Imagerie à molécule unique de la mobilité latérale et de l’activité des canaux ioniques dans les bicouches lipidiques à l’aide de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF)

Les canaux ioniques ne sont pas statiques dans les membranes biologiques. Nous présentons ici une approche optique à molécule unique pour démêler le lien entre la diffusion de la membrane latérale et la fonction du canal ionique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres méthodes est que le marquage fluorescent des protéines qui pourraient interférer avec leur mouvement latéral et leur fonction n’est pas nécessaire.

La méthode peut être appliquée à n’importe quel canal protéique membranaire où la diffusion libre ou restreinte est importante pour l’organisation et la fonction. Pour commencer, transférez 380 microlitres de la solution mère DPhPC dans un flacon en verre et superposez la solution mère lipidique avec de l’argon ou de l’azote gazeux pour empêcher l’oxydation des lipides. Utilisez le débit de gaz le plus faible possible pour éviter l’évaporation du solvant organique dans lequel les lipides sont dissous ou les éclaboussures des pulvérisations de solvant du flacon.

Sécher l’échantillon lipidique sous un jet d’azote et retirer le solvant organique restant de l’échantillon lipidique sous vide à l’aide d’une pompe à vide sans huile pendant la nuit. Dissoudre le film lipidique dans une solution d’huile de silicone hexadécane en ajoutant des volumes égaux d’hexadécane et d’huile de silicone à l’aide d’une pipette d’un millilitre à une concentration lipidique finale de 9,5 milligrammes par millilitre. Placez quelques lamelles de couverture en verre dans un porte-lamelles en acier inoxydable et nettoyez-les dans un bécher en verre pendant environ 10 minutes avec de l’acétone dans un nettoyeur à ultrasons.

Rincez les lamelles de couverture avec de l’eau double désionisée et séchez-les sous un jet d’azote. De plus, nettoyez et hydrophylisez une lamelle de couverture dans un nettoyant au plasma avec de l’oxygène pendant cinq minutes. Montez un couvercle traité au plasma sur un enrobage et enduisez le couvercle d’un film d’agarose d’une épaisseur inférieure au micromètre en ajoutant lentement 140 microlitres d’agarose chauffée à bas point de fusion à 0,75% avec une pipette de 200 microlitres à 3 000 tr / min pendant 30 secondes.

Fixez immédiatement la lamelle de couverture enduite d’essorage avec la fine couche d’hydrogel d’agarose à la face inférieure de la chambre en PMMA. Assurez-vous que l’hydrogel d’agarose pointe vers le haut. Fixez les bords de la lamelle de couverture au dispositif micro-usiné en PMMA avec du ruban adhésif transparent et placez l’appareil sur une plaque chauffante chauffée à 35 degrés Celsius.

Versez soigneusement 200 microlitres de solution d’agarose à 2,5% dans l’entrée de la chambre sans créer de bulles d’air. Couvrir immédiatement les puits de la chambre en PMMA avec environ 60 microlitres de la solution d’huile lipidique pour initier la formation de monocouche lipidique à l’interface de l’huile d’agarose afin d’éviter la déshydratation de l’agarose enrobée d’essorage dans les puits de la chambre en PMMA. Placez l’appareil sur une plaque chauffante à 35 degrés Celsius pendant environ deux heures.

Placez environ 20 microlitres de solution d’huile de silicone hexadécane lipidique dans chacun des nombreux puits microfabriqués dans une chambre d’incubation de gouttelettes. Préparez une aiguille en verre microcapillaire avec un diamètre d’ouverture de pointe d’environ 20 micromètres à l’aide d’un extracteur de micropipette vertical ou horizontal. Remplissez l’aiguille avec environ cinq microlitres de solution d’injection aqueuse contenant 8,8 millimolaires HEPES, sept micromolaires d’un colorant fluorescent, Fluo-8, 400 micromolaires EDTA, 1,32 molaire de chlorure de potassium et 30 nanomolaires TOM core complex ou bien 20 nanomolaires OMPF.

Montez l’aiguille avec la solution d’injection aqueuse sur un nanoinjecteur piézo-entraîné et injectez 100 à 200 nanolitres de gouttelettes aqueuses dans les puits de la chambre d’incubation de gouttelettes remplie de solution d’huile de silicone hexadécane lipidique à l’aide du nanoinjecteur. Permettre la formation d’une monocouche lipidique à l’interface gouttelette d’huile pendant environ deux heures en maintenant les chambres d’incubation en PMMA et en gouttelettes sur une plaque chauffante chauffée à 35 degrés Celsius. Transférez manuellement les gouttelettes aqueuses individuelles des puits de la chambre d’incubation des gouttelettes dans les puits de la chambre en PMMA à l’aide d’une pipette microlitre à canal unique avec une pointe en polypropylène jetable de 10 microlitres.

Laissez les gouttelettes couler sur les monocouches lipidiques aux interfaces hydrogel-huile pour former une bicouche lipidique entre les gouttelettes et l’hydrogel d’agarose. Montez la chambre en PMMA avec les membranes bicouches ou DIB d’interface gouttelettes sur le porte-échantillon d’un microscope à lumière inversée et évaluez la formation de la membrane à l’aide d’un objectif de contraste de modulation de Hoffman 10x. Si des membranes DIB se sont formées, montez la chambre en PMMA sur le porte-échantillon d’un microscope TIRF équipé d’une source de lumière conventionnelle pour l’éclairage par épifluorescence, d’un laser de 488 nanomètres et d’une caméra CCD multiplicatrice d’électrons rétroéclairée pour atteindre une taille de pixel d’environ 0,16 micromètre.

Focalisez le bord d’une membrane DIB avec un objectif de grossissement 10x sous éclairage par épifluorescence avec une source lumineuse de haute intensité à l’aide d’un jeu de filtres GFP. Focalisez finement le même bord de la membrane DIB à fort grossissement avec un objectif TIRF d’huile apochromatique 100x NA 1.49, encore une fois sous éclairage par épifluorescence avec une source lumineuse de haute intensité à l’aide d’un ensemble de filtres GFP. Modifiez le réglage du filtre GFP par le jeu de filtres TIRF quadribande, allumez le laser 488 nanomètres et réglez l’intensité du laser sur l’objectif de l’objectif.

Pour visualiser des canaux ioniques uniques, réglez l’angle TIRF et le gain de la caméra CCD EM de sorte que les canaux ioniques ouverts dans la membrane DIB apparaissent comme des taches fluorescentes à contraste élevé sur un fond sombre et que le rapport signal / arrière-plan atteigne un maximum. S’assurer que les taches correspondant au flux d’ions calcium à travers des canaux ioniques simples restent nettes et ont une forme ronde avec une intensité élevée au centre et diminuant progressivement vers la périphérie. Vérifiez que les taches fluorescentes sont nettes pour s’assurer que les canaux ioniques se sont reconstitués dans les membranes DIB et se déplacent latéralement dans le plan de la membrane.

Enfin, enregistrez une série d’images membranaires qui permettent un suivi approprié de la position et la surveillance de l’état ouvert-fermé des canaux ioniques individuels. Pour déterminer le type de mobilité latérale et l’état de l’activité des canaux, acquérir des trajectoires suffisamment longues et bien échantillonnées. La structure Cryo EM de Neurospora crassa TOM-CC est montrée ici.

Les mitochondries d’une coloration de N.crassa contenant un TOM 22 avec une étiquette 6-His ont été solubilisées dans DDM et soumises à une chromatographie d’affinité au nickel NTA et à une chromatographie par échange d’anions. Les FDS-PAGE de la structure cristalline TOM-CC isolée et les FDS-PAGE d’E. coli purifié OMPF utilisés pour la comparaison sont présentés ici. La trace d’amplitude fluorescente dans la trajectoire correspondante de TOM-CC indique que l’activité du canal ouvert-fermé de TOM-CC est en corrélation avec la mobilité de la membrane latérale du complexe.

La trace d’amplitude affiche trois états de perméabilité : l’état d’ouverture complète correspondant aux canaux mobiles, l’état de perméabilité intermédiaire et l’état de canal fermé correspondant aux canaux non mobiles. TOM-CC à l’état intermédiaire oscille autour de sa position moyenne d’environ plus / moins 60 nanomètres. La trace d’amplitude fluorescente dans la trajectoire correspondante de l’OMPF est représentée ici.

Le FPMO ne révèle qu’un seul niveau d’intensité par rapport au TOM-CC, qu’il soit en mouvement ou piégé. Les segments de trajectoire correspondant aux périodes de temps des molécules piégées sont marqués en gris. Une chose importante à noter est que cette méthode analyse les protéines à membrane unique dans un environnement membranaire intact.

La dynamique des protéines membranaires restera un horizon pour les études scientifiques dans un avenir prévisible. Nous nous attendons à ce que notre méthode contribue de manière significative à ce domaine.