Name: Édition de base efficace sans PAM pour la modélisation des maladies génétiques humaines chez le poisson zèbre avec zSpRY-ABE8e (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Découvrez l'édition de base adénine-guanine avec zSpRY-ABE8e sans restriction PAM chez Danio rerio. Cette méthode permet de modéliser précisément les maladies génétiques humaines comme l'anémie de Diamond-Blackfan.

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Nous remercions Barbara Garbers, PhD, de Liwen Bianji (Edanz) pour avoir édité le texte anglais d’une ébauche de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par le Programme de recherche et développement dans les domaines clés de la province du Guangdong (2019B030335001), le Programme national de R&D clé de la Chine (2019YFE0106700), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32070819, 31970782) et le Programme de fonds de recherche du laboratoire clé de biologie pathogène et d’épidémiologie des animaux économiques aquatiques de la province du Guangdong (PBEA2020YB05).

Cette étude a été menée dans le strict respect des directives du Comité de soin et d’utilisation de l’Université normale de Chine du Sud.
1. Préparation de l’ARNg synthétiquement modifié et de l’ARNm zSpRY-ABE8e
<ol><li>Concevoir l’ARNg selon les publications précédentes37,38.<ol><li>Sélectionnez de préférence NRN comme séquence PAM, car zSpRY-ABE8e montre une préférence plus élevée pour NRN PAM que NYN PAM (où R est A ou G, et Y est C ou T)18. Assurez-vous que le nucléotide adénine cible se trouve dans la fenêtre d’édition hautement active (troisième à neuvième nucléotide le long du protospacer).</li>
	</ol></li>
	<li>Commandez EasyEdit sgRNA (EE gRNA) modifié avec du 2′-O-méthyl-3′-phosphorothioate (MS) aux deux extrémités (Figure 1). REMARQUE: L’ARNg EE doit être dissous dans de l’eau exempte de RNase et stocké à -80 ° C.</li>
	<li>Linéariser le plasmide zSpRY-ABE8e18.<ol><li>Linéariser 6 μg du plasmide avec l’enzyme XbaI (Table of Materials) dans un bain métallique à 37 °C pendant 3 h.</li>
		<li>Purifier le plasmide linéarisé à l’aide du kit de purification de l’ADN (voir le tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant.</li>
	</ol></li>
	<li>Transcrire l’ARNm à l’aide du kit de transcription in vitro (Table of Materials).<ol><li>Transcrire l’ARNm zSpRY-ABE8e avec le plasmide linéarisé comme matrice selon les instructions du fabricant. REMARQUE: Toutes les opérations impliquant l’ARNm et l’ARNg nécessitent l’utilisation de fournitures de laboratoire sans RNase.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilisez le kit de purification de l’ARN (Tableau des matériaux) pour purifier l’ARNm conformément aux instructions du fabricant. NOTE: Avant élution, l’éthanol doit être séché pour éviter la cytotoxicité, et l’ARNm doit être conservé à -80 ° C s’il n’est pas utilisé immédiatement.</li>
</ol>2. Préparation des capillaires en verre de micro-injection
<ol><li>Installez le système d’extraction de micropipettes et préchauffez pendant au moins 30 minutes.</li>
	<li>Effectuer un essai au rampe pour déterminer le pouvoir calorifique nécessaire pour faire fondre les capillaires en verre borosilicaté (avec un diamètre extérieur de 1 mm et un diamètre intérieur de 0,58 mm) conformément aux instructions du fabricant.</li>
	<li>Sélectionnez un programme et cliquez sur le numéro du clavier pour entrer les valeurs des paramètres. Définissez les paramètres suivants pour tirer les capillaires en verre : chaleur = valeur de test de rampe, traction = 50, vitesse = 100, temps = 50 et pression = 30.</li>
	<li>Installez le tube capillaire en vous assurant qu’il est dans la rainure. Appuyez sur PULL START/STOP pour exécuter le programme.</li>
	<li>Préservez les capillaires tirés en les insérant dans de la mousse contenant des lacunes, en gardant l’aiguille suspendue.</li>
</ol>3. Microinjection du mélange d’ARNm zSpRY-ABE8e et d’ARNg EE dans des embryons de poisson zèbre
<ol><li>Installez des bassins d’élevage la veille de l’injection. Insérez un séparateur, placez deux femelles et un poisson zèbre mâle de souche AB (3-18 mois) dans chaque aquarium et couvrir avec le couvercle. Voir les publications précédentes pour les distinctions entre les sexes39. NOTE: Pour obtenir plus d’embryons, sélectionnez des poissons qui ne se sont pas reproduits depuis au moins 1 semaine.</li>
	<li>Le lendemain matin avant l’injection, décongeler l’ARNm zSpRY-ABE8e et l’ARNg EE sur de la glace. Mélanger l’ARNm et l’ARNg à des concentrations finales de 400 ng/μL et 200 ng/μL, respectivement.<ol><li>Effectuez toute la procédure sur la glace à l’aide d’embouts et de tubes sans RNase, et manipulez avec des gants.</li>
	</ol></li>
	<li>Configurez le microinjecteur pneumatique. Fermez la soupape de pression partielle de la pompe à air et ouvrez d’abord la vanne principale, dévissez la bouteille de gaz et réglez la pression de la soupape de pression partielle à 0,2 MPa/29 psi.<ol><li>Allumez le microinjecteur pneumatique, réglez le mode sur TIMER et réglez la valeur de pression initiale du paramètre à 20,0 psi et la valeur TIMER à 0,040 s.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilisez des pinces fines pour casser soigneusement les aiguilles des capillaires en verre tiré sous un stéréomicroscope, en vous assurant que les aiguilles sont coupées à un angle pour faciliter le perçage du chorion et de l’œuf. REMARQUE: Le point de rupture de l’aiguille doit être au bon endroit et être assez fort pour percer l’œuf mais assez mince pour minimiser les dommages à l’œuf.</li>
	<li>Ajouter le mélange d’ARNm zSpRY-ABE8e et d’ARNg à l’extrémité d’un capillaire en verre à l’aide d’un embout de pipette de microchargeur, en évitant les bulles dans le capillaire. Fixez l’aiguille au micromanipulateur et configurez la pression et la valeur TIMER de l’injecteur pour vous assurer que 2 nL de mélange sont produits par injection à l’aide d’un microcapuchon.</li>
	<li>Débranchez les séparateurs des bassins de reproduction et laissez les poissons se reproduire pendant 10-15 min. Prélevez les œufs à l’aide d’une passoire et examinez le stade cellulaire et la qualité des œufs au stéréomicroscope. Sélectionnez les œufs à l’état unicellulaire pour l’injection afin d’améliorer l’efficacité de l’édition.</li>
	<li>Tapisser les œufs sur une plaque d’injection d’agarose à 1,5% et injecter 2 nL du mélange dans la cellule, et non le jaune, des embryons au microscope pour améliorer l’efficacité de l’édition. Conserver au moins 15 œufs comme groupe témoin.</li>
	<li>Utilisez 1x tampon E3 pour recueillir les œufs dans des boîtes de Petri et placez-les dans un incubateur à 28 °C. Retirez les œufs morts et changez le tampon de culture toutes les 12 heures jusqu’à 48 heures après la fécondation (HPF).</li>
</ol>4. Analyse de l’efficacité de l’édition de base avec EditR
<ol><li>À 48 hpf, prélever trois groupes de six embryons injectés sélectionnés au hasard et six embryons témoins sélectionnés au hasard dans des tubes de PCR respectivement. Utilisez une pipette pour aspirer le tampon E3 résiduel.</li>
	<li>Ajouter 40 μL de NaOH 50 mM dans les tubes PCR. Mettez les tubes dans un bain métallique à 95 °C pendant 20 min, puis vortex pendant 15 s.</li>
	<li>Ajouter 4 μL de 1 M de tris· HCl (pH 8,0) dans chaque tube pour neutraliser le NaOH. Centrifuger brièvement à 2 000 x g pendant 10 s à température ambiante pour éliminer les gouttelettes de la paroi du tube. Recueillir le surnageant dans de nouveaux tubes PCR et les stocker à −20 °C.</li>
	<li>Concevoir des amorces appropriées en amont et en aval des sites cibles de l’ARNg. Utiliser 1 μL du surnageant ci-dessus comme matrice pour les réactions de PCR d’un volume de 50 μL. Les amorces utilisées pour la PCR dans cette étude sont énumérées dans le tableau supplémentaire 1.</li>
	<li>Effectuer une électrophorèse sur gel d’agarose d’ADN pour assurer des bandes correctes et spécifiques, suivie d’un séquençage de Sanger comme décrit précédemment40.</li>
	<li>Analysez les données de séquençage de Sanger avec le programme EditR (1.0.10)41.<ol><li>Téléchargez le fichier de séquençage (format ab1) dans la zone « Télécharger le fichier .ab1 ».</li>
		<li>Entrez la séquence d’ARNg de 20 pb en orientation 5′-3′ dans la case « Entrer la séquence d’ARNg ».</li>
		<li>Ouvrez le fichier de séquençage (format ab1) et confirmez les positions de base où la séquence d’ARNg de 20 pb commence et se termine. Entrez la position de base correspondante dans les cases « 5' start » et « 3' end ».</li>
		<li>Cliquez sur Édition prédite pour obtenir l’efficacité d’édition de base. Vérifiez la qualité des données de séquençage près de la séquence cible de l’ARNg pour éviter les pics désordonnés ou les indels. REMARQUE: En général, les pics désordonnés peuvent être efficacement éliminés en ajustant la température de recuit PCR.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Eichler, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Completing+the+map+of+human+genetic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Completing the map of human genetic variation.</a> Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).</li>
<li>Koukouli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+reverses+hypofrontality+in+animal+models+of+addiction+and+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia.</a> Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).</li>
<li>Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+emerging+model+for+studying+complex+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).</li>
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<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+editing+of+a+target+base+in+genomic+DNA+without+double-stranded+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage.</a> Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).</li>
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<li>Gaudelli, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+adenine+base+editors+with+increased+activity+and+therapeutic+application%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+base+editing+in+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit.</a> Nature Communications. 9, 2717(2018).</li>
<li>Levy, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine+and+adenine+base+editing+of+the+brain%2C+liver%2C+retina%2C+heart+and+skeletal+muscle+of+mice+via+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+mouse+models+of+human+diseases+via+ABE-+and+BE-mediated+base+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing.</a> Nature Communications. 9, 2338(2018).</li>
<li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClinVar%3A+Public+archive+of+interpretations+of+clinically+relevant+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants.</a> Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).</li>
<li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+A%E2%80%A2T+to+G%E2%80%A2C+base+editing+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome.</a> BMC Biology. 16 (1), 139(2018).</li>
<li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+targeted+single-nucleotide+editing+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish.</a> Scientific Reports. 8, 11423(2018).</li>
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<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+base+editing+of+zebrafish+genome+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Communications. 8, 118(2017).</li>
<li>Rosello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+base+editing+for+the+in+vivo+study+of+developmental+signaling+and+human+pathologies+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish.</a> eLife. 10, 65552(2021).</li>
<li>Liang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpG+and+SpRY+variants+expand+the+CRISPR+toolbox+for+genome+editing+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish.</a> Nature Communications. 13, 3421(2022).</li>
<li>Qin, W., Lu, X., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+base+editing+in+zebrafish+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Methods. 150, 19-23 (2018).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+CRISPR%2FCas9+genome+editing+capacity+in+zebrafish+using+SaCas9%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9.</a> G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+zebrafish+by+ScCas9+recognizing+NNG+PAM%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM.</a> Cells. 10 (8), 2099(2021).</li>
<li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+CRISPR-Cas9+nucleases+with+altered+PAM+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities.</a> Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).</li>
<li>Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+CRISPR+toolbox+in+zebrafish+for+studying+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13(2019).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Hu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+Cas9+variants+with+broad+PAM+compatibility+and+high+DNA+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity.</a> Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).</li>
<li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+CRISPR-Cas9+nuclease+with+expanded+targeting+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space.</a> Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).</li>
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<li>Kossack, M. E., Draper, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+sex+determination+and+maintenance+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio).</a> Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).</li>
<li>Crossley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+Sanger+sequencing+and+molecular+assay+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Diagnostic+Investigation%22%5BJournal%5D)">Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).</li>
<li>Kluesner, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EditR%3A+A+method+to+quantify+base+editing+from+Sanger+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing.</a> The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).</li>
<li>Gripp, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diamond-Blackfan+anemia+with+mandibulofacial+dystostosis+is+heterogeneous%2C+including+the+novel+DBA+genes+TSR2+and+RPS28%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics+Part+A%22%5BJournal%5D)">Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Ramakrishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+by+cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+Cas9+protein+and+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA.</a> Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).</li>
<li>Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+human+cells+using+CRISPR%2FCas+nucleases+and+truncated+guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs.</a> Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Ce protocole décrit la construction d’un modèle de maladie du poisson zèbre à l’aide de l’éditeur de base zSpRY-ABE8e. Par rapport à la voie HDR traditionnelle pour la substitution de base, ce protocole peut permettre une édition de base plus efficace et réduire l’apparition d’indels. Dans le même temps, ce protocole implique la mise en œuvre de la stratégie d’élimination du gène i-Silence récemment proposée chez le poisson zèbre. Ensemble, zSpRY-ABE8e améliorera l’application des modèles de poisson zèbre dans la recherc...

Les variantes mononucléotidiques (SNV) qui provoquent des mutations faux-sens ou des mutations absurdes sont la source la plus courante de mutations dans le génome humain1. Pour déterminer si un SNV particulier est pathogène et pour faire la lumière sur sa pathogenèse, des modèles animaux précis sont nécessaires2. Le poisson zèbre est un bon modèle de maladie humaine, présentant un degré élevé d’homologie physiologique et génétique avec les humains, un cycle de développement court et une forte capacité de reproduction, ce qui est avantageux pour la recherche sur les caractéristiques et les mécanismes pathogènes, ainsi que pour le dépistage de médicaments3.
Le système CRISPR (Clustered Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 a été largement appliqué dans l’édition du génome de diverses espèces, y compris le poisson zèbre4. Avec le guidage de l’ARNg, le système CRISPR / Cas9 peut générer des cassures double brin d’ADN (DSB) sur le site cible, ce qui permet ensuite la substitution d’une seule base par recombinaison du site cible avec des modèles d’ADN donneur via la voie de réparation dirigée par homologie (HDR). Cependant, l’efficacité de cette méthode de remplacement de base est assez faible car le processus de réparation de l’ADN cellulaire est principalement effectué par la voie de jonction terminale non homologue (NHEJ), qui s’accompagne généralement de mutations d’insertion et de délétion (indel)5. Heureusement, la technologie d’édition à base unique basée sur CRISPR / Cas9 atténue considérablement ce problème en utilisant des éditeurs de base, qui permettent une édition à base unique plus efficace sans induire de DSB. Deux grandes classes d’éditeurs de base, les éditeurs de base d’adénine (ABE) et les éditeurs de bases de cytosine (CBE), ont été développées pour mettre en œuvre l’édition de substitution de base pour A· T à G· C et C·G à T· A, respectivement 6,7,8,9,10,11. Ces quatre types de substitutions de base couvrent 30 % des variantes pathogènes humaines12. Les deux classes d’éditeurs de base, y compris PmCDA1, le système BE, CBE4max, ABE7.10 et ABE8e, ont été signalées pour travailler chez le poisson zèbre, BE4max et ABE8e étant particulièrement signalés pour atteindre une activité d’édition élevée 13,14,15,16,17,18,19.
Les protéines Cas9 de différentes espèces, y compris Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes et S. canis, ont été mises en œuvre dans l’édition de gènes de poisson zèbre, le Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) étant utilisé le plus largement20,21,22,23. Cependant, SpCas9 ne peut reconnaître que les sites cibles avec un motif adjacent protospacer NGG (PAM), ce qui limite sa portée modifiable et peut entraîner la découverte d’aucune séquence appropriée près du site pathogène d’intérêt24. Pour élargir la plage cible, une variété de variantes SpCas9 ont été conçues pour reconnaître différents PAM grâce à une évolution dirigée et à une conception guidée par la structure. Cependant, peu de variantes sont efficaces chez les animaux, en particulier chez le poisson zèbre, ce qui limite l’application du poisson zèbre dans la recherche sur les maladies liées au SNV25,26,27,28. Récemment, deux variantes de SpCas9, SpG et SpRY, avec des restrictions PAM moins strictes (NGN pour SpG et NNN pour SpRY avec une préférence plus élevée pour NRN que NYN) ont été signalées comme présentant une activité d’édition élevée dans les cellules et les plantes humaines 29,30,31,32. Par la suite, SpG et SpRY, ainsi qu’un certain nombre de leurs éditeurs de base médiés, tels que les CBE médiés par SpRY et les ABE à médiation SpRY, ont également été signalés pour travailler sur le poisson zèbre, ce qui améliorera l’application des modèles de poisson zèbre dans l’étude mécanistique et le dépistage médicamenteux des maladies liées au SNV 18,33,34,35 . En outre, i-Silence a été proposé comme une stratégie efficace et précise d’élimination des gènes par la conversion du codon de départ médiée par ABE d’ATG en GTG ou ACG36. La combinaison de la stratégie i-Silence et de l’éditeur de base médié par SpRY zSpRY-ABE8e fournit une nouvelle méthode de modélisation de la maladie18. Ce protocole montre comment effectuer l’édition de gènes en utilisant zSpRY-ABE8e chez le poisson zèbre pour construire un modèle tsr2 (M1V) en utilisant la stratégie i-Silence. L’efficacité de l’édition et les phénotypes qui apparaissent dans les modèles de poisson zèbre ont été évalués et analysés.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>1,5 % Agarose utilisé pour fabriquer une plaque d’injection</td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté.</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 30-0016</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture cellulaire&nbsp ;</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit</td><td>Vazyme</td><td>C115</td><td>Kit pour clone d’infusion&nbsp ;</td></tr><tr><td>Service d’optimisation des codons</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drummond Microcaps</td><td>Drummond Microcaps</td><td>P1299-1PAK</td><td>Longueur :32 mm, capacité :0.5 &mu ; L</td></tr><tr><td>EasyEdit service d’ARNg</td><td>GenScript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine</td><td>Forceps Fine Scientific Instrument</td><td>11254-20</td><td>Utilisé pour casser le meedle</td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette flamboyant/brun&nbsp ;</td><td>Instrument de bégaiement</td><td>P-97</td><td>Utilisé pour tirer les capillaires en verre</td></tr><tr><td>HotStart Taq PCR StarMix</td><td>Genstar</td><td>A033-101</td><td>Utilisé pour la réaction PCR</td></tr><tr><td>Boîte intelligente pour climat artificiel</td><td>TENLIN</td><td>PRX-1000A</td><td>Utilisé pour la culture d’embryons de poisson-zèbre</td></tr><tr><td>Méthylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td>Utilisé pour fixer le poisson zèbre lors de la photographie</td></tr><tr><td>Microloader pointes de pipette nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>mMACHINE kit&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mut Express II Kit de mutagénèse rapide V2</td><td>Vazyme</td><td>C214-01</td><td>Kit pour mutagénèse dirigée</td></tr><tr><td>Micro-injecteur pneumatique</td><td>ZGene Biotech</td><td>ZGPCP-1500 PLUS</td><td></td></tr><tr><td>pT3TS-zSpCas9</td><td>Addgene</td><td>46757</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy FFPE kit&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>73504</td><td>Kit pour la purification de l’ARN</td></tr><tr><td>Service de séquençage de Sanger</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium, granulaire</td><td>Sangon</td><td>A100173-0500</td><td>NaOH utilisé pour l’extraction du génome</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Olympus&nbsp ;</td><td>SZX10</td><td>Utilisé pour la photographie du phénotype</td></tr><tr><td>Série SZ Zoom Stéréomicroscope</td><td>CNOPTEC</td><td>SZ650</td><td></td></tr><tr><td>T3 mMESSAGE</td><td>Ambion</td><td>AM1348</td><td>Kit pour la transcription in vitro&nbsp ;</td></tr><tr><td>TIANprep Mini Plasmid Kit</td><td>TIANGEN</td><td>DP103-03</td><td>Kit pour l’extraction de plasmides</td></tr><tr><td>TIANquick Mini Purification Kit</td><td>TIANGEN</td><td>DP203-02</td><td>Kit pour la purification du plasmide linéarisé</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Utilisé pour anesthésier le poisson zèbre</td></tr><tr><td>Tris (hydroxyméthyl) aminométhane</td><td>Sangon</td><td>A600194-0500</td><td>Composant de Tris&middot ; HCl utilisé pour l’extraction du génome</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145S</td><td>Endonucléase de restriction utilisée pour la linéarisation plasmidique</td></tr></tbody></table>

Édition de base efficace sans pam pour la modélisation des maladies génétiques humaines chez le poisson zèbre avec zspry-abe8e

Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

La technologie CRISPR / Cas9 a augmenté la valeur du poisson zèbre pour la modélisation des maladies génétiques humaines, l’étude de la pathogenèse des maladies et le dépistage de médicaments, mais les limitations du motif adjacent protospacer (PAM) sont un obstacle majeur à la création de modèles animaux précis de troubles génétiques humains causés par des variantes mononucléotidiques (SNV). Jusqu’à présent, certaines variantes de SpCas9 avec une large compatibilité PAM ont montré leur efficacité chez le poisson zèbre. L’application de l’éditeur optimisé de base adénine médiée par SpRY (ABE), zSpRY-ABE8e et de l’ARNg synthétiquement modifié chez le poisson zèbre a permis une conversion efficace de la base adénine-guanine sans restriction PAM. Décrit ici est un protocole pour l’édition efficace de la base d’adénine sans limitation PAM chez le poisson zèbre en utilisant zSpRY-ABE8e. En injectant un mélange d’ARNm zSpRY-ABE8e et d’ARNg synthétiquement modifié dans des embryons de poisson zèbre, un modèle de maladie du poisson zèbre a été construit avec une mutation précise qui simulait un site pathogène du facteur de maturation du ribosome TSR2 (tsr2). Cette méthode fournit un outil précieux pour l’établissement de modèles de maladie précis pour l’étude des mécanismes et des traitements de la maladie.

Il a été rapporté que la mutation de TSR2 causait l’anémie de Diamond Blackfan (DBA)42. Ici, un modèle de poisson zèbre DBA a été construit avec une mutation tsr2 (M1V) en utilisant la stratégie i-Silence. L’adénine du codon de départ du poisson-zèbre tsr2 a été convertie avec succès en guanine à l’aide de zSpRY-ABE8e (Figure 3).
L’analyse EditR des résultats du séquençage de Sanger a montré qu’il y avait un cheva...

Ce protocole décrit comment effectuer une édition efficace de la base d’adénine sans limitation PAM pour construire un modèle précis de maladie du poisson zèbre en utilisant zSpRY-ABE8e.

Édition de base efficace sans PAM pour la modélisation des maladies génétiques humaines chez le poisson zèbre avec zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...

Ce protocole permet aux chercheurs de construire un certain nombre de modèles de poissons-zèbres auparavant indisponibles de variantes mononucléotidiques pertinentes pour la maladie. Les limitations de PAM sont un obstacle majeur à la création de modèles animaux précis, et zSpRY-ABE8e permet une conversion efficace de l’adénine en base de guanine avec une faible intermutation et une restriction PAN assouplie. Cet outil peut être utilisé pour construire des modèles précis de poisson-zèbre pour étudier les caractéristiques pathogènes des mécanismes pathologiques liés aux marines mononucléotidiques, ainsi que le dépistage de médicaments pour cette maladie.Pour commencer, installez le système d’extraction de micropipettes et préchauffez pendant au moins 30 minutes. Pour tirer les capillaires en verre, sélectionnez un programme, définissez la valeur de test de rampe sur la chaleur, 50 sur la traction, la vitesse sur 100, le temps sur 50 et la pression sur 30. Ensuite, installez le tube capillaire en vous assurant qu’il est dans la rainure.Appuyez sur pull start/stop"pour exécuter le programme. Pour préserver les capillaires tirés, insérez-les dans de la mousse contenant des trous maintenant l’aiguille suspendue. Pour l’expérimentation, utilisez l’ARNm zSpRY-ABE8e décrit dans le manuscrit, et modifiez facilement l’ARNg modifié avec du phosphorothioate de 2'O-méthyle aux deux extrémités.Pour la conception de l’ARNg, sélectionnez de préférence NRN comme séquence PAM, car zSpRY-ABE8e montre une préférence plus élevée pour NRN PAM que NYN PAM. Entrez le nucléotide adénine cible est dans la fenêtre d’édition hautement active du troisième au neuvième nucléotide le long du protospacer. Installez des bassins d’élevage la veille de l’injection.Insérez un séparateur en plaçant deux poissons-zèbres femelles et un poisson zèbre mâle dans chaque réservoir. Placez un couvercle sur chaque réservoir. Le lendemain matin, à l’aide d’embouts, de tubes et de gants sans RNase, mélangez l’ARNm décongelé et l’EEgRNA sur de la glace à une concentration finale de 400 et 200 nanogrammes par microlitre, respectivement.Pour configurer le microinjecteur pneumatique, fermez d’abord la soupape de pression partielle de la pompe à air. Ensuite, ouvrez la vanne principale, dévissez la bouteille de gaz et ajustez la pression de la soupape de pression partielle à 0,2 mégapascal. Maintenant, allumez le micro-injecteur et réglez le mode sur minuterie.Ajustez le paramètre soupape de pression à 20 livres par pouce carré et la valeur de la minuterie à 0,040 seconde. À l’aide de pinces fines, casser angulairement les aiguilles des capillaires en verre tiré sous un stéréomicroscope. À l’aide d’une pointe de pipette de microchargeur, ajoutez le mélange ARNm/ARNg à l’extrémité d’un capillaire en verre et fixez l’aiguille au micromanipulateur.Configurez la pression et la valeur de la minuterie pour produire un mélange de deux nanolitres par injection à l’aide d’un microcapuchon. Après avoir élevé le poisson pendant 10 à 15 minutes, ramassez les œufs dans une passoire. Examinez le stade cellulaire et la qualité des œufs au stéréomicroscope.Sélectionnez des œufs unicellulaires à injecter pour améliorer l’efficacité de l’édition. Alignez les œufs sur une plaque d’injection d’agarose à 1,5% et injectez deux nanolitres du mélange d’ARN dans la cellule des embryons à l’aide d’un microscope. Collectez les œufs dans des boîtes de Petri avec E3 Buffer et incuberez-les à 28 degrés Celsius.Retirez les œufs morts et changez le tampon de culture toutes les 12 heures pendant 48 heures après la fécondation. Après 48 heures après la fécondation, prélever trois groupes de six embryons injectés sélectionnés au hasard dans un tube de PCR. Une fois que six embryons témoins sélectionnés au hasard sont recueillis, utilisez une pipette pour aspirer le tampon E3 résiduel.Ajouter 40 microlitres d’hydroxyde de sodium 50 millimolaires aux embryons. Placez les tubes dans un bain métallique à 95 degrés Celsius pendant 20 minutes, puis vortex pendant 15 secondes. Ajouter quatre microlitres d’une molaire de chlorhydrate de Tris à pH huit dans chaque tube.Centrifuger les tubes à 2000g pendant 10 secondes à température ambiante. Transférer le surnageant dans un nouveau tube PCR. Retirez un microlitre du surnageant du tube PCR et utilisez-le pour le séquençage de Sanger.Conservez ensuite le surnageant restant à 20 degrés Celsius. Pour analyser les données de séquençage de Sanger, commencez par télécharger le fichier de séquençage dans la boîte de téléchargement du fichier ab1. Entrez la séquence d’ARNg de 20 paires de bases dans l’orientation 5' à 3' dans la case de séquence d’entrée"ARNg ».Entrez la position de base correspondante dans les cases 5'start et 3'ends. Obtenez l’efficacité d’édition de base en cliquant sur l’édition prédictive et en vérifiant la qualité des données de séquençage. Un modèle de poisson zèbre anémique noire en diamant a été construit en convertissant l’adénine du codon de départ de Tsr2 en guanine.L’analyse EditR des données de séquence a démontré un chevauchement AG à la base adénine du codon de départ Tsr2. Le phénotype des embryons Tsr2 âgés de deux jours présentait des yeux plus petits que les embryons témoins. Un péricarde gonflé a également été observé dans les embryons mutants.Afin d’obtenir une édition de base efficace, veuillez suivre strictement le principe de conception des lignes directrices mentionné précédemment, qui est une condition préalable au succès de l’expérience. Des modèles précis sont essentiels pour l’étude des maladies liées à des variantes mononucléotidiques. Le développement du SprY-ABE8e fournit un outil efficace pour une modélisation précise, ce qui contribue à promouvoir la recherche sur les mécanismes et les traitements des maladies.

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