Protocole d’évaluation et de quantification des pathologies de l’épithélium pigmenté rétinien dans des modèles murins de dégénérescence maculaire liée à l’âge

Ce protocole est le premier à décrire comment traiter et évaluer la taille de la souris pour les pathologies RP en utilisant la microscopie électronique et confocale à transmission de lumière. Le principal avantage de ce protocole est l’inclusion d’évaluations quantitatives des pathologies RP, en utilisant ces trois techniques d’imagerie pour des comparaisons statistiques. Les techniques décrites dans ce protocole peuvent également aider à élargir nos connaissances sur les voies moléculaires importantes pour la santé des EPR.

Les personnes qui n’ont jamais disséqué la taille de la souris peuvent avoir du mal avec ce protocole. Nous suggérons à ces personnes de pratiquer avec des souris pour maîtriser les techniques décrites dans ce protocole. Pour commencer, préparez un système de perfusion par gravité sur un sous-tampon absorbant pour la perfusion cardiaque dans une hotte.

Versez 40 millilitres de tampon fixateur fraîchement préparé dans le corps de la seringue du système de perfusion. Tournez la vanne parallèlement à la conduite de tuyauterie pour permettre au tampon de s’écouler à travers la conduite de tuyauterie. Rincez la ligne jusqu’à ce que toutes les bulles d’air soient retirées de la conduite.

Ensuite, tournez la vanne perpendiculairement à la conduite de tuyauterie pour empêcher le tampon de s’écouler dans la conduite de tuyauterie. Pour effectuer une perfusion cardiaque, transférez la souris euthanasiée dans un plateau peu profond près du système de perfusion. Avec l’abdomen tourné vers le haut.

Vaporisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70%, puis créez une coupe inférieure de cinq centimètres à l’aide de ciseaux incurvés et de pinces à travers la peau et la paroi abdominale du côté gauche de la souris sous la cage thoracique. Procédez à une coupe médiale de trois centimètres à travers la peau et la paroi abdominale au sommet de la coupe inférieure. Faites une autre coupe inférieure de cinq centimètres à l’extrémité de la coupe médiale à travers la peau et la paroi abdominale sur le côté droit le plus éloigné de la souris sous la cage thoracique.

Faites une autre incision médiale de trois centimètres pour enlever le lambeau de peau abdominale avec une pince incurvée. Ensuite, coupez à travers le diaphragme et le sternum pour exposer le cœur. Insérez l’aiguille de la jauge dans le ventricule gauche du cœur et tournez la valve.

Coupez l’oreillette droite avec des ciseaux incurvés pour permettre au sang et au fixateur de sortir du cœur. Laissez 10 millilitres de tampon fixateur perfuser la souris pendant une à deux minutes, ou jusqu’à ce que le foie devienne de couleur pâle et qu’aucun sang ne s’écoule de l’oreillette droite. Une fois la perfusion terminée, tournez la vanne perpendiculairement à la conduite de tuyauterie pour arrêter l’écoulement tampon.

Pour nucléer les yeux, retirez la souris du plateau peu profond et placez-la sur le sous-tampon absorbant dans une hotte aspirante. Ensuite, orientez la tête de la souris avec l’œil gauche face à l’expérimentateur et l’œil droit hors de vue. Annoter le côté supérieur de l’œil avec un colorant de marquage tissulaire.

Appuyez doucement autour de l’orbite avec le pouce et l’index pour la saillie de l’œil de l’orbite. Ensuite, à l’aide de ciseaux incurvés, tenez l’œil avec la lame à un angle de 30 degrés de l’orbite et coupez autour de l’œil. Retirez le globe oculaire de la tête à l’aide d’une pince incurvée et placez-le sur un coussinet absorbant.

Entailler la cornée avec une lame de scalpel numéro 11 et placer l’œil avec une pince incurvée dans un micro-tube de deux millilitres contenant deux millilitres de tampon fixateur. Après avoir nucléé les deux yeux, incuber dans un tampon fixateur pendant une nuit sur un agitateur dans une pièce à quatre degrés à une vitesse de 75 tr / min. Le lendemain, remplacez le tampon fixateur par deux millilitres de PBS et incuber pendant 10 minutes sur un agitateur à température ambiante et 75 tr/min.

Ensuite, pour générer des segments postérieurs, placez l’œil dans une boîte de Petri remplie de PBS sous un microscope à dissection. Soulevez doucement la graisse et les muscles loin du globe oculaire avec une pince à pointe fine. Coupez soigneusement la graisse et le muscle avec des ciseaux à microdissection dans une direction parallèle au globe oculaire jusqu’à ce que le globe oculaire ait une couleur bleu-noir uniforme Placez des pinces à pointe fine au site de ponction cornéenne et coupez autour du périmètre de la cornée en commençant par le site de ponction avec des ciseaux à microdissection pour enlever la cornée et l’iris du globe oculaire.

Ensuite, à l’aide d’une pince à pointe fine, retirez doucement la lentille du globe oculaire pour céder le segment postérieur. Placez le segment postérieur dans un tube contenant deux millilitres de PBS et conservez à quatre degrés Celsius au réfrigérateur jusqu’à utilisation. Transférer l’œil dans une boîte de Petri contenant du PBS et retirer la cornée et l’iris comme démontré.

Retirez la lentille à l’aide d’une pince à pointe fine. Ensuite, à l’aide de deux pinces à pointe fine, séparez doucement la rétine neurale du segment postérieur. Coupez soigneusement la rétine neurale à la tête du nerf optique pour la retirer de l’œillet postérieur.

Placez l’œilleton dans un micro-tube de deux millilitres contenant cinq microlitres de PBS. Pour fixer les œillets postérieurs, ajoutez 500 microlitres de méthanol au tissu et incuber sur un agitateur à 75 tr / min, pendant cinq minutes. Répéter la fixation du méthanol trois fois avec l’incubation finale pendant deux heures.

Après la fixation, laver le tissu trois fois avec PBS, avant de procéder à la coloration par immunofluorescence et à la visualisation par microscopie confocale. Des souris TMEM 135 TG âgées de quatre mois ont montré une réduction significative de l’épithélium pigmenté rétinien ou de l’épaisseur de l’EPR à 600 et 900 micromètres du nerf optique, par rapport aux souris de type sauvage appariées selon l’âge. Les incidents de pathologies RPE, y compris la microvascuolisation, la macrovacuolisation et la migration de souris WT âgées de 325 jours et TMEM 135 TG, ont été calculés.

La fréquence moyenne de microvacuolisation de l’EPR était plus faible chez les souris sauvages que chez les souris TMEM 135 TG. Aucune macrovacuolisation et migration RPE n’a été détectée chez les types sauvages par rapport aux valeurs moyennes observées chez les souris TMEM 135 TG. En microscopie électronique à transmission, des dépôts laminaires basaux ont été observés dans des rétines âgées de 24 mois qui étaient absentes dans des rétines de deux mois.

L’analyse des fréquences cumulées des hauteurs des dépôts laminaires basaux a indiqué un déplacement vers la droite de la ligne pour les 24 mois, par rapport aux deux mois, démontrant une augmentation des dépôts chez les souris âgées de 24 mois. Cette observation a été soutenue par des tailles moyennes plus grandes dans les rétines âgées de 24 mois. L’EPR chez des souris TMEM 135 TG âgées de quatre mois était dysmorphique.

L’EPR dans les rétines TMEM 135 TG est plus grande et moins dense que les rétines de type sauvage appariées selon l’âge. En outre, plus de cellules RPE multinucléées dans les rétines TG ont été observées, par rapport aux témoins. En suivant ce protocole, les chercheurs pourraient évaluer des voies spécifiques en utilisant des techniques de biologie moléculaire chez la souris, ce qui pourrait contribuer à notre compréhension de la façon dont ces pathologies RP se développent chez la souris.

Ce protocole aidera à normaliser le phénotypage RP chez la souris, ce qui traduira les résultats des études sur les souris vers d’autres modèles de DMLA et nous aidera à comprendre la pathobiologie de la DMLA.