Name: Les neurones hypothalamiques de kisspeptine comme cible pour les enregistrements de patch-clamp à cellules entières (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:25:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Apprenez la technique de patch-clamp en cellule entière pour étudier l'activité électrique des neurones hypothalamiques de kisspeptine. Cette méthode permet d'analyser les courants ioniques et de mieux comprendre la régulation neuroendocrine.

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Cette étude a été soutenue par la Fondation de recherche de São Paulo [numéros de subvention FAPESP: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); et par le Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Finance Code 001 » (HRV).

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Institut des sciences biomédicales de l’Université de São Paulo et ont été effectuées conformément aux directives éthiques adoptées par le Collège brésilien d’expérimentation animale.
1. Préparation des solutions
<ol><li>Préparation de la solution interne REMARQUE : La solution interne remplit la micropipette patch-clamp et entrera en contact avec l’intérieur de la cellule (voir un exemple dans la Figure 2). Les solutions internes peuvent varier selon le type d’activité à mesurer33.<ol><li>Choisissez la solution interne en tenant compte de son objectif expérimental et du type d’enregistrement approprié. Pour enregistrer le potentiel membranaire en mode pince de courant, utilisez la solution interne composée de 120 mM de K-gluconate, 1 mM de NaCl, 5 mM d’EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM de MgCl 2, 1 mM de CaCl2, 3 mM de KOH, 10 mM de KCl et 4 mM (Mg)-ATP. Peser tous les sels en fonction du volume final souhaité, comme indiqué au tableau 1.</li>
		<li>Utilisez suffisamment d’eau désionisée pour atteindre 90% du volume final de la solution. Ce volume assurera suffisamment d’espace pour ajuster le pH et l’osmolarité.</li>
		<li>Après avoir bien ajouté et bien mélangé tous les ingrédients, ajustez le pH à 7,2-7,3 avec 5 M KOH à l’aide d’un pH-mètre. Utilisez un osmomètre pour vérifier l’osmolarité, qui devrait être d’environ 275-280 mOsm (ajustez, si nécessaire, vers le bas seulement).</li>
		<li>Préparer la solution interne à l’avance et la conserver à 8 °C. Ajoutez l’ATP le jour de l’expérience. Conserver la solution interne contenant de l’ATP à -20 °C (aliquotes de 1 mL) pendant 3 à 4 mois.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de la solution de tranchage<ol><li>Préparer la solution de tranchage contenant 238 mM de saccharose, 2,5 mM de KCl, 26 mM de NaHCO3, 1,0 mM deNaH2PO4, 10 mM de glucose, 1,0 mM de CaCl2et 5,0 mM de MgCl2. Peser tous les sels selon le volume final souhaité, comme indiqué dans le tableau 2. Le volume exact de cette solution à préparer dépendra de la taille de la chambre de coupe.</li>
		<li>En mélangeant tous les sels dans de l’eau désionisée, saturer constamment en carbogène (95%O2 et 5% CO2). Fixer un tube en polyéthylène (diamètre extérieur [OD] 1,57 mm x 1,14 mm diamètre intérieur [ID]) à un cylindre de carbogène pour fournir du carbogène à la solution de tranchage. Tenez l’extrémité ouverte du tube à l’intérieur du bécher contenant la solution de tranchage.</li>
		<li>Après avoir bien mélangé tous les ingrédients, ajustez le pH à 7,3 avec 10% d’acide nitrique à l’aide d’un pH-mètre. Utilisez un osmomètre pour vérifier l’osmolarité, qui doit être de 290-295 mOsm (ajustez, si nécessaire, vers le bas seulement). Ensuite, refroidissez la solution à 0-2 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer une solution aCSF pour les enregistrements<ol><li>Préparer une solution de liquide céphalorachidien artificiel (aLCR) pour les enregistrements contenant 124 mM de NaCl, 2,8 mM de KCl, 26 mM de NaHCO3, 1,25 mM deNaH2PO4, 1,2 mM de MgSO4, 5 mM de glucose et 2,5 mM de CaCl2. Peser tous les sels selon le volume final souhaité, indiqué au tableau 3.</li>
		<li>En mélangeant tous les sels dans de l’eau désionisée, saturer constamment de carbogène (95%O2 et 5% CO 2), comme décrit à l’étape 1.2.2.</li>
		<li>Après avoir ajouté et mélangé tous les ingrédients, réglez le pH à 7,3 (10% d’acide nitrique peut être utilisé) à l’aide d’un pH-mètre. Utilisez un osmomètre pour vérifier l’osmolarité, qui devrait être de 290 à 300 mOsm. Ensuite, versez l’aCSF dans un bécher et maintenez-le au bain-marie à 30 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Dissection et découpage du cerveau
REMARQUE: Étant donné que différentes structures cérébrales peuvent nécessiter une coupe dans différents plans (tranches coronales, sagittales ou horizontales), l’approche exacte pour obtenir les tranches dépend de la région cérébrale d’intérêt. Typiquement, étudier les cellules exprimant Kiss1 dans les neurones AVPV/PeN et ARH (ici appelés neurones AVPV/PeNKisspeptin et ARHkisspeptine; Figure 2A,B), les tranches de cerveau coronale (200-300 μm) sont généralement faites 17,19,20,21,34. Les neurones AVPV/PeN Kisspeptin sont situés à environ 0,5 à -0,22 mm du bregma, tandis que les neurones ARHkisspeptin sont à -1,22 à -2,70 mm. L’emplacement des noyaux peut être déterminé à l’aide d’un atlas stéréotaxique du cerveau de souris35 ou de l’Atlas de référence du cerveau de souris Allen (http://mouse.brain-map.org/). Des souris adultes Kiss1-Cre/GFP femelles (stade diestrus) et mâles36 ont été utilisées dans cette étude.
<ol><li>Ablation du cerveau<ol><li>Préparez le site de dissection et les outils nécessaires pour extraire le cerveau : ciseaux de décapitation, ciseaux d’iris, ciseaux courbes Castroviejo, ostéotome, pince à épiler, spatule, papier filtre, boîte de Pétri, lame de rasoir et colle cyanoacrylate.</li>
		<li>Avant de faire les tranches, préparez le banc sur lequel la dissection sera effectuée, car toutes les procédures ultérieures doivent être effectuées rapidement. Assurez-vous d’avoir accès à un dispositif de tranchage tel qu’un vibratome.</li>
		<li>Préparez une chambre d’enregistrement pour maintenir les tranches de cerveau avant de trancher le tissu. Acquérir une chambre d’enregistrement, dimensions de bain de 24 mm x 15 mm x 2 mm (L x l x H), auprès d’une marque commerciale (Table of Materials) ou en fabriquer une à l’interne. REMARQUE: Une chambre de récupération interne peut être fabriquée comme suit: couper une plaque de 24 puits afin que neuf puits soient disponibles. Collez un écran en nylon à la base des neuf puits. Avec le reste de la plaque de puits, faites une base de sorte que la partie inférieure du nylon soit libre. Cette base adaptée peut être placée à l’intérieur d’un bécher de 500 mL contenant le LCRa (Figure supplémentaire 1).</li>
		<li>Après avoir tout préparé, anesthésiez l’animal avec un anesthésique inhalé en utilisant 4% à 5% d’isoflurane. L’anesthésie doit être conforme à un protocole approuvé par le comité d’éthique. Peu de temps après l’immobilité de l’animal, effectuez des tests de pincement de la queue et des pattes pour vous assurer que l’animal est anesthésié en profondeur.</li>
		<li>Décapitant rapidement les souris pendant que le cœur est encore actif pour augmenter la viabilité cellulaire. Récoltez le cerveau rapidement après la décapitation.</li>
		<li>Avec des ciseaux chirurgicaux, faites une incision dans la peau au sommet du crâne de l’animal, de la caudale à la rostrale, et retirez le cuir chevelu de la tête de l’animal. Ensuite, coupez la plaque interpariétale le long de la suture sagittale avec les ciseaux d’iris et retirez l’os occipital. Glissez l’ostéotome sous l’os pariétal et retirez-le doucement jusqu’à ce que le cerveau soit exposé.</li>
		<li>Après avoir exposé le cerveau, tournez la tête à l’envers, abaissez doucement le cerveau pour visualiser le nerf trijumeau de chaque côté, puis coupez le nerf trijumeau à l’aide de ciseaux courbés Castroviejo. Après avoir visualisé l’hypothalamus, identifiez le nerf optique et coupez-le doucement. REMARQUE: Soyez prudent lorsque vous coupez le nerf optique, car le tirer déchirera la zone hypothalamique adjacente contenant le noyau AVPV / PeN.</li>
		<li>Coupez la partie la plus antérieure du lobe frontal et retirez complètement le cerveau. Immergez immédiatement le cerveau dans la solution de tranchage jusqu’à l’acquisition des tranches.</li>
	</ol></li>
	<li>Découpage d’échantillons de cerveau<ol><li>Placez la cervelle sur du papier filtre (soutenu sur une boîte de Pétri) pour sécher l’excès de solution. Ensuite, avec une lame de rasoir tranchante, effectuez une coupe coronale séparant le tronc cérébral avec le cervelet du reste du tissu.</li>
		<li>Ensuite, collez la partie caudale du cerveau à la base du vibratome et remplissez la chambre du dispositif de tranchage avec la solution de tranchage/aCSF refroidie à 0-2 °C. Pendant la procédure, placez de la glace sèche autour de la chambre du vibratome pour garder la solution de tranchage froide.</li>
		<li>Insérez la lame de rasoir dans le vibratome et réglez les paramètres de coupe appropriés de l’appareil : vitesse = 3, fréquence = 9 et alimentation = 250 μm. Utiliser une pipette de transfert en acrylique (pipette en verre Pasteur inversé fixée à une tétine en silicone) pour transférer les tranches dans la chambre de récupération (décrite à l’étape 2.1.3) pendant la procédure de tranchage des tissus. Attendez 60 minutes pour la récupération des tissus après l’acquisition de la tranche.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Étanchéité cellulaire pour l’enregistrement
<ol><li>Assurez-vous que toutes les pièces d’équipement (microscope, amplificateur, numériseur, micromanipulateur et autres) sont allumées avant de commencer l’enregistrement.</li>
	<li>Remplissez la chambre d’enregistrement, d’une marque commerciale (Table of Materials), fixée au microscope avec la solution aCSF pour les enregistrements. Utilisez une pompe à perfusion pour perfuser constamment l’aCSF à un débit de 2 mL/min.</li>
	<li>Transférez une tranche de cerveau d’intérêt (une à la fois) dans la chambre d’enregistrement. Utilisez une pipette de transfert en acrylique (pipette en verre Pasteur inversé fixée à une tétine de silicone) pour transférer les tranches hypothalamiques dans la chambre. Utilisez une ancre de tranche (table des matériaux) pour maintenir la tranche afin qu’elle ne bouge pas pendant la perfusion aCSF.</li>
	<li>Placez une tranche au centre de la chambre d’enregistrement fixée au microscope. La position de la tranche est essentielle pour permettre une bonne vue de la région souhaitée au microscope et pour une portée parfaite de la micropipette d’enregistrement.</li>
	<li>Utilisez la lentille d’objectif basse consommation d’un microscope à immersion (10x ou 20x) pour aider à positionner la tranche et à localiser la région d’intérêt.</li>
	<li>Après avoir localisé la région d’intérêt, passez la lentille de l’objectif à la lentille haute puissance (63x) et concentrez-vous sur le niveau tissulaire, en observant la protéine fluorescente endogène et les formes des cellules dans la région cible pour localiser les cellules kisspeptine à la surface de la tranche de cerveau20.</li>
	<li>Lorsqu’une cellule cible possible est localisée, marquez-la sur l’écran de l’ordinateur avec le curseur de la souris ou en dessinant un format, comme un carré, sur la zone d’intérêt. La marque d’écran d’ordinateur aide à guider la position de la micropipette d’enregistrement vers la cellule.</li>
	<li>Après avoir déterminé l’emplacement exact de la cellule cible, soulevez l’objectif et introduisez la micropipette d’enregistrement remplie de la solution interne. Lorsque vous placez la micropipette dans le porte-électrode, assurez-vous que la solution interne est en contact avec l’électrode en argent. REMARQUE: Pour la préparation, le placement et le positionnement de la micropipette sur le porte-électrode, veuillez vous référer àla section 33.</li>
	<li>Appliquer une pression positive avant d’immerger la micropipette dans la solution aCSF, pour empêcher les débris de pénétrer dans la micropipette, à l’aide d’une seringue remplie d’air de 1 à 3 mL reliée au porte-micropipette par un tube en polyéthylène (≈130 cm de plus); appliquer près de 100-200 μL d’air.</li>
	<li>À l’aide du micromanipulateur, guidez la micropipette sous le centre de l’objectif. Déplacez les boutons du micromanipulateur pour guider la micropipette sur l’axe X-Y-Z vers la cellule d’intérêt.</li>
	<li>Ajustez la mise au point pour voir l’extrémité de la micropipette et rapprochez-la de la tranche, mais pas trop. Réduisez la vitesse du micromanipulateur et abaissez lentement la micropipette sur le plan de mise au point. Assurez-vous que l’embout de la micropipette ne pénètre pas brusquement dans la tranche, mais descend lentement jusqu’à ce qu’il touche la surface de la cellule/région cible.</li>
	<li>Appliquez une légère pression positive (≈100 μL) avec la seringue remplie d’air de 1 à 3 mL fixée au porte-micropipette pour éliminer tout débris de la trajectoire d’approche.</li>
	<li>Concentrez-vous sur la cellule cible et déplacez lentement le micromanipulateur sur l’axe X-Y-Z pour rapprocher la micropipette de la cellule cible. En touchant la micropipette à la cellule, on observe une fossette causée par la pression appliquée à travers l’extrémité de la micropipette (Figure 2C).</li>
	<li>Après avoir formé la fossette, en raison de la proximité de la micropipette avec la cellule, appliquer une aspiration faible et brève par la bouche (1-2 s) à travers le tube connecté au support de micropipette pour générer l’étanchéité entre la micropipette et la cellule (joint gigaohm ou gigaseal >1 GΩ; Figure 2D). Pour former le joint, utilisez le mode tension-pince du logiciel. Pour plus de détails sur la formation des phoques, veuillez vous référer àla section 33.</li>
	<li>Si le joint reste stable (le joint gigaohm doit être mécaniquement stable et sans interférence sonore, déterminée par observation pendant environ 1 min), réglez la tension de maintien au potentiel de repos physiologique le plus proche de la cellule d’intérêt. Pour les neurones hypothalamiques kisspeptine, -50 mV est recommandé.</li>
	<li>Appliquer une brève aspiration par la bouche (pression négative) avec la micropipette scellée à la cellule pour briser la membrane plasmique (figure 2E). Une configuration adéquate de la cellule entière est obtenue lorsque l’aspiration est effectuée avec une force suffisante pour que la membrane rompue n’obstrue pas la micropipette et n’attire pas une partie importante de la membrane ou même de la cellule.</li>
	<li>Vérifiez le manuel des paramètres système utilisé. Utilisez le logiciel (voir le tableau des matériaux) pour vérifier et calculer numériquement la résistance série (SR) et la capacité de la cellule entière (wcc).</li>
	<li>En mode tension-clampe, après avoir cassé la membrane cellulaire, activez l’option cellule entière et cliquez sur la commande Auto faisant référence à l’onglet de la cellule entière. La SR et le wcc de la cellule seront automatiquement calculés et affichés instantanément par le logiciel. Ces paramètres peuvent également être vérifiés en effectuant le test membranaire avec l’amplificateur mentionné dans le Tableau des matériaux33.</li>
	<li>Assurez-vous de vérifier les paramètres de viabilité des cellules. Pour les neurones kisspeptine, vérifier que les mesures électrophysiologiques sont : SR < 25 mΩ, résistance d’entrée > 0,3 GΩ et maintien de la valeur absolue actuelle < 30 pA (observations personnelles et référence21). La valeur moyenne du WCC des neurones AVPV/PeNKisspeptin ou ARHkisspeptin est ≈ 10-12 pF chez les souris gonadesintactes 20.</li>
	<li>Surveillez le SR et la capacité stationnaire de la cellule pendant les expériences. Assurez-vous que le SR ne change pas de plus de 20 % pendant un enregistrement et que la capacité de la membrane est stable.</li>
	<li>Vérifiez les paramètres du logiciel. Créez des protocoles spécifiques pour les enregistrements en fonction du type d’expérience. Pour enregistrer le potentiel de membrane en mode de pince de courant, avec l’équipement mentionné dans le tableau des matériaux, filtrer passe-bas les signaux électrophysiologiques à 2-4 kHz et analyser les résultats hors ligne dans un logiciel (voir le tableau des matériaux pour obtenir des informations sur le logiciel).</li>
	<li>Une fois la configuration de la cellule entière correctement réalisée, mesurer les courants synaptiques en mode pince de tension (Figure 2G). Enregistrer les changements dans le potentiel de membrane au repos (RMP) et les variations RMP induites dans le mode de serrage de courant (Figure 2H). Les changements dans la RMP, tels que la dépolarisation de la membrane cellulaire, peuvent être induits par l’administration d’un médicament/neurotransmetteur connu dans le bain (décrit à l’étape 3.2), comme illustré à la figure 1. REMARQUE: En mode de pince de courant, un courant positif ou négatif peut être injecté pour maintenir la tension de la membrane à une tension souhaitée. Pour les neurones kisspeptine, nous définissons généralement une injection de courant nul (I = 0) pour enregistrer la variation spontanée du potentiel membranaire.</li>
</ol>

Aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Le développement de la technique de patch-clamp à cellules entières a eu un impact significatif sur la communauté scientifique, étant considéré comme d’une importance primordiale pour le développement de la recherche scientifique et permettant plusieurs découvertes. Son impact sur la science a été suffisant pour aboutir au prix Nobel de médecine en 1991, car cette découverte a ouvert la porte à une meilleure compréhension du fonctionnement des canaux ioniques dans des conditions physiologiques et pathologiques, ainsi qu’...

Hodgkin et Huxley ont fait le premier enregistrement intracellulaire d’un potentiel d’action décrit dans plusieurs études scientifiques. Cet enregistrement a été réalisé sur l’axone du calmar, qui a un grand diamètre (~500 μm), permettant de placer une microélectrode à l’intérieur de l’axone. Ce travail a fourni de grandes possibilités pour la recherche scientifique, aboutissant plus tard à la création du mode tension-pince, qui a été utilisé pour étudier la base ionique de la génération de potentiel d’action 1,2,3,4,5,6,7,8. Au fil des ans, la technique a été améliorée et elle est devenue largement appliquée dans la recherche scientifique 6,9. L’invention de la technique du patch-clamp, qui a eu lieu à la fin des années 1970 grâce à des études initiées par Erwin Neher et Bert Sakmann, a permis aux chercheurs d’enregistrer des canaux ioniques uniques et des potentiels ou courants de membrane intracellulaire dans pratiquement tous les types de cellules en utilisant une seule électrode 9,10,11,12 . Les enregistrements patch-clamp peuvent être effectués sur une variété de préparations tissulaires, telles que des cellules cultivées ou des tranches de tissus, soit en mode de serrage de tension (maintien de la membrane cellulaire à une tension définie permettant l’enregistrement, par exemple, de courants dépendants de la tension et de courants synaptiques) ou en mode de pince de courant (permettant l’enregistrement, par exemple, des changements dans le potentiel de membrane au repos induits par les courants ioniques, les potentiels d’action et la fréquence du potentiel postsynaptique).
L’utilisation de la technique patch-clamp a rendu possible plusieurs découvertes notables. En effet, les résultats fondamentaux sur les propriétés électrophysiologiques des neurones hypothalamiques kisspeptine situés au niveau des noyaux périventriculaire antéroventrulaire et périventriculaire rostral (AVPV/PeNKisspeptin), également connu sous le nom de zone périventriculaire rostrale du troisième ventricule (RP3V), et le noyau arqué de l’hypothalamus (ARHkisspeptine)13,14,15 présentent un intérêt particulier. En 2010, Ducret et al. ont effectué les premiers enregistrements de neurones AVPV / PeNKisspeptinchez la souris en utilisant un autre outil électrophysiologique, la technique de patch-clamp à cellules lâches. Ces études ont fourni une description électrique des neurones AVPV/PeNKisspeptin et ont démontré que leurs schémas de déclenchement dépendent du cycle œstral16. En 2011, Qiu et al. ont utilisé la technique du patch-clamp à cellules entières pour démontrer que les neurones ARHkisspeptin expriment les courants endogènes du stimulateur cardiaque17. Par la suite, Gottsch et al. ont montré que les neurones kisspeptine présentent une activité spontanée et expriment à la fois des courants calciques de type h (stimulateur cardiaque) et de type T, suggérant que les neurones ARHkisspeptine partagent des propriétés électrophysiologiques avec d’autres neurones cardiaques du système nerveux central18. De plus, il a été démontré que les neurones de lakisspeptine ARH présentent des taux de déclenchement sexuellement dimorphes et que les neurones AVPV/PeNKisspeptin présentent un potentiel de membrane au repos bimodal (RMP) influencé par les canaux potassiques sensibles à l’ATP (KATP)19,20. En outre, il a été établi que les stéroïdes gonadiques affectent positivement l’activité électrique spontanée des neurones kisspeptine chez la souris 19,20,21. Les premiers travaux qui étudient les propriétés électrophysiologiques des neurones kisspeptine sont mentionnés 16,17,18,19,20. Depuis lors, de nombreuses études ont utilisé la technique de patch-clamp à cellules entières pour démontrer quels facteurs/neuromodulateurs sont suffisants pour moduler l’activité électrique des neurones kisspeptine (Figure 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.
Compte tenu de l’importance de cette technique pour l’étude des neurones nécessaires à la reproduction, parmi d’autres types de cellules non abordés ici, cet article décrit les étapes de base pour le développement de la technique de patch-clamp à cellules entières, telles que la préparation des solutions, la dissection et le découpage du cerveau, et l’exécution du sceau de la membrane cellulaire pour les enregistrements. De plus, des questions pertinentes sur la technique sont discutées, telles que ses avantages, ses limites techniques et ses variables importantes qui doivent être contrôlées pour une performance expérimentale optimale.

<table><tbody><tr><td>Composés <forts>pour solutions aCSF, internes et de tranchage</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>O3777</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconate</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 </td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>acide nitrique</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>225711</td><td>ATTENTION</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Table à air</td><td>TMC</td><td>63-534</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Ordinateur</td><td></td> <td>divers-DIGIDATA</td><td></td></tr> <tr><td>1440 SYSTÈME D’ACQUISITION DE DONNÉES À FAIBLE BRUIT</td><td>Molecular Devices</td><td>DD1440</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique numérique</td><td>Ismatec</td><td>ISM833C&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Cage de Faraday</td><td>TMC</td><td>81-333-03</td><td></td></tr><tr><td>Caméra d’imagerie</td><td>Leica</td><td>DFC 365 FX</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Sutter Instruments</td><td>Roe-200</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipettes</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td>DM6000 FS</td><td></td></tr><tr><td>Osteotome</td><td>Bonther equipamentos & Technologie/divers</td><td>128</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de récupération</td><td>Warner Instruments/Appareil Harvard-peut</td><td></td> <td>être fabriqué en interne</td></tr><tr><td>Chambre d’enregistrement</td><td>Warner Instruments</td><td>640277</td><td></td></tr><tr><td>Spatule</td><td>Fisher Scientific /divers</td><td>FISH-14-375-10 ; FISH-21-401-20</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome&nbsp ;</td><td>Bain-marie Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific /divers</td><td>Isotemp</td><td></td></tr><tr><td>Logiciels et systèmes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxoScope 10</td><td>Logiciel Molecular</td> <td>Devices-Commander</td> <td>Logiciel</td></tr><tr><td>LAS X système grand champ</td><td>Leica-Acquisition</td><td></td> <td>et analyse d’images</td></tr><tr><td>MultiClamp 700B</td><td>Molecular Devices</td><td>MULTICLAMP 700B</td><td>Commander Logiciel</td></tr><tr><td>PCLAMP 10 LOGICIEL POUR WINDOWS</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>Pclamp 10 Standard</td><td></td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl électrode, granulé, 1,0 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1309</td><td></td></tr><tr><td>Forcep hémostatique courbée</td> <td>diverse-colle</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>cyanoacrylate</td><td>LOCTITE/divers</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de décapitation</td><td></td> <td>divers-Papier</td><td></td></tr> <tr><td>filtre</td><td></td> <td>divers-Capillaires</td><td></td></tr> <tr><td>en verre (micropipette)</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>TW150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à iris</td><td>Bonther equipamentos & Tecnologia/divers</td><td>65-66</td><td></td></tr><tr><td>Pipette en verre Pasteur&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>CLS7095B9-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td></td> <td>divers-Tube</td><td></td></tr> en <tr><td>polyéthylène&nbsp ;</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0756</td><td></td></tr><tr><td>Lame de rasoir pour dissection cérébrale</td><td>TED PELLA</td><td>TEDP-121-1</td><td></td></tr><tr><td>Lame de rasoir pour vibratome</td><td>TED PELLA</td><td>TEDP-121-9</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Bonther equipamentos & Tecnologia/divers</td><td>71-72, 48,49 ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>tétine en silicone</td><td>divers-Slice</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Anchor&nbsp ;</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0246</td><td></td></tr><tr><td>Filtres pour seringues</td><td>Merck Millipore Ltda</td><td>SLGVR13SL</td><td>Millex-GV 0.22 &mu ; m</td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td>Bonther equipamentos & Tecnologia/divers</td><td>131, 1518</td><td></td></tr></tbody></table>

les neurones hypothalamiques de kisspeptine comme cible pour les enregistrements de patch-clamp à cellules entières

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

Les kisspeptines sont essentielles à la maturation de l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique (HPG) et à la fertilité. Les neurones hypothalamiques kisspeptine situés dans le noyau périventriculaire antéroventral et le noyau périventriculaire rostral, ainsi que le noyau arqué de l’hypothalamus, projettent les neurones de l’hormone de libération des gonadotrophines (GnRH), entre autres cellules. Des études antérieures ont démontré que la signalisation de la kisspeptine se produit par le récepteur Kiss1 (Kiss1r), ce qui stimule finalement l’activité neuronale de la GnRH. Chez l’homme et les modèles animaux expérimentaux, les kisspeptines sont suffisantes pour induire la sécrétion de GnRH et, par conséquent, la libération d’hormone lutéinisante (LH) et d’hormone folliculostimulante (FSH). Puisque les kisspeptines jouent un rôle essentiel dans les fonctions de reproduction, les chercheurs travaillent à évaluer comment l’activité intrinsèque des neurones hypothalamiques kisspeptine contribue aux actions liées à la reproduction et à identifier les neurotransmetteurs/neuromodulateurs primaires capables de modifier ces propriétés. La technique de patch-clamp à cellules entières est devenue un outil précieux pour étudier l’activité des neurones kisspeptine dans les cellules de rongeurs. Cette technique expérimentale permet aux chercheurs d’enregistrer et de mesurer les courants ioniques excitateurs et inhibiteurs spontanés, le potentiel de membrane au repos, le potentiel d’action et d’autres propriétés électrophysiologiques des membranes cellulaires. Dans la présente étude, des aspects cruciaux de la technique de patch-clamp à cellules entières, connus sous le nom de mesures électrophysiologiques qui définissent les neurones hypothalamiques de la kisspeptine, et une discussion des questions pertinentes concernant la technique, sont examinés.

Pour étudier les effets possibles de l’hormone de croissance recombinante humaine (hGH) sur l’activité des neurones hypothalamiques kisspeptine, nous avons effectué des enregistrements de patch-clamp à cellules entières dans des tranches de cerveau et évalué si cette hormone provoque des changements aigus dans l’activité des neurones AVPV / PeNKisspeptin et ARHkisspeptin. Des souris adultes Kiss1-Cre/GFP femelles (stade diestrus) et mâles36 ont été utilisées dans cette étude....

Ici, nous présentons un protocole pour effectuer une pince de patch à cellules entières sur des tranches de cerveau contenant des neurones kisspeptine, le principal modulateur des cellules de l’hormone de libération des gonadotrophines (GnRH). En ajoutant des connaissances sur l’activité des neurones kisspeptine, cet outil électrophysiologique a servi de base à des progrès significatifs dans le domaine de la neuroendocrinologie au cours des 20 dernières années.

Les neurones hypothalamiques de kisspeptine comme cible pour les enregistrements de patch-clamp à cellules entières

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...

En mesurant les propriétés électrophysiologiques des membranes cellulaires, la question du principal prouve que moduler l’activité électrique d’une cellule peut être résolu. L’enregistrement de patch clamp à cellules entières est une technique périphérique pour étudier les courants ioniques dans des cellules individuelles et interroger la réponse cellulaire à différents stimuli. La meilleure performance sur les pré-enregistrements de patch clamp à cellules entières sera obtenue après avoir beaucoup pratiqué et étudié.Pour commencer la dissection cérébrale, faites une incision à l’aide de ciseaux chirurgicaux dans la peau au sommet du crâne de l’animal décapité de la caudale au rostral et retirez le cuir chevelu. Ensuite, coupez la plaque interpariétale le long de la suture sagittale avec les ciseaux d’iris et retirez l’os occipital. Glissez l’ostéotome sous l’os pariétal et retirez-le doucement jusqu’à ce que le cerveau soit exposé.Après avoir exposé le cerveau, tournez la tête à l’envers. Abaissez doucement le cerveau pour visualiser le nerf trijumeau de chaque côté. Ensuite, coupez le nerf trijumeau à l’aide de ciseaux courbes Castroviejo.Après avoir visualisé l’hypothalamus, identifiez le nerf optique et coupez-le doucement. Ensuite, coupez la partie antérieure éloignée du lobe frontal. Retirez le cerveau et immergez-le immédiatement dans la solution de tranchage jusqu’à l’acquisition des tranches.Pour trancher les échantillons de cerveau, placez le cerveau sur un papier filtre pour sécher l’excès de solution. Ensuite, avec une lame de rasoir tranchante, effectuez une coupe coronale séparant le tronc cérébral avec le cervelet du reste du tissu. Ensuite, collez la partie caudle du cerveau à la base d’un vibratome et remplissez la chambre du dispositif de tranchage avec la solution de tranchage ou la solution aCSF refroidie à zéro à deux degrés Celsius.Placez de la glace sèche autour de la chambre du vibratome pour garder la solution de tranchage froide pendant la procédure. Insérez la lame de rasoir dans le vibratome et réglez les paramètres de coupe de l’appareil, tels que la vitesse à trois, la fréquence à neuf et l’alimentation à 250 micromètres. Pendant la procédure de tranchage des tissus, transférer les tranches à l’aide d’une pipette de transfert en acrylique dans la chambre de récupération et attendre 60 minutes pour la récupération des tissus après l’acquisition de la tranche.Avant de commencer le scellage et l’enregistrement des cellules, allumez le microscope, l’amplificateur, le numériseur et le micromanipulateur. Construisez la chambre d’enregistrement fixée au microscope avec la solution aCSF. Utilisez une pompe de perfusion pour perfuser constamment l’aCSF à deux millilitres par minute.Vérifiez les paramètres du logiciel et créez des protocoles spécifiques pour les enregistrements en fonction du type d’expérience. Transférez une tranche de cerveau d’intérêt une à la fois dans la chambre d’enregistrement à l’aide d’une pipette de transfert en acrylique. Tenez la tranche avec une ancre de tranche afin qu’elle ne bouge pas pendant la perfusion aCSF.Positionnez la tranche au centre de la chambre d’enregistrement à l’aide de la lentille d’objectif basse consommation du microscope à immersion, 10X ou 20X. La position de la tranche est essentielle pour permettre une bonne vue de la région souhaitée au microscope et pour une portée parfaite de la micropipette d’enregistrement. Après avoir localisé la région d’intérêt, passez la lentille de l’objectif à la lentille haute puissance, 63X et concentrez-vous sur le niveau tissulaire en observant la protéine fluorescente endogène et les formes des cellules dans la région cible pour localiser les cellules de la kisspeptine à la surface de la tranche de cerveau.Lorsqu’une cellule cible possible est localisée, marquez-la sur l’écran de l’ordinateur avec le curseur de la souris ou en dessinant un format comme un carré sur la zone d’intérêt. La marque d’écran de l’ordinateur aide à guider la position de la pipette d’enregistrement vers la cellule. Après avoir déterminé l’emplacement exact de la cellule cible, soulevez l’objectif et introduisez la micropipette d’enregistrement remplie de la solution interne dans le porte-électrode en s’assurant que la solution interne est en contact avec l’électrode d’argent.Appliquez une pression positive avant de plonger la micropipette dans la solution aCSF à l’aide d’une seringue remplie d’air d’un à trois millilitres reliée au porte-micropipette par un tube en polyéthylène pour empêcher les débris de pénétrer dans la micropipette. À l’aide du micromanipulateur, guidez la micropipette sous le centre de l’objectif. Déplacez les boutons du micromanipulateur pour guider l’axe XYZ de la micropipette vers la cellule d’intérêt.Ajustez la mise au point pour voir la pointe de la micropipette et rapprochez la mise au point, mais pas trop près de la tranche. Réduisez la vitesse du micromanipulateur et abaissez lentement la micropipette jusqu’à la plaine de mise au point, en veillant à ce que la pointe de la micropipette ne pénètre pas brusquement dans la tranche, mais descende lentement jusqu’à ce qu’elle touche la surface de la cellule ou la région cible. Appliquer une légère pression positive avec une seringue remplie d’air d’un à trois millilitres pour éliminer tous les débris de la trajectoire d’approche.Déplacez lentement le micromanipulateur sur l’axe XYZ pour rapprocher l’embout de la micropipette et toucher la cellule cible qui provoque une fossette par la pression appliquée. Après avoir établi la fossette à l’aide du mode de serrage de tension sur le logiciel, appliquez une faible aspiration brève par la bouche pendant une à deux secondes à travers le tube connecté au support de micropipette pour générer l’étanchéité entre la micropipette et la cellule. Si le joint reste mécaniquement stable sans interférence sonore pendant environ une minute, réglez la tension de maintien au potentiel de repos physiologique le plus proche de la cellule d’intérêt.Pour les neurones hypothalamiques kisspeptine moins 50 millivolts est recommandé. Ensuite, appliquez une brève aspiration par la bouche pour briser la membrane plasmique à l’extrémité de la micropipette scellée placée sur la cellule afin que la membrane rompue n’obstrue pas la micropipette ou n’attire pas une partie importante de la membrane ou la cellule. Une configuration adéquate de la cellule entière peut être obtenue en effectuant une aspiration avec une force suffisante.Vérifiez le manuel des paramètres système utilisé. Après avoir cassé la membrane cellulaire, activez l’option cellule entière en mode de serrage de tension et cliquez sur la commande automatique faisant référence à l’onglet de la cellule entière. La résistance série de la cellule et la capacité de la cellule entière sont automatiquement calculées et affichées instantanément par le logiciel.Ensuite, vérifiez les paramètres de viabilité de la cellule dans le logiciel comme décrit dans le manuscrit texte. Surveillez la résistance en série et la capacité stationnaire de la cellule pendant les expériences. Une fois que la configuration de la cellule entière est correctement réalisée, mesurez les courants synaptiques en mode de pince de tension.Enregistrer les changements dans le potentiel de membrane au repos et les variations induites du potentiel de membrane au repos dans le mode de serrage actuel. Les effets possibles de l’hormone de croissance recombinante humaine sur l’activité des neurones hypothalamiques kisspeptine ont été étudiés à l’aide d’enregistrements de patch clamp à cellules entières. L’administration de l’hormone de croissance recombinante humaine, HGH à 20 microgrammes par gramme a induit une hyperpolarisation significative du potentiel de la membrane au repos dans 5 des 12 neurones de kisspeptine AVPV / PeN et 9 des 14 neurones ARH kisspeptin enregistrés.Les neurones hyperpolarisés AVPV/PeN kisspeptin et ARH kisspeptin ont significativement modifié le potentiel de la membrane au repos par rapport aux cellules qui ne répondent pas. Les effets sur le potentiel membranaire au repos pendant l’application de HGH ont suivi une réduction significative de la résistance à l’entrée de la cellule entière d’environ 0,9 à 0,7 gigaohms sur les neurones de la kisspeptine AVPV / PeN et de 1,7 à 1,0 gigaohms sur les neurones de la kisspeptine ARH. Au cours des lignes cérébrales parfaites effectuées via un gigaseal minutieux et la zone de la cellule via la plage, les paramètres sont nécessaires pour obtenir les meilleurs enregistrements de cellules entières.La solution de micropipette de la cellule enregistrée peut être collectée et utilisée pour la RTPCR unicellulaire permettant la caractérisation moléculaire d’une cellule isolée. La technique de pince patch à cellules entières combinée à l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés représente une percée dans la compréhension de la reproduction permettant la définition des neurones kisspeptine aux propriétés accrues, et ils sont des modulateurs majeurs.

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Ce protocole décrit une technique appelée électrophysiologie par patch clamp à cellules entières, qui est une méthode pour étudier les propriétés électriques des neurones de Mauthner et d’autres cellules réticulospinales dans les embryons de poisson-zèbre.

Électrophysiologie par patch clamp de cellules entières : une méthode pour étudier les propriétés électriques des neurones

La vidéo présente une méthode pour étudier l’excitabilité des cellules neuronales exprimant une protéine fluorescente à l’aide d’une pince de courant de patch de cellule entière. Dans le mode de pince de courant, des potentiels d’action indiquant l’excitabilité neuronale sont générés.

Étude de l’excitabilité des neurones fluorescents à l’aide d’une pince à patch de cellules entières

La vidéo présente un protocole pour étudier les interactions synaptiques et les réponses neuronales dans une tranche de cerveau d’hippocampe de souris transfectée. Il s’agit d’éclairer des neurones sensoriels à longue portée pour déclencher des potentiels d’action et d’enregistrer les potentiels post-synaptiques excitateurs qui en résultent dans le neurone enregistré à l’aide de la technique du patch-clamp à cellules entières.

photostimulation et enregistrements de neurones dans des tranches d’hippocampe de souris

Cette vidéo démontre l’utilisation de la technique du patch-clamp de cellules entières pour mesurer les réponses dans les neurones de kisspeptine à partir de tranches hypothalamiques de souris transfectées. Le processus consiste à obtenir une configuration de cellule entière et à enregistrer les changements de potentiel membranaire induits par l’hormone de test à l’aide du mode de pince de courant.

Détermination d’un test d’effet de l’hormone de croissance sur les neurones de la kisspeptine à l’aide d’un patch clamp à cellules entières

Cette vidéo montre la procédure d’exécution d’enregistrements électrophysiologiques dans les neurones de la substance gélatinosa (SG) de coupes de moelle épinière, en utilisant des techniques de patch-clamp de cellules entières pour analyser les modèles de décharge des neurones. Cette méthode permet d’étudier les réponses neuronales aux stimuli dans les neurones SG de la moelle épinière.

Enregistrement par patch clamp de cellules entières dans un neurone de la substance gélatinosa d’une coupe de moelle épinière

La vidéo du protocole décrit la mise en place d’un patch clamp de cellule entière pour l’enregistrement électrophysiologique des neurones sensoriels de l’organe voméronasal (VNO) chez la souris. Une tranche coronale de VNO avec des neurones sensoriels marqués par fluorescence est placée dans une configuration d’enregistrement. Un neurone marqué est patché à l’aide d’une pipette d’enregistrement dans une configuration de cellule entière pour l’enregistrement électrophysiologique en réponse à des...

Mise en place d’une pince de patch de cellule entière pour l’enregistrement électrophysiologique à partir de neurones sensoriels voméronasaux

Réseaux corticaux sont contrôlés par un petit, mais diversifié ensemble des interneurones inhibiteurs. Exploration fonctionnelle des interneurones nécessite donc l'enregistrement ciblée et identification rigoureuse. Décrit ici est une approche combinée impliquant des enregistrements de cellules entières de paires simples ou synapses de neurones couplés avec marquage intracellulaire, post-hoc morphologique et l'analyse immunocytochimique.

De cellules entières de patch-clamp enregistrements de Morphologically- et interneurones hippocampiques neurochemically identifiés

Ce protocole décrit les étapes de procédure de base pour effectuer des cellules entières enregistrements de patch-clamp. Cette technique permet l'étude du comportement électrique des neurones, et lorsqu'elle est effectuée dans des tranches de cerveau, permet d'évaluer les différentes fonctions de neurones à partir de neurones qui sont encore intégrés dans des circuits du cerveau relativement bien conservées.

Recordings cellules entières Patch-clamp en tranches cérébrales

Nous présentons ici un protocole permettant d’évaluer la multiplicité synaptique fonctionnelle à l’aide d’électrophysiologie de germes entiers patch clamp en tranches cérébrale aiguë.

Évaluation de la multiplicité synaptique à l’aide de Patch-clamp de la cellule entière électrophysiologie

Nous décrivons ici une procédure pour générer adaptés à l'obscurité des tranches de la rétine de souris pour les enregistrements électrophysiologiques.

Enregistrements Patch Clamp à partir de neurones rétiniens souris dans une préparation adaptés à l&#39;obscurité Slice

Apprenez la technique de patch-clamp en cellule entière pour étudier l'activité électrique des neurones hypothalamiques de kisspeptine. Cette méthode permet d'analyser les courants ioniques et de mieux comprendre la régulation neuroendocrine.

Les neurones hypothalamiques de kisspeptine comme cible pour les enregistrements de patch-clamp à cellules entières

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