.
On sait depuis longtemps que l’un des plus grands défis dans le domaine est de surmonter la forte immunosuppression trouvée dans le microenvironnement tumoral2. En particulier, dans le cas du glioblastome, l’une des formes les plus courantes et les plus agressives de cancer du cerveau, démêler les voies clés qui orchestrent de tels scénarios pro-tumoraux et trouver de nouveaux composés qui pourraient contrecarrer la réponse déprimante du système immunitaire pourrait ouvrir la voie à de futures thérapies contre cette maladie incurable.
Le cerveau possède ses propres cellules du système immunitaire, et le type de cellule le plus pertinent est la microglie. Il a été prouvé que ces cellules ont un comportement assez complexe à travers différentes maladies centrales3. Dans le cas des tumeurs cérébrales primaires (par exemple, le glioblastome), ces cellules sont déplacées vers un phénotype anti-inflammatoire qui soutient les cellules tumorales pour coloniser le parenchyme cérébral3. De nombreuses publications ont renforcé le rôle majeur de ces cellules au cours de la progression tumorale. L’une des principales raisons en est que les microglies associées au gliome et les macrophages infiltrés (GAM) représentent un tiers de la masse tumorale totale, suggérant ainsi l’influence sans équivoque de leurs états d’activation au cours de la progression tumoralecérébrale 4,5.
Dans cette veine, les β-glucanes fongiques ont été décrits comme des molécules puissantes déclenchant des réponses immunitaires efficaces, y compris la phagocytose et la production de facteurs pro-inflammatoires, conduisant à l’élimination des agents pernicieux 6,7,8,9,10. Les β-glucanes fongiques ont généralement été étudiés en utilisant des extraits de différentes parties de champignons. Cependant, l’attribution d’effets spécifiques nécessite sa purification pour éviter les ambiguïtés et pouvoir comprendre le mécanisme d’action de telles molécules comme les agents immunomodulateurs8.
Dans ce travail, les β-glucanes solubles sont purifiés à partir de la fructification de quatre champignons différents, régulièrement utilisés comme champignons comestibles (Pleurotus ostreatus et Pleurotus djamor) et comme champignons médicinaux (Ganoderma lucidum et Hericium erinaceus). En particulier, ces quatre champignons sont très utilisés dans l’industrie alimentaire et pharmaceutique et ont été produits dans le cadre d’une économie circulaire respectueuse de l’environnement dans une entreprise commerciale (voir le tableau des matériaux).
Afin de jeter les bases de l’utilisation future des β-glucanes fongiques dans les thérapies du cancer du cerveau, des stratégies de purification bien définies et des études précliniques approfondissant leur interaction présumée avec les cellules du système immunitaire sont essentielles pour évaluer leur rôle potentiel en tant que médiateurs antitumoraux. Ce travail décrit les nombreuses étapes d’isolement et de purification nécessaires pour récupérer les β-glucanes solubles contenus dans les fructifications du champignon sélectionné. Une fois purifiées avec succès, les cellules microgliales sont activées pour améliorer leur phénotype inflammatoire. Les cellules de glioblastome de souris (GL261) sont recouvertes d’un milieu différent conditionné par la microglie, préalablement traité avec ces extraits, puis son effet sur le comportement des cellules tumorales est évalué. Fait intéressant, des études pilotes de notre laboratoire (données non montrées) ont révélé comment la microglie pro-inflammatoire peut ralentir la migration des cellules tumorales et les propriétés d’invasion non seulement dans les cellules de glioblastome, mais aussi dans d’autres lignées cellulaires cancéreuses. Ce travail multidisciplinaire peut fournir un outil utile aux chercheurs en oncologie pour tester des composés prometteurs capables de stimuler la réponse immunitaire dans de nombreux types de tumeurs.

<table><tbody><tr><td>Lames de chambre à 8 puits</td><td>Thermo Fisher, USA</td><td>171080</td><td></td></tr><tr><td>Four de séchage à l’air</td><td>J.P. Selecta S.A., Espagne</td><td>2000210</td><td></td></tr><tr><td>Albumine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Alcalase</td><td>Novozymes, Danemark</td><td>protéase</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Thermofisher, USA</td><td>A32731</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>Thermofisher, USA</td><td>A32728</td><td></td></tr><tr><td>Broyeur à lames</td><td>Retsch, Allemagne</td><td>&nbsp ; SM100</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>MERK, Allemagne</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Membrane de tube en cellulose</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td><td>D9402</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>MERK, Allemagne</td><td>Eppendorf, 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Colocalisation pluggins</td><td>ImageJ</td><td></td><td>(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis&nbsp ;)</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>MERK, Allemagne</td><td>28718-90-3</td><td></td></tr><tr><td>Dextrans</td><td>Pharmacosmos, Holbalk, Danemark</td><td>Dextran 410, 80, 50</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute ; s modifié Eagle&acute ; s medium, Gluta MAXTM</td><td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, États-Unis</td><td>10564011</td><td></td></tr><tr><td>Extenda (&alpha ;- Amylase/Glucoamylase)</td><td>Novozymes, Denmark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, États-Unis</td><td>A4736301</td><td></td></tr><tr><td>Spectromete FT-IR</td><td>Bruker-Vertex, Suisse</td><td>VERTEX 70v</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel</td> <td>de représentation graphique et d’analyseGraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système HPLC</td><td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td><td>Waters 2695 Incubateur HPLC</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppedorf</td><td>Galaxy 170S</td><td></td></tr><tr><td>Mass Spectometer</td><td>Q Exactive GC, Thermo Scientific</td><td>725500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>MERK, Allemagne</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Ph-mètre</td><td>Crison, Barcelone, Espagne</td><td>Basic 20</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td><td>1010-015</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps Caspase-3 clivé de lapin (Asp175)</td><td>Abcam, Royaume-Uni</td><td>ab243998</td><td></td></tr><tr><td>Rat Ki-67 Thermofisher monoclonal</td><td>, USA</td><td>MA5-14520</td><td></td></tr><tr><td>Évaporateur rotatif</td><td>B&uuml ; chi Ib&eacute ; rica S.L.U., Espagne</td><td>El Rotavapor R-100</td><td></td></tr><tr><td>Colonne de filtration linéaire sur gel ultra-hydrogel (300 mm x 7,8 mm)</td><td>Waters Corp, Milford, MA, États-Unis</td><td>WAT011545</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre UV-Visible</td><td>Amersham Bioscience, Royaume-Uni</td><td>Ultrospec 2100 pro</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount</td><td>Vector Laboratories, C.A, ÉTATS-UNIS</td><td>H-5000-60</td><td></td></tr><tr><td>Bain d’eau</td><td>J.P. Selecta S.A., Espagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système de microscope confocal Zeiss LSM 7 DUO.</td><td>Zeiss, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-glucanes Kit d’essai</td><td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Irlande</td><td>K-BGLU</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-glucanes</td><td>Setas y Hongos del Sur, S.L.</td><td></td><td>Fourni les quatre variantes de champignons</td></tr></tbody></table>

isolement et purification du β-glucane fongique comme stratégie d’immunothérapie pour le glioblastome

Isolation and Purification of Fungal &#946;-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma

L’un des plus grands défis dans le développement de thérapies efficaces contre le glioblastome est de surmonter la forte suppression immunitaire dans le microenvironnement tumoral. L’immunothérapie est apparue comme une stratégie efficace pour retourner la réponse du système immunitaire contre les cellules tumorales. Les macrophages et microglies associés aux gliomes (GAM) sont les principaux moteurs de tels scénarios anti-inflammatoires. Par conséquent, l’amélioration de la réponse anticancéreuse dans les GAM peut représenter un traitement coadjuvant potentiel pour traiter les patients atteints de glioblastome. Dans cette veine, les molécules fongiques β-glucane sont connues depuis longtemps comme de puissants modulateurs immunitaires. Leur capacité à stimuler l’activité immunitaire innée et à améliorer la réponse au traitement a été décrite. Ces caractéristiques modulatrices sont en partie attribuées à leur capacité à se lier aux récepteurs de reconnaissance de formes, qui, fait intéressant, sont grandement exprimés dans les GAM. Ainsi, ce travail est axé sur l’isolement, la purification et l’utilisation ultérieure de β-glucanes fongiques pour améliorer la réponse tumoricide de la microglie contre les cellules de glioblastome. Les lignées cellulaires de glioblastome de souris (GL261) et de microglie (BV-2) sont utilisées pour tester les propriétés immunomodulatrices de quatre β-glucanes fongiques différents extraits de champignons fortement utilisés dans l’industrie biopharmaceutique actuelle: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus et Ganoderma lucidum. Pour tester ces composés, des tests de co-stimulation ont été effectués pour mesurer l’effet d’un milieu conditionné par la microglie pré-activé sur la prolifération et l’activation de l’apoptose dans les cellules de glioblastome.

Purification réussie des β-glucanes La masse de MP, SMP et SβG obtenue à partir des fructifications de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum et H. erinaceus après le processus d’extraction et de purification est résumée dans le tableau 1. La composition de base (glucides totaux, β-glucanes et protéines) des MP, SMP et SβG obtenus à partir des champignons est représentée dans le tableau 2. Ces résultats montrent comment le protocole a ...

Le présent protocole décrit les étapes de purification et les études ultérieures de quatre β-glucanes fongiques différents en tant que molécules immunomodulatrices potentielles qui améliorent les propriétés antitumorales de la microglie contre les cellules de glioblastome.

Isolement et purification du β-glucane fongique comme stratégie d’immunothérapie pour le glioblastome

One of the biggest challenges in developing effective therapies against glioblastoma is overcoming the strong immune suppression within the tumor ...

Les bêta-glucanes fongiques sont d’importants modulateurs du système immunitaire. L’amélioration de la pureté et des protocoles d’isolement est essentielle pour affirmer leur rôle potentiel en tant que coadjuvants pour le traitement du cancer. Un degré élevé de quatre bêta-glucanes différents a été atteint en utilisant divers dispositifs couramment trouvés dans les laboratoires de biologie moléculaire et de protéomique.Ce protocole vise à tester les effets des bêta-glucanes sur la microglie, la cellule immunitaire résidente la plus abondante du cerveau. La modulation du phénotype de la microglie dans le glioblastome peut fournir des informations importantes sur. Commencez l’extraction des polysaccharides solubles des champignons ou SMP en rinçant cinq fois les fructifications fraîches de Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus et Ganoderma lucidum.Ensuite, séchez complètement les fructifications lavées à 50 degrés Celsius dans un four de séchage à l’air conventionnel pendant environ 24 heures avant de les broyer dans un broyeur à lame en obtenant environ 200 grammes de poudre de chaque champignon. Ensuite, suspendez 100 grammes des quatre poudres de champignons ou MP dans 1 000 millilitres d’eau distillée et autoclavez la suspension à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après 30 minutes d’incubation à température ambiante, centrifuger la suspension obtenue à 6 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.Séchez ensuite le précipité contenant des polysaccharides de champignons insolubles ou IMP à 50 degrés Celsius dans une étuve de séchage à l’air pendant 24 heures. Jeter le précipité et concentrer le surnageant 10 fois dans un évaporateur rotatif. Ensuite, précipiter le concentré contenant des SMP avec de l’éthanol pendant la nuit à quatre degrés Celsius.Après avoir centrifugé la suspension d’éthanol à 6 000 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, jeter le surnageant à l’aide d’une pipette et laver la pastille trois fois avec de l’éthanol à 80 % avant de la dissoudre et de l’eau distillée. Ajustez le pH à 6,5 à 7 et la température à 37 degrés Celsius et solubilisez les alpha-glucanes en traitant la suspension avec deux unités et quatre unités d’alpha-amylase et de glucoamylase respectivement. Ensuite, ajustez le pH à 8,0 et la température à 50 degrés Celsius et solubilisez les protéines en traitant la suspension avec de l’alkalase équivalente à 2,5 unités par gramme de protéines.Après hydrolyse, centrifuger l’hydrolysat et nettoyer le concentré surnageant cinq fois dans un évaporateur rotatif. Précipiter à nouveau le concentré surnageant en ajoutant 80% d’éthanol. Pour éliminer les molécules de faible poids moléculaire, solubiliser le précipité dans de l’eau distillée et le dialyser dans l’eau distillée pendant 24 heures à l’aide de 12 000 membranes de tubes de cellulose de coupure Dalton.Récupérez la partie soluble dans l’eau et lyophilisez-la pour produire des bêta-glucanes solubles ou S bêta-G. Évaluez le nombre total de glucanes et d’alpha-glucanes séparément. Mesurez les valeurs de bêta-glucane résultantes comme la différence entre les valeurs de glucane total et d’alpha-glucane.Pour obtenir les spectres UV S bêta-G à l’aide d’un spectrophotomètre UV visible, préparer 1,0 milligramme par millilitre de chaque S bêta-G dans de l’eau distillée. Transférer l’échantillon dans une cuvette de quartz et scanner à température ambiante dans la région de 200 à 400 nanomètres. Estimer l’homogénéité des S bêta-G et le poids moléculaire des polymères par chromatographie d’exclusion de taille ou SEC à l’aide d’un système de chromatographie liquide ou HPLC haute performance équipé d’un détecteur visible UV et d’une colonne de filtration sur gel Superdex TM 200 10/300 GL.Enregistrer les spectres infrarouges de l’échantillon sur un spectromètre infrarouge à transformée de Fourier ou FTIR dans la plage de 4 000 à 500 centimètres. Activer la microglie en recouvrant les cellules microgliales BV2 pendant 72 heures avec une concentration de 0,2 milligramme par millilitre de quatre bêta-glucanes différents isolés de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum et H. erinaceus. Après 72 heures, recueillir le surnageant à l’aide d’une pipette et passer le volume restant à travers un filtre à seringue de 0,20 micromètre.Ensuite, congelez le surnageant à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 24 heures. Pour traiter le GL 261 avec le milieu conditionné par la microglie préactivé, ajoutez 250 microlitres de milieu microglial traité au bêta-glucane à 80% de cellules GL 261 confluentes pendant 72 heures. Jeter le support après 72 heures.Les spectres UV des différents S bêta-G n’ont pas montré de pics d’absorption UV à 260 et 280 nanomètres, ce qui indique que les S bêta-G manquaient d’acides nucléiques et de protéines. Les chromatogrammes CLHP ont montré une bonne homogénéité avec un pic principal aigu et unique à 10,9 minutes pour P. ostreatus, 10,5 minutes pour le lucidum, 11,3 minutes pour P. djamor et 8,20 minutes pour H. erinaceus, ce qui suggère que la fraction est compatible avec les homopolymères. Les spectres FTIR ont mesuré les vibrations moléculaires correspondant aux liaisons polysaccharidiques covalentes.Il a montré que les bêta-G SS comprenaient des glucides conjugués à une protéine minimale. HPTLC et GC-MS analysant le profil monosaccharidique de S bêta-G ont révélé la présence d’une grande quantité de D-glucose, de plus petites quantités de D-galactose et de D-mannose, et une trace de D-xylose, D-rhamnose, D-fucose et L-arabinose. À l’aide d’un script interne dans le logiciel ImageJ, le nombre de pixels positifs pour chaque canal fluorescent a été quantifié.Le script utilisait des échantillons de contrôle comme seuil pour l’intensité de chaque fluorophore et fournissait le nombre de pixels. Il indiquait l’expression de chaque marqueur après différentes conditions expérimentales. Fait intéressant, le GL 261 n’a pas subi de différences significatives en ce qui concerne la prolifération tumorale lors de l’exposition aux différents milieux conditionnés par la microglie.Cependant, P. djamor et H. erinaceus ont montré une forte induction d’une augmentation d’environ six et neuf fois plus de caspase-3 clivée-3 respectivement. Assurer une pureté de haute qualité des bêta-glucanes est essentiel pour ce protocole. Ce protocole utilise des équipements avancés tels que spectrophotomètre, HPLC.ou FITR. L’utilisation de ces outils améliore la robustesse de nos résultats. Nous pouvons analyser en toute confiance les effets des bêta-glucanes sur la microglie et obtenir des résultats plus fiables.En raison du temps et des limites mondiales, nous avons limité notre protocole à l’étude des bêta-glucanes sur les cellules microgliales. Cependant, d’autres cellules du système immunitaire telles que les macrophages ou les cellules T peuvent être facilement pendant ce protocole. Pour la première fois, ces protocoles combinent deux domaines de connaissances différents.Premièrement, l’utilisation de procédures biotechnologiques pour purifier des produits spécifiques et, deuxièmement, l’utilisation de techniques de culture cellulaire pour tester leurs propriétés immunomodulatrices.

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Ce protocole vidéo démontre l'isolement et l'expansion des cellules souches comme des cellules de glioblastome mutliforme résection chirurgicale humaine (GBM) tissu tumoral en utilisant la méthode de dosage Neurosphère culture.

L&#39;isolement et l&#39;expansion des cellules humaines de glioblastome multiforme tumeur utilisant le test Neurosphère

Cette vidéo montre un test in vitro utilisant des β-glucanes pour activer les cellules microgliales afin de produire des radicaux superoxydes, une espèce réactive de l’oxygène. Dans les cellules cancéreuses du cerveau, les oxydants réactifs générés suppriment activement la prolifération des cellules tumorales et induisent la mort cellulaire.

Un test pour l’analyse du test β-glucane en tant que stratégie d’immunothérapie contre les cellules cancéreuses du cerveau

La vidéo démontre l’isolement de cellules mononucléées du sang périphérique infiltrant la tumeur à partir d’un cerveau de souris en utilisant la dissociation mécanique et la digestion enzymatique. Ceci est suivi d’une centrifugation à gradient de densité pour collecter les cellules immunitaires pour une analyse plus approfondie.

Isolement de cellules immunitaires infiltrant la tumeur d’un cerveau murin

Protocole pour la propagation des spécimens chirurgicaux à haute teneur dissociés de gliome dans le milieu sans sérum de neurosphère pour sélectionner pour des cellules avec le phénotype de cellules souches cancéreuses. Pour les spécimens qui ne se développent pas en tant que neurosphères, un protocole alternatif est suggéré. Une technique de incorporation de paraffine pour maintenir l’architecture 3D de neurosphère pour immunocytochemistry est décrite.

Optimisation de la culture cellulaire de gliome de haut grade à partir d’échantillons chirurgicaux pour une utilisation dans des modèles animaux cliniquement pertinents et l’immunochimie 3D

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Génération de la RCA cellules T pour la thérapie adoptive dans le contexte de glioblastome norme de diligence

Présenté ici est une méthode simple pour l'isolement et le flux analyse cytométrique de cellules mononucléaires du sang périphérique gliome infiltrant qui donne des données quantitatives en fonction du temps sur le nombre et le statut activation des cellules immunitaires qui entrent dans le microenvironnement de tumeur cérébrale tôt.

L&#39;isolement et la cytométrie en flux analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique gliome infiltrant

Pour comprendre le comportement malin du cancer, il faut créer des modèles précis de la façon dont les cellules tumorales interagissent avec les composants du microenvironnement tumoral, tels que les macrophages. Ici, nous décrivons deux méthodes pour étudier l’interaction des cellules de glioblastome avec les macrophages associés aux tumeurs et la microglie où l’effet sur l’invasion du glioblastome est évalué.

Coculture Assays pour étudier macrophage et microglie Stimulation de glioblastome Invasion

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Guidée par l’image de la résection du glioblastome et Implantation intracrânienne d’échafaudages de graines cellules souches thérapeutiques

Ici, nous présentons un protocole pour la préparation et l’administration stéréotaxique de lymphocytes humains allogéniques dans des souris immunodéficientes transportant des tumeurs primaires du cerveau humain orthotopique. Cette étude fournit une preuve de concept pour la faisabilité et l’efficacité antitumorale des immunothérapies cellulaires intrabrain-livré.

Stéréotaxique transfert adoptif de cellules immunitaires cytotoxiques dans des modèles murins de xénogreffes de glioblastome Multiforme Orthotopic homme

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Découvrez le protocole d'isolement et de purification des β-glucanes fongiques pour moduler les microglies contre le glioblastome. Cette méthode combine biotechnologie et culture cellulaire pour évaluer leur potentiel immunothérapeutique.

Isolement et purification du β-glucane fongique comme stratégie d’immunothérapie pour le glioblastome

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