Surveillance de la pexophagie médiée par Stub1

Les peroxysomes effectuent une oxydation bêta et sont sujets aux dommages causés par les ROS. Cette méthode permet d’étudier comment les cellules traitent les peroxysomes stressés par les ROS. Ce protocole n’est pas seulement utilisé pour cibler globalement tous les peroxysomes au sein d’une population cellulaire, mais peut également permettre la manipulation des peroxysomes individuels dans des cellules individuelles.

La génération de ROS assistée par colorant peut également être utilisée pour cibler les organites en dehors des peroxysomes afin de sonder la façon dont les cellules traitent les lésions des organites. Pour commencer, semer deux fois 10 à la cinquième cellule SHSY5Y humaine ou six fois 10 à la quatrième souris NIH H3T3 cellules dans 840 microlitres de milieu de culture sur des boîtes de culture de 35 millimètres à fond de verre avec un micropuits en verre de 20 millimètres de diamètre. Cultivez les cellules sous 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.

Ensuite, transfectez les cellules avec les plasmides souhaités à l’aide d’un réactif de transfection ou d’une transfection cellulaire SHSY5Y. Diluer les plasmides dans 55 microlitres de DMEM/F-12 sans sérum et diluer un microlitre de réactif de transfection dans 55 microlitres de DMEM/F-12 sans sérum. Combinez l’ADN dilué avec le réactif dilué.

Mélanger délicatement et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Ajouter le complexe au micropuits de 20 millimètres préalablement plaqué avec 100 microlitres de milieu de culture contenant des cellules SHSY5Y sans antibiotiques. Secouez doucement le plat d’avant en arrière.

Effectuer la transfection cellulaire NIH 3T3 comme démontré précédemment, mais remplacer le milieu sérique réduit par le DMEM/F-12 sans sérum par le réactif de dilution plasmidique et de transfection. Après deux heures de transfection, retirez le milieu contenant le réactif de transfection et ajoutez un millilitre de milieu de culture frais. Incuber les cellules NIH 3T3 ou SHSY5Y à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures.

Pour la production de ROS activés par la lumière, 24 heures après la transfection, retirez le milieu de culture et ajoutez 10 microlitres de ligand HaloTag TMR 200 nanomolaires ou 200 nanomolaires Janelia Fluor 646 HaloTag ligand sur le micropuits en verre de 20 millimètres. Transférez la capsule dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone et laissez-la pendant une heure pour colorer les cellules. Après une heure, retirez soigneusement le milieu de coloration et ajoutez un millilitre de milieu de culture frais.

Placez une antenne à fond de verre contenant les cellules souhaitées sur un microscope confocal à balayage laser équipé d’un incubateur à étage. Dans le logiciel, cliquez sur Fenêtre d’outil, choisissez Oculaire et cliquez sur le bouton DIA pour allumer la lumière transmise. Visualisez l’antenne parabolique à travers l’oculaire du microscope et mettez les cellules au point en tournant le bouton de mise au point.

Choisissez LSM et cliquez sur le bouton Colore Detector Select (Sélectionner un détecteur de colorant). Double-cliquez sur les colorants souhaités dans la fenêtre contextuelle pour sélectionner les paramètres de laser et de filtre appropriés pour l’imagerie des cellules. Cliquez sur Live4x dans le panneau Live pour lancer un balayage laser rapide afin de commencer à filtrer les signaux fluorescents des cellules.

Déplacez la scène à l’aide du contrôleur du joystick et localisez les cellules exprimant le milieu diKillerRed VKSKL ou SLP-VKSKL pour appliquer une contrainte ROS sur les peroxysomes. Acquérir une image de la cellule souhaitée. Cliquez sur Fenêtre d’outil et choisissez LSM Stimulation.

Cliquez ensuite sur le bouton ellipse et dans la fenêtre Live Image, utilisez la souris pour dessiner un ROI de 15 micromètres de diamètre contenant les peroxysomes souhaités auxquels la contrainte ROS sera appliquée. Pour appliquer une contrainte ROS, utilisez 561 nanomètres pour les cellules avec le ligand diKillerRed VKSKL ou SLP marqué TMR et utilisez 640 nanomètres pour les cellules colorées avec le ligand SLP marqué Janelia Fluor 646. Sélectionnez la longueur d’onde laser pour appliquer la contrainte ROS.

Entrez le pourcentage laser souhaité et la durée. Pour la production de ROS dans les peroxysomes, cliquez sur Acquérir puis sur le bouton Stimulation pour lancer le balayage avec 561 ou 640 nanomètres de lumière à travers les ROI pendant 30 secondes chacun. Cette stimulation correspond à des réglages de puissance laser d’environ 5% pour 561 et 640 nanomètres.

Après 30 secondes d’éclairage laser, les peroxysomes dans les ROI perdent leurs signaux diKillerRed VKSKL, TMR ou Janelia Fluor 646. Cette perte de signal permet de distinguer les peroxysomes éclairés et non éclairés à l’intérieur de la cellule. Pour surveiller les cellules vivantes pexophages, suivez la translocation de Stub1, Hsp70, ubiquitine, p62 ou LC3B marqués EGFP sur les peroxysomes éclairés ou stressés par ROS par imagerie accélérée en utilisant des intervalles de 10 minutes entre les images.

L’éclairage focal conduit à une production instantanée et localisée de ROS dans les peroxysomes individuels, comme indiqué par le rapporteur fluorescent roGFP2-VKSKL. L’image diKillerRed VKSKL a été prise après que toutes les mesures roGFP2-VKSKL aient été effectuées pour indiquer l’emplacement des peroxysomes endommagés. Les données montrent également que les peroxysomes non éclairés ne sont pas affectés, ce qui indique la précision de la méthodologie.

Cette méthodologie a été utilisée pour surveiller la pexophagie médiée par Stub1. Au cours de ce processus, Hsp70, Stub1, les protéines ubiquitinées, les adaptateurs d’autophagie p62 et LC3B apparaissent par la suite dans les peroxysomes stressés par les ROS pour entraîner la pexophagie. En utilisant la même stratégie, il a été possible d’endommager simultanément tous les peroxysomes sur une boîte de culture pour la caractérisation biochimique de la pexophagie médiée par Stub1.

Avant l’éclairage LED, la fluorescence EGFP-ubiquitine était homogène dans le cytoplasme et ne colocalisait pas avec les peroxysomes. Après neuf heures d’éclairage LED, les signaux EGFP-ubiquitine se sont accumulés sur tous les peroxysomes dans les cellules cultivées dans une boîte confocale. En utilisant ce protocole, nous avons constaté que les peroxysomes stressés par les ROS sont éliminés par une voie de dégradation dépendante de l’ubiquitine.

Les peroxysomes stressés par les ROS recrutent l’ubiquitine E3 ligase Stub1 pour permettre leur élimination par pexophagie.