Name: Transfection évolutive de protoplastes mésophylles de maïs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T12:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Découvrez une méthode de transfection à haut débit de protoplastes de mésophylle de maïs utilisant le PEG. Ce protocole permet de transformer plus de 3 millions de cellules avec une efficacité de 20 à 50 %.

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Ce travail a été soutenu par le National Human Genome Research Institute Interdisciplinary Training in Genomic Sciences (T32 training grant no. HG000035 to J.T.) et le National Institute of Health (NIGMS 1R35GM139532 to C.Q.) et par la National Science Foundation (RESEARCH-PGR IOS-1748843 et PlantSynBio 2240888 to CQ). Nous remercions Andrea Gallovatti de l’Université Rutgers pour le don des semences de maïs.

1. Croissance du matériel végétal
<ol><li>Rincer deux fois les grains de maïs avec de l’eau du robinet. Faire tremper les grains dans l’eau du robinet pendant la nuit à température ambiante.</li>
	<li>Le lendemain, remplissez un bac de démarrage de 72 cellules avec de la vermiculite:tourbe mouillée 1:1. Rincez les grains une fois et plantez-les bout du capuchon, un noyau par cellule.</li>
	<li>Cultiver dans des conditions de longue journée (16 h de lumière, 8 h d’obscurité) à 25 °C pendant 3 jours.</li>
	<li>Transférer dans l’obscurité constante à 25 ° C et croître pendant 9-11 jours.</li>
</ol>2. Isolement plasmidique
<ol><li>Transformer la bactérie E. coli commerciale compétente en matière chimique avec le ou les plasmides d’intérêt conformément aux instructions du fabricant.</li>
	<li>Cultiver E. coli transformé dans 50 mL de milieu LB liquide avec les antibiotiques appropriés pendant la nuit à 37 °C en agitant.</li>
	<li>Enduire E. coli par centrifugation pendant 10 min à 3 000 x g à température ambiante. Extraire les plasmides à l’aide d’un kit d’isolation de l’ADN plasmidimidique disponible dans le commerce.</li>
	<li>Estimer la concentration d’ADN plasmidique à l’aide d’un spectrophotomètre de microvolume. NOTA : Le matériel convenant à la transfection doit avoir une concentration de ≥ 800 ng/μL et une concentration A260/A280 de ≥1,8.</li>
</ol>3. Isolation du protoplaste
<ol><li>Préparer 20 mL de solution enzymatique.<ol><li>Ajouter 2,18 g de mannitol, 0,30 g de cellulase R-10 et 0,06 g de macérozyme R-10 dans un tube à centrifuger de 50 mL. Retourner pour mélanger les poudres. AjouterH2Odésionisé à 15 mL. Ajouter 200 μL de 1 M MES, pH 5,7. Vortex à mélanger.</li>
		<li>Chauffer la solution à 55 °C pendant 10 min. Laisser refroidir à température ambiante pendant 10 min.</li>
		<li>Ajouter 20 μL de 1 M CaCl2,0,02 g d’albumine sérique bovine et 100 μL de 1 M β-mercaptoéthanol.</li>
		<li>Remplir à 20 ml de H2O désionisé. Verser dans un bécher de 250 ml enveloppé de papier d’aluminium.</li>
	</ol></li>
	<li>Sortez les plants de maïs de l’obscurité. Coupez-les à quelques centimètres au-dessus du sol à l’aide d’une nouvelle lame de rasoir. Placez les extrémités coupées dans l’eau. Conservez-les dans l’obscurité à température ambiante lorsqu’ils ne sont pas utilisés.</li>
	<li>Sélectionnez les deuxième et troisième feuilles de chaque plantule, en prenant soin d’exclure les feuilles avec des zones brunes ou endommagées. Sélectionnez 12-16 feuilles. Couper ~1 cm de l’extrémité de chaque feuille et jeter. Ensuite, coupez une section de 10 cm de chaque feuille. REMARQUE : Si vous avez besoin de plus de tissu, utilisez un volume supplémentaire de 20 mL de solution enzymatique dans un bécher supplémentaire de 250 mL. Trop de matière foliaire dans une quantité donnée de solution enzymatique peut diminuer la viabilité.</li>
	<li>Empilez les sections de feuilles les unes sur les autres avec les extrémités basales ensemble. Serrez le faisceau ensemble à l’extrémité basale à l’aide d’un clip de liant. Placez le paquet de feuilles sur un morceau de papier blanc.</li>
	<li>Saisissez les feuilles ~1 cm de l’extrémité distale. À l’aide d’une nouvelle lame de rasoir, couper les feuilles de l’extrémité distale perpendiculairement aux nervures en fines tranches (0,5-1 mm). Évitez de couper droit, mais faites plutôt de courtes tranches vers l’avant à travers le tissu.<ol><li>Remplacez les lames de rasoir chaque fois que des résidus visibles commencent à se déposer sur le papier. Un résidu visible indique un écrasement du tissu dû à une lame émoussée ou à une mauvaise technique.</li>
	</ol></li>
	<li>Après avoir coupé ~ 2 cm de la longueur du faisceau de feuilles, transférer rapidement les tranches dans le bécher de la solution enzymatique. Ne laissez pas le matériau sécher, car cela réduirait le nombre de protoplastes obtenus. Remuez doucement la solution enzymatique pour mouiller le matériau.<ol><li>Placez un couvercle en aluminium sur le bécher pour bloquer la lumière. Répétez le processus de tranchage et de transfert jusqu’à ce que tout le paquet soit coupé près du clip de liant.</li>
	</ol></li>
	<li>Transférer le bécher de solution enzymatique dans un clocher. Infiltration sous vide entre −50,8 kPa et −67,7 kPa par rapport à la pression ambiante pendant 3 min à température ambiante.</li>
	<li>Transférer le bécher dans un shaker de table. Agiter à 40 tr/min pendant 2,5 h à température ambiante. Faites tourner doucement le bécher à la main. Lorsqu’elle est complètement digérée, la solution enzymatique apparaîtra légèrement laiteuse. Si la solution est toujours claire, continuez à agiter à 40 tr/min pendant une heure supplémentaire. Ne pas dépasser 3,5 h.</li>
	<li>Pendant la digestion, préparer une solution de mannitol + MES + MgCl2 (MMG), une solution de polyéthylène glycol (PEG) et une solution d’incubation.<ol><li>MMG : Ajouter 5,47 g de mannitol, 200 μL de 1 M MES, pH 5,7 et 750 μL de 1 M MgCl2 dans un tube à centrifuger de 50 mL. Remplir à 50 mL avec le VortexH2O. distillé à dissoudre. Placer sur la glace.</li>
		<li>Solution d’incubation : Ajouter 5,47 g de mannitol, 200 μL de 1 M MES à pH 5,7 et 200 μL de 1 M KCl dans un tube à centrifuger de 50 mL. Remplir à 50 mL avec le VortexH2O. distillé à dissoudre. Placer sur la glace.</li>
		<li>Solution de PEG : Ajouter 0,44 g de mannitol, 1,0 g de PEG et 400 μL de CaCl21 M à un tube à centrifuger de 15 mL. Remplir à 4 mL avec le VortexH2O. distillé à mélanger. Incuber à 37 °C en agitant pendant 30 min jusqu’à dissolution complète. Conserver à température ambiante.</li>
	</ol></li>
	<li>Agiter la solution enzymatique à 80 RPM pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Placez le bécher avec la solution enzymatique sur de la glace. Ne retirez pas le revêtement en aluminium. Ajouter 20 mL de MMG glacé à la solution enzymatique. Filtrer à travers une crépine cellulaire de 40 μm dans un tube à centrifuger de 50 mL. REMARQUE: Conservez toutes les solutions sur la glace pour les étapes suivantes jusqu’à l’ajout du PEG. Gardez les protoplastes recouverts de papier d’aluminium pour minimiser l’exposition à la lumière.</li>
	<li>Diviser le filtrat en volumes égaux de 10 mL chacun. Verser chaque volume dans un tube à centrifuger en verre à fond rond et faire tourner vers le bas pendant 4 min à 100 x g à température ambiante.</li>
	<li>Jeter le surnageant et ajouter 1 mL de MMG glacé dans chaque tube. Remettez les granulés en remuant doucement et en tapotant les tubes. Combinez les échantillons dans un seul tube à centrifuger en verre à fond rond. Ajouter MMG à un volume total de 5 mL. Faire tourner vers le bas pendant 3 min à 100 x g à température ambiante.</li>
	<li>Laver avec 5 mL de MMG et faire tourner vers le bas pendant 3 minutes à 100 x g à température ambiante.</li>
	<li>Répéter le lavage avec 5 ml de MMG et faire tourner vers le bas pendant 3 minutes à 100 x g à température ambiante. Après avoir fait tourner le deuxième lavage, observez si le surnageant est clair. S’il reste nuageux, effectuez un troisième lavage.</li>
	<li>Remettez les protoplastes en suspension dans 1 mL de MMG. Couvrir lâchement avec du papier d’aluminium et garder sur la glace.</li>
	<li>Déterminez le rendement en protoplastes et vérifiez la viabilité.<ol><li>Dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL, additionner 4 μL de protoplastes et 72 μL de MMG.</li>
		<li>Dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL, ajouter 1 μL de solution mère de diacétate de fluorescéine (FDA) à 0,5 % à 49 μL de MMG pour obtenir une solution de travail 20x. Ajouter 4 μL de solution de travail FDA dans le tube avec les protoplastes dilués. Incuber pendant 5 min dans l’obscurité à température ambiante.</li>
		<li>Charger 11 μL du mélange de protoplastes sur un hémocytomètre. Placer sous un microscope à lumière claire. Confirmer visuellement que les cellules manquent de parois cellulaires. Ensuite, comptez le nombre de protoplastes. Utilisez ce dénombrement pour estimer le nombre total de protoplastes obtenus. Ensuite, comptez le nombre de protoplastes qui deviennent verts fluorescents sous la lumière UV lorsqu’ils sont colorés avec la FDA. Les isolages de protoplastes réussis offrent une viabilité de 70 % à 90 %.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Transfection médiée par PEG
<ol><li>En commençant par la concentration estimée de protoplastes à partir de l’étape 3.17, ajuster à ~10 000 protoplastes/μL. Si la concentration est faible, centrifuger pendant 3 min à 100 x g et remettre en suspension dans MMG à une concentration de ~10 000 protoplastes/μL.</li>
	<li>Mélanger ~1 000 000 de protoplastes avec 15 μg d’ADN dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Compléter le mélange avec MMG à 114,4 μL et incuber sur de la glace pendant 30 minutes.</li>
	<li>Remettez les protoplastes en suspension en tapotant le côté du tube. Ajouter 105,6 μL de solution de PEG à 25% aux protoplastes pour atteindre un poids/volume final de 12% de PEG. Mélanger doucement en retournant 5-10 fois. Les protoplastes dans la solution PEG sont fragiles; Ne secouez pas le tube. Incuber pendant 10 min dans l’obscurité à température ambiante. REMARQUE : La transfection peut être mise à l’échelle en multiples des volumes indiqués aux étapes 4.2 et 4.3. Par exemple, 10 millions de protoplastes et 150 μg d’ADN peuvent être suspendus dans 1 444 μL de MMG et traités avec une solution de PEG de 1 056 μL dans un tube à centrifuger de 50 mL.</li>
	<li>Diluer avec 5 volumes de solution d’incubation. Mélanger doucement par inversion. Faire tourner vers le bas pendant 4 min à 100 x g à température ambiante. REMARQUE : En cas de mise à l’échelle, divisez les protoplastes en plusieurs tubes de verre à fond rond ne contenant pas plus de 10 mL chacun pour assurer une granulation complète. Augmentez proportionnellement le volume de la solution d’incubation utilisée pour le lavage.</li>
	<li>Retirer le surnageant par pipetage. Laver avec 1 à 5 mL de solution d’incubation et faire tourner vers le bas pendant 3 minutes à 100 x g à température ambiante.</li>
	<li>Resuspendre les protoplastes dans la solution d’incubation à une concentration de 500 à 1 000 cellules/μL.</li>
	<li>Incuber les protoplastes dans l’obscurité pendant une nuit (~16 h) à température ambiante.</li>
</ol>5. Récupération Protoplast et vérification de l’expression
<ol><li>Faire tourner les protoplastes pendant 4 min à 100 x g à température ambiante. REMARQUE : En cas de mise à l’échelle, divisez les protoplastes en plusieurs tubes de verre à fond rond ne contenant pas plus de 10 mL chacun.</li>
	<li>Laver avec 1 à 5 mL de solution d’incubation et faire tourner vers le bas pendant 3 minutes à 100 x g à température ambiante.</li>
	<li>Resuspendre et combiner dans 1 à 5 mL de solution d’incubation.</li>
	<li>Si les protoplastes sont transfectés avec un gène rapporteur fluorescent (p. ex., GFP), prendre une partie aliquote pour vérifier l’efficacité de la transfection. À l’aide d’un hémocytomètre, comptez d’abord le nombre total de protoplastes à l’aide de la microscopie à fond clair. Ensuite, comptez la fraction de protoplastes fluorescents sous lumière UV.</li>
	<li>Centrifuger les protoplastes pendant 3 min à 100 x g à température ambiante. NOTE: Les protoplastes sont maintenant prêts pour des applications en aval telles que l’extraction d’ARN avec du phénol et de l’isothiocyanate de guanidine.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Comme indiqué précédemment, la qualité du matériel végétal utilisé pour la protoplastivité est essentielle pour obtenir des protoplastes de haute qualité16,17,18. Il est crucial de sélectionner des feuilles saines et sans tache. Ce travail a utilisé le cultivar de maïs de recherche populaire B73. Nous n’avons pas testé d’autres cultivars. Les plants de maïs utilisés pour ce protocole ont été cultivés dans l’obscurité parce que les feuilles étiolées produisent des protoplastes avec une plus grande viabilité 16 h après la transfection par rapport aux protoplastes à partir de feuilles vertes. Pour les applications qui ne nécessitent pas d’incubation de nuit, il serait possible d’utiliser du matériel foliaire vert ou vert.
Une étape critique consiste à couper correctement le matériau foliaire en fines tranches avant la digestion enzymatique. Ce processus augmente la surface d’exposition des cellules mésophylles à la solution enzymatique, ce qui augmente le nombre de protoplastes récupérés. Les extrémités distales des feuilles sont jetées et les tranches minces (≤1 mm) sont coupées avec de nouvelles lames de rasoir, qui sont immédiatement éteintes lorsqu’elles commencent à ternir. Pour une quantité donnée de tissu, des tranches plus minces donnent plus de protoplastes à condition que la bonne technique soit utilisée pour minimiser l’écrasement des feuilles.
Il est également important de laver correctement les protoplastes, car ils sont assez délicats après avoir subi l’ablation de la paroi cellulaire. Après la digestion, toutes les solutions sont conservées sur la glace et les protoplastes sombres sont protégés de la lumière. L’osmolarité et le pH sont tamponnés en effectuant les lavages en solution MMG. Pour isoler les protoplastes des débris cellulaires moins denses, la centrifugation a lieu à 100 x g. Les protoplastes centrifugés à 200 x g présentent une viabilité similaire après l’isolement, mais une viabilité plus faible le lendemain, et ils se transforment environ la moitié aussi. Nous recommandons de vérifier la viabilité des protoplastes en les colorant avec du diacétate de fluorescéine (FDA) immédiatement après l’isolement; La viabilité normale varie entre 70% et 90%. Les protoplastes dont la viabilité est inférieure à 40 % après isolement produisent peu de transformants.

L’enrobage et le lavage sont plus faciles lorsque vous travaillez avec de nombreux protoplastes car une pastille clairement visible est obtenue après la transfection. Pour cette raison, la transfection est réalisée avec 1 million de protoplastes ou plus. Lors de la mise à l’échelle du protocole, un récipient de taille appropriée doit être choisi pour les étapes d’incubation (tube à centrifuger de 1,5 mL, 15 mL ou 50 mL), et le volume de solution utilisé pour les étapes de lavage doit être mis à l’échelle en conséquence. Dans tous les cas, il est avantageux de centrifuger dans ≤10 mL d’aliquotes pour s’assurer que les protoplastes ne restent pas dans le surnageant. Une innovation de ce protocole est la suppression de l’étape d’incubation et de lavage de 1 h dans la solution W5 qui est répertoriée dans d’autres protocoles14,19, ce qui s’est avéré inutile entre nos mains.
Comme on l’a vu dans d’autres études, la quantité et la qualité de l’ADN sont toutes deux essentielles à la réussite de la transfection19. Pour les plasmides de l’ordre de 4 à 6 kb, 15 μg d’ADN sont utilisés pour 1 million de protoplastes. Des préparations d’ADN de mauvaise qualité peuvent entraîner une viabilité réduite après la transfection, nous vous recommandons donc d’utiliser un kit d’extraction d’ADN commercial lors de l’isolement des plasmides des bactéries. L’incubation des protoplastes pendant la nuit se fait à température ambiante dans l’obscurité pour permettre la transcription du plasmide ou de la bibliothèque plasmidique tout en minimisant le stress. Après une incubation de nuit, environ la moitié du nombre de protoplastes transfectés à l’origine est récupérée. Les protoplastes sont dilués à une concentration de 500 à 1 000 cellules/μL pour une incubation de nuit. Les protoplastes laissés à incuber pendant la nuit à des concentrations supérieures à 1 000 cellules/μL ont des taux de récupération et une viabilité plus faibles. À des concentrations plus élevées, les débris de protoplastes endommagés et morts peuvent contribuer à la mort des protoplastes voisins. Le lavage des protoplastes après une incubation nocturne sert à la fois à éliminer ces débris et à éliminer l’excès de plasmide.
De tels protocoles ont la limitation que toutes les espèces végétales ou tous les types de tissus ne se prêtent pas au protoplasting. De plus, des différences d’expression génique peuvent être induites par le processus de protolasticité.
En résumé, nous avons détaillé un protocole simple et évolutif pour isoler et transfecter des millions de protoplastes viables de la culture agricole de base Z. mays. Cette méthode peut transfecter beaucoup plus de protoplastes en utilisant le PEG, avec une efficacité de transformation presque aussi élevée que les méthodes basées sur l’électroporation15. Le plus grand nombre net de transformants permet de tester des centaines ou des milliers de constructions dans des expériences à grande échelle telles que des tests rapporteurs massivement parallèles12,13. Les futures expériences à l’échelle du génome sur le maïs permettront aux scientifiques de mieux comprendre l’expression et la régulation des gènes du maïs.

L’expression transitoire des gènes est un outil puissant en biologie végétale. Cependant, les cellules végétales sont difficiles à transfecter car elles sont entourées d’une paroi cellulaire. Cette barrière à l’entrée de l’ADN n’est pas présente dans d’autres types de cellules couramment étudiés tels que les cellules de mammifères ou d’insectes. Des recherches antérieures ont abordé ce défi en utilisant des protoplastes: des cellules végétales dont les parois cellulaires ont été digérées et enlevées. Contrairement aux tissus foliaires non transformés, les protoplastes végétaux sont faciles à travailler en suspension et se prêtent à des techniques de transfection médiées par électroporation ou polyéthylèneglycol (PEG)1. Les cellules végétales conservent une grande partie de leur fonctionnalité même après l’ablation de la paroi cellulaire. Ainsi, les protoplastes sont utilisés dans une variété de plantes pour étudier la fonction des gènes et des protéines2,3, pour comprendre la transduction du signal4 et pour identifier les cibles possibles pour la sélection végétale5. Les protoplastes sont également un véhicule pratique pour le criblage de constructions d’édition du génome chez diverses espèces cultivées, y compris le blé et la pomme de terre 6,7. En bref, les essais transitoires dans les protoplastes sont indispensables pour la biotechnologie agricole.
Le maïs (Zea mays L.) est la première culture céréalière mondiale en termes de tonnage; En tant que tel, il s’agit d’un axe majeur de la recherche fondamentale et appliquée en phytologie8. Cependant, contrairement aux plantes modèles telles que Nicotiana tabacum9, l’expression transgénique transitoire dans les feuilles de maïs intactes n’est pas systématiquement effectuée. Protoplasting a été utilisé pour obtenir et transfecter des cellules mésophylles de feuilles de maïs10,11. Les méthodes précédentes ont atteint des rendements de transfection allant jusqu’à 75% en utilisant l’électroporation et ont produit des protoplastes transfectés à l’échelle de dizaines de milliers10,15.
Ce protocole détaille comment protoplaster des millions de cellules mésophylles de maïs et les transfecter avec une efficacité comparable aux méthodes précédentes. Les principales étapes sont la culture de plants de maïs étiolés, la récolte du tissu foliaire, la digestion de la paroi cellulaire de la plante et l’administration de l’ADN plasmidique dans les cellules à l’aide de PEG. La principale contribution de ce protocole est la capacité d’étendre la transfection des protoplastes tout en maintenant la viabilité cellulaire requise pour les tests fonctionnels. Cela permet l’utilisation d’expériences à l’échelle du génome, telles que des tests rapporteurs massivement parallèles, qui peuvent tester la fonction de centaines de milliers de régions dans le génome du maïs. Cette méthode a récemment été utilisée pour étudier de grandes bibliothèques d’éléments d’ADN cis-régulateurs, y compris des amplificateurs et des promoteurs12,13,14.

<table><tbody><tr><td>Tubes de microcentrifugation gradués de 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>490004-444</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger conique Falcon de 15 mL</td><td>Corning</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Bécher en verre Pyrex</td><td>Fisher</td><td>50-121-5005</td><td></td></tr><tr><td>Crépine à maille de nylon de 40 um</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tube Falcon</td><td>Corning</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>72 plateau de propagation cellulaire</td><td>T.O. Plastics</td><td>725607C</td><td></td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td>VWR</td><td>89107-732</td><td></td></tr><tr><td>Cloche</td><td>Bel-Art</td><td>F42022-0000</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de paillasse</td><td>Eppendorf</td><td>5424-R</td><td></td></tr><tr><td>Bêta-mercaptoéthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-250ML</td><td>Dissoudre dans du H2O ultrapur pour obtenir une solution mère 1M. Conserver à température ambiante.</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté (CaCl2*2H2O)</td><td>PhytoTech Labs</td><td>C135</td><td>Dissoudre dans du H2O ultra-pur pour obtenir une solution mère de 1M. Conserver à température ambiante.</td></tr><tr><td>Cellulase Onozuka R-10</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C8001.0010</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>PhytoTech Labs</td><td>M562</td><td></td></tr><tr><td>Lunette de dissection</td><td>Reichert</td><td>Microstar IV</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescéine Diacétate (FDA)</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>F1303</td><td>Dissoudre dans de l’acétone à 0,5 % poids/volume pour obtenir une solution mère 1000X. Protéger de la lumière et conserver à -20 °C.</td></tr><tr><td>Systèmes d’éclairage par fluorescence</td><td>Prior</td><td>Lumen200</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>Leica</td><td>MDG36</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse haute capacité</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M8002.0005</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M292-1KG</td><td>Dissoudre dans du H2O ultrapur pour former un stock de 1M solution. Conserver à température ambiante.</td></tr><tr><td>Graines de maïs</td><td>B73</td><td>USDA-ARS</td><td>https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail?accid=PI+550473</td></tr><tr><td>Pince de liant moyenne</td><td>Uline</td><td>S-24649</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5287-250G</td><td>Dissoudre dans du H2O ultrapur pour obtenir une solution mère de 1M. Ajustez le pH à 5,7 à l’aide de KOH. Protéger de la lumière et conserver à température ambiante.</td></tr><tr><td>Micropipette 20-200 uL</td><td>Gilson</td><td>F123601G</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop spectrophotomètre microvolume</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha compétent E. coli</td><td>New England BioLabs</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer hémocytomètre</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF16034F</td><td></td></tr><tr><td>n° 9 Lame de rasoir à simple tranchant</td><td>Excel</td><td>20009</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur orbital</td><td>VWR</td><td>89032-104</td><td></td></tr><tr><td>Poly(éthylène) glycol 4 000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81240-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1KG</td><td>Dissoudre dans du H2O ultra-pur pour obtenir une solution mère de 1M. Conserver à température ambiante.</td></tr><tr><td>Vermiculite de qualité professionnelle</td><td>NK Pelouse & </td><td>Garden G208</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger en verre à fond rond 30 mL</td><td>Kimble Chase</td><td>45500-30</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur en caoutchouc pour tubes à centrifuger</td><td>Corex Corning</td><td>CLS8445AO</td><td></td></tr><tr><td>Sphagnum Tourbe de tourbe</td><td>Premier Horticulture</td><td>0128P</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Réactif</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Tygon tube sous vide</td><td>VWR</td><td>76336-844</td><td></td></tr><tr><td>Vacuomètre</td><td>Wika</td><td>4269978</td><td></td></tr></tbody></table>

transfection évolutive de protoplastes mésophylles de maïs

Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts

La transfection des cellules mésophylles du maïs implique souvent la digestion des parois cellulaires végétales pour créer des protoplastes, puis l’insertion d’ADN par électroporation ou polyéthylèneglycol (PEG). Les méthodes précédentes ont été développées pour produire des dizaines de milliers de protoplastes transfectés à la fois. Ici, nous décrivons une méthode simple pour isoler et transfecter des millions de protoplastes mésophylles foliaires dans le maïs (Zea mays L.). Ce processus simplifié supprime certaines étapes courantes de protolasticité, telles que le lavage dans W5. De plus, des étapes telles que la centrifugation, la transfection médiée par PEG et l’incubation ont été modifiées pour fonctionner avec un plus grand nombre de protoplastes. La capacité d’exprimer de grandes bibliothèques de constructions plasmidiques permet des expériences à l’échelle du génome, telles que des tests rapporteurs massivement parallèles dans le maïs.

Le tissu le mieux adapté à l’isolement du protoplaste est constitué des deuxième et troisième feuilles des plantules âgées de 10 à 11 jours (figure 1). Dans ce travail, nous avons obtenu environ 10 millions de protoplastes à partir de 16 sections de feuilles, chacune mesurant 10 cm de long. Le nombre de protoplastes isolés dépend de la masse du matériau foliaire et de la largeur des tranches de feuilles digérées dans la solution enzymatique.
Sous un microscope à lumière claire, les protoplastes intacts apparaissent à peu près sphériques, avec des plastes mouchetant la surface (Figure 2A). Avant de procéder à la transfection, la viabilité peut être vérifiée en colorant une petite partie aliquote de protoplastes avec du diacétate de fluorescéine (FDA). Les protoplastes colorés par la FDA qui deviennent fluorescents sous la lumière UV sont considérés comme viables (Figure 2B,C). Tous les protoplastes qui semblent intacts ne sont pas encore viables, et certains protoplastes viables peuvent être en train de mourir par évapocuolation (figure 2C). Dans ces cellules, la vacuole gonfle et finira par être éjectée de la membrane cellulaire.
La figure 3 montre des protoplastes transformés avec pJT01, un plasmide d’expression de maïs de 4,3 kb dérivé de CD3-911 (ABRC)15. La transfection entraîne l’expression de sGFP marqué avec un signal de localisation nucléaire C-terminal de c-Myc (Figure 3A). La proportion de protoplastes exprimant le sGFP a été mesurée au cours de plusieurs expériences à l’aide d’un hémocytomètre. L’efficacité médiane de transfection obtenue par cette méthode était de 40 % après une incubation de nuit (n = 9, figure 4, tableau 1), ce qui est comparable aux méthodes publiées précédemment15. Selon l’application expérimentale, si le plasmide ou la bibliothèque plasmidique n’a pas de rapporteur fluorescent, il est recommandé d’inclure un témoin positif pour confirmer la transfection.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64991/64991fig01.jpg"> Figure 1 : Plantules de maïs étiolées représentatives cultivées dans l’obscurité pendant 10 jours après la germination. Les flèches indiquent les deuxième et troisième feuilles, qui conviennent le mieux au protoplasting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64991/64991fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64991/64991fig02.jpg"> Figure 2 : Microscopie à fluorescence de la viabilité du protoplaste après isolement. (A) Image en fond clair des protoplastes immédiatement après l’isolement. (B) Le signal de fluorescence des protoplastes colorés par la FDA. (C) Chevauchement du fond clair et de la fluorescence montrant les protoplastes viables. La flèche montre un protoplaste en cours d’évacuation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64991/64991fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64991/64991fig03.jpg"> Figure 3 : Microscopie à fluorescence de protoplastes transfectés avec sGFP. (A) Image en fond clair des protoplastes après transfection. (B) Le signal de fluorescence des protoplastes transfectés dans le canal GFP. (C) Chevauchement du fond clair et de la fluorescence montrant les protoplastes transformés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64991/64991fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64991/64991fig04.jpg"> Figure 4 : Pourcentage de protoplastes présentant une fluorescence GFP après 16 h d’incubation. L’efficacité de la transfection variait d’un essai indépendant à l’autre, l’efficacité la plus faible étant d’environ 20 % et la plus élevée proche de 50 %. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64991/64991fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Procès</td>
			<td>Cellules GFP comptées</td>
			<td>Nombre total de cellules comptées</td>
			<td>Pourcentage GFP</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>104</td>
			<td>261</td>
			<td>39.8</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>148</td>
			<td>298</td>
			<td>49.5</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>84</td>
			<td>258</td>
			<td>32.6</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>137</td>
			<td>271</td>
			<td>50.6</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>127</td>
			<td>299</td>
			<td>42.5</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>107</td>
			<td>235</td>
			<td>45.5</td>
		</tr><tr><td>7</td>
			<td>83</td>
			<td>360</td>
			<td>23.1</td>
		</tr><tr><td>8</td>
			<td>134</td>
			<td>549</td>
			<td>24.4</td>
		</tr><tr><td>9</td>
			<td>61</td>
			<td>201</td>
			<td>30.3</td>
		</tr><tr><td>Méchant</td>
			<td>109</td>
			<td>304</td>
			<td>36</td>
		</tr><tr><td>Écart type</td>
			<td>29</td>
			<td>102</td>
			<td>10</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Efficacité représentative de la transfection du protoplaste. Données de neuf essais protoplasting récents dans le laboratoire des auteurs.
Fichier supplémentaire 1 : fichier texte au format GenBank avec la séquence de pJT01. Un plasmide d’expression sGFP de 4,3 kb sert de témoin positif dans les protoplastes de maïs transfectés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64991/pJT01_gfp_cmyc.gb.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Ici, nous présentons un protocole à haut débit pour transfecter transitoirement des millions de protoplastes de maïs afin de tester de grandes banques de plasmides dans des cellules mésophylles de maïs.

Transfection évolutive de protoplastes mésophylles de maïs

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation ...

Hello.Today nous allons vous montrer un protocole qui protoplaste des millions de cellules mésophylles de maïs et les transforme avec une grande efficacité. Les principales étapes du protocole consistent d’abord à digérer et à éliminer la paroi cellulaire végétale, à libérer les protoplastes, puis à transformer le protoplaste à l’aide de PEG. La grande différence entre ce protocole et d’autres est l’ampleur de la transformation.La plupart des protocoles aboutissent avec entre 1 000 et 10 000 protoplastes transformés. Cependant, notre protocole donne des millions de protoplastes de maïs transformés. Ici, nous avons des plants de maïs cultivés dans l’obscurité pendant neuf à 11 jours après la germination.Coupez les semis juste au-dessus du niveau du sol et placez-les dans l’eau. Gardez les plantes dans l’obscurité lorsqu’elles ne sont pas utilisées. Sélectionnez les deuxième et troisième feuilles de chaque plantule, en prenant soin d’exclure les feuilles avec des zones brunes ou endommagées.Sélectionnez 12 à 16 feuilles et coupez un centimètre des pointes. Ensuite, coupez une section de 10 centimètres de chaque feuille. Empilez les sections de feuilles les unes sur les autres avec les extrémités basales ensemble.Serrez le faisceau ensemble à l’extrémité basale à l’aide d’un clip de liant. Placez le paquet de feuilles sur un morceau de papier blanc. Couper des tranches de feuilles de 0,5 à un millimètre de large.Il est important de couper de fines tranches cohérentes. Après avoir coupé une partie du faisceau de feuilles, transférer les tranches dans la solution enzymatique. Ne laissez pas le matériau sécher.Remuez doucement la solution enzymatique pour mouiller le matériau. Placez du papier d’aluminium sur le bécher pour bloquer la lumière. Répétez ce processus jusqu’à ce que tout le paquet soit coupé près du clip de liant.Après la coupe, la solution devrait ressembler à ceci. Transférer le bécher de solution enzymatique dans un clocher. Le vide s’infiltre pendant trois minutes à température ambiante.Incuber sur un shaker de table à 40 RPM à température ambiante pendant deux heures et demie. Après l’incubation, donnez un tourbillon à la solution. Il devrait avoir l’air laiteux, indiquant une digestion réussie.Incuber sur le shaker de table à 80 RPM à température ambiante pendant 10 minutes de plus. Placez le bécher avec la solution enzymatique sur la glace. Arrêtez la digestion en ajoutant un volume de MMG glacé.Filtrer à travers une crépine cellulaire de 40 microns dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Diviser la solution en aliquotes d’au plus 10 millilitres chacune. Verser dans des tubes de verre à fond rond réfrigérés.Centrifuger les tubes à 100 G pendant quatre minutes. Retirez le surnageant en veillant à ne pas déranger la pastille. Resuspendez, puis regroupez les échantillons pour les lavages ultérieurs.Lavez les protoplastes deux fois avec cinq millilitres de MMG. Faites tourner vers le bas à chaque fois à 100 G pendant trois minutes. Le granulé doit être d’une belle couleur vert jaune vif.Vous pourrez remettre en suspension la pastille en faisant tourner doucement le tube. Remettez en suspension dans un millilitre de MMG, et diluez une petite partie aliquote 10 à 20x pour compter. Il est important de bien remettre en suspension avant l’aliqouting, car les protoplastes se déposeront rapidement.Chargez les protoplastes dilués dans l’hémocytomètre. Comptez les protoplastes au microscope optique. Une bonne préparation n’aura pas beaucoup de débris en excès flottant après le lavage.Les bons protoplastes sont circulaires avec des plastes visibles. Utilisez le nombre de cellules pour calculer le nombre total. Cette préparation a abouti à un peu plus de 10 millions de protoplastes.Nous recommandons de vérifier la viabilité à l’aide d’un colorant diacétate de fluorescéine. Des isolations réussies de protoplastes donnent une viabilité comprise entre 70 et 90%Mélangez les protoplastes avec votre plasmide d’intérêt. Cet exemple utilise 1 million de protoplastes et 15 microgrammes d’ADN.Incuber sur la glace pendant 30 minutes. Remettez en suspension en tapotant le côté du tube. Ajouter une solution de PEG pour atteindre une concentration finale de 12% de PEG.Mélanger doucement en retournant plusieurs fois. Les protoplastes et la solution de PEG sont fragiles, alors ne secouez pas le tube. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 10 minutes.Diluer avec cinq volumes de solution d’incubation et mélanger doucement par inversion. Centrifuger les tubes à 100 G pendant quatre minutes. Laver une fois avec un tampon d’incubation d’un millilitre.Veillez à ne pas déranger le granulé. Faire tourner vers le bas à 100 G pendant trois minutes. Resuspendre dans le tampon d’incubation à une concentration de 500 à 1000 cellules par microlitre.Incuber dans l’obscurité pendant la nuit à température ambiante. Le lendemain, faites tourner à 100 G pendant quatre minutes. Laver deux fois avec une solution d’incubation réfrigérée.Tourner vers le bas à chaque fois pendant trois minutes à 100 G à température ambiante. Resuspendez, puis chargez une petite partie aliquote sur l’hémocytomètre pour le contrôle final. Tout d’abord, comptez le nombre total de protoplastes sous fond clair.Maintenant, observez la fraction de protoplastes qui fluorescent sous UV pour vérifier la transfection. Les protoplastes expriment notre journaliste GFP. Maintenant, obtenons quelques mesures sur l’efficacité de la transfection.Dans cette préparation, nous avons obtenu 10 millions de protoplastes au total, dont nous avons transfecté 1 million. Le lendemain, nous en avons récupéré 335 000. Parmi ceux-ci, nous avons eu un taux de transformation de 30,3%, ce qui nous laisse avec notre total d’environ 100 000 protoplastes exprimant la GFP.L’efficacité de la transfection peut varier. Comme vous pouvez le voir dans le graphique, nous constatons régulièrement des gains d’efficacité compris entre 20 et 50% parmi les préparations répétées. Ce protocole permet la collecte et la transformation de millions de protoplastes mésophylles de maïs.L’une des meilleures parties du protocole est sa capacité à évoluer. En augmentant la quantité de volume ainsi que le nombre de protoplastes utilisés dans la transformation, vous pouvez augmenter votre transformation de plus d’un ordre de grandeur par rapport à ce que nous avons montré aujourd’hui. À ce jour, notre plus grande expérience à tube unique a commencé avec 20 millions de protoplastes et 200 microgrammes d’ADN, et s’est terminée avec 3,1 millions de protoplastes transformés le lendemain.Ce protocole à haut débit est particulièrement utile lorsque vous devez tester de nombreuses constructions plasmidiques différentes, mais les collaborateurs ont utilisé ce protocole à des fins qui ne nécessitent pas la possibilité de mettre à l’échelle, telles que la conception de circuits de gènes synthétiques et de maïs. Merci d’avoir regardé notre vidéo. Nous espérons que cela vous a aidé.

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Transfection évolutive de protoplastes mésophylles de maïs

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