Name: Surveillance de la pexophagie médiée par Stub1 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie en direct pour surveiller la pexophagie médiée par Stub1 dans les cellules SHSY5Y et NIH 3T3. Cette technique permet d'étudier la dégradation des peroxysomes stressés par les ROS et le contrôle qualité des organites.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu en partie par une subvention de recherche MOST 111-2311-B-001-019-MY3 du Conseil national des sciences et de la technologie de Taïwan.

1. Préparation de cellules exprimant des protéines diKillerRed ou auto-marquantes (SLP) dans la lumière du peroxysome
<ol><li>Ensemencez les cellules désirées sur des boîtes de culture cellulaire à fond de verre. Pour l’expérience ici, ensemencer 2 x 105 cellules SHSY5Y humaines dans 840 μL de milieu de culture (DMEM/F-12 supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline/streptomycine) ou 6 x 104 cellules NIH3T3 de souris dans 840 μL de milieu de culture (DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin et 1% de pénicilline/streptomycine) sur une boîte de culture de 35 mm avec un micropuits en verre de 20 mm de diamètre. NOTA : Le nombre de cellules ensemencées doit être ajusté proportionnellement en fonction de la zone du micropuits en verre lors de l’utilisation de plats à fond de verre d’autres spécifications.</li>
	<li>Faire pousser les cellules sous 5% de CO2/37 °C pendant 24 h.</li>
	<li>Transfecter les cellules avec les plasmides désirés à l’aide d’un réactif de transfection.<ol><li>Utilisez PMP34-TagBFP pour marquer les peroxysomes dans les cellules vivantes. Utilisez diKillerRed-VKSKL ciblant les peroxysomes ou SLP-VKSKL (+ ligands SLP marqués par colorant) pour la génération de ROS dans la lumière du peroxysome (par production de ROS activée par la lumière). Dans ce protocole, nous utilisons la protéine d’auto-marquage HaloTag-VKSKL21. Pour surveiller la translocation de Stub1/Hsp70, l’accumulation de protéines ubiquitinées et la formation d’autophagosomes sur les peroxysomes stressés par les ROS, transfectez EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub ou EGFP-LC3B, respectivement. Pour vérifier la génération de ROS dans la lumière peroxysomale, co-transfecter diKillerRed-VKSKL avec la sonde redox fluorescente localisée par peroxysomes roGFP2-VKSKL22.</li>
		<li>Pour la transfection cellulaire SHSY5Y, diluer les plasmides dans 55 μL de DMEM/F-12 sans sérum et diluer 1 μL de réactif de transfection dans 55 μL de DMEM/F12 sans sérum. Combinez l’ADN dilué avec le réactif dilué. Mélanger délicatement et incuber pendant 30 min à température ambiante.</li>
		<li>Ajouter le complexe au micropuits de 20 mm préalablement plaqué avec 100 μL de milieu de culture pour SHSY5Y sans antibiotiques (DMEM/F-12 avec 10% de sérum bovin fœtal). Secouez doucement le plat d’avant en arrière.</li>
		<li>Pour la transfection cellulaire NIH3T3, substituer le milieu sérique réduit au DMEM/F-12 sans sérum pour diluer les plasmides et le réactif de transfection. Remplacer le milieu de culture de placage par SHSY5Y par un milieu de culture pour cellules NIH3T3 sans antibiotiques (DMEM avec 10% de sérum bovin).</li>
	</ol></li>
	<li>Après 2 h de transfection, retirer le milieu contenant le réactif de transfection et ajouter 1 mL de milieu de culture frais. Incuber les cellules NIH3T3 ou SHSY5Y à 37°C et 5% CO2 pendant 24 h. REMARQUE : D’autres lignées cellulaires peuvent également être utilisées pour étudier la pexophagie médiée par Stub1 (p. ex. cellules HeLa).</li>
</ol>2. Coloration des peroxysomes avec des ligands SLP marqués par colorant (pour la production de ROS activées par la lumière)
<ol><li>24 h après la transfection, retirer le milieu de culture et ajouter 100 μL de ligand HaloTag TMR 200 nM ou Janelia Fluor 646 HaloTag ligand 200 nM sur le micropuits de verre de 20 mm. REMARQUE: Les ligands SLP marqués au colorant doivent être dilués avec le milieu de culture respectif pour chaque lignée cellulaire. Le choix des ligands marqués Janelia Fluor 646 libérera les canaux bleu, vert et rouge pour l’imagerie de fluorescence en aval.</li>
	<li>Transférer la capsule dans un incubateur à 37°C, 5% CO2 . Coloration pendant 1 h. Après 1 h, retirer soigneusement le milieu de coloration et ajouter 1 mL de milieu de culture frais.</li>
</ol>3. Contrainte ROS des peroxysomes sur un microscope confocal à balayage laser
<ol><li>Placez une antenne parabolique à fond de verre contenant les cellules souhaitées sur un microscope confocal à balayage laser équipé d’un incubateur sur scène.</li>
	<li>Cliquez sur Tool Window (Fenêtre de l’outil), choisissez Ocular, puis cliquez sur le bouton DIA (Figure 2A) pour allumer la lumière transmise. Visualisez l’antenne parabolique à travers l’oculaire du microscope et mettez les cellules au point en tournant le bouton de mise au point.</li>
	<li>Choisissez LSM et cliquez sur le bouton Dye & Detector Select (Sélection de colorant et de détecteur ) (Figure 2B). Double-cliquez sur les colorants souhaités dans la fenêtre contextuelle pour sélectionner les paramètres de laser et de filtre appropriés pour l’imagerie des cellules (Figure 2C). Cliquez sur Livex4 dans le panneau Live pour lancer un balayage laser rapide afin de commencer à détecter les signaux de fluorescence des cellules (Figure 2D).</li>
	<li>Déplacez la scène à l’aide du contrôleur du joystick et localisez les cellules exprimant le milieu diKillerRed-VKSKL ou SLP-VKSKL pour appliquer une contrainte ROS (sur les peroxysomes). Acquérir une image de la cellule souhaitée.</li>
	<li>Cliquez sur Fenêtre Outil et choisissez LSM Stimulation (Stimulation LSM ) (Figure 2E). Cliquez sur le bouton d’ellipse et, dans la fenêtre de l’image en direct, utilisez la souris pour dessiner un ROI circulaire de 15 μm de diamètre (Figure 2F) contenant les peroxysomes souhaités acquis à l’étape 3.4 auxquels la contrainte ROS sera appliquée (voir Figure 3 pour un exemple).</li>
	<li>Pour appliquer une contrainte ROS, utilisez 561 nm pour les cellules avec le ligand SLP marqué diKillerRed-PTS1 ou TMR, et utilisez 640 nm pour les cellules colorées avec le ligand SLP marqué Janelia Fluor 646.</li>
	<li>Sélectionnez la longueur d’onde laser pour appliquer la contrainte ROS. Entrez le pourcentage laser souhaité et la durée (Figure 2G).</li>
	<li>Cliquez sur Acquire, puis sur le bouton Stimulation (Figure 2H) pour lancer le balayage avec une lumière 561/640 nm à travers les ROI pendant 30 s chacun. Cela correspond à un réglage de puissance laser de ~5% pour 561 nm et 640 nm sur le microscope confocal utilisé ici. Cette opération conduira à la production de ROS dans les peroxysomes. REMARQUE: On peut sélectionner des ROI de différentes tailles. Il convient d’ajuster proportionnellement le temps d’éclairage pour chaque ROI en fonction de sa zone.</li>
	<li>Après 30 s d’éclairage laser, les peroxysomes dans les ROI auront perdu leurs signaux diKillerRed-PTS1/TMR/Janelia Fluor 646. Cette perte de signal permet de distinguer les peroxysomes illuminés des peroxysomes non éclairés (endommagés ou sains) dans une cellule.</li>
</ol>4. Surveillance de la pexophagie dans les cellules vivantes par imagerie accélérée
<ol><li>Suivez la translocation de Stub1, Hsp70, Ub, p62 ou LC3B marqués EGFP sur les peroxysomes éclairés/soumis à un stress ROS par imagerie accélérée en utilisant des intervalles de 10 minutes entre les images (pour des exemples, voir les figures 3 à 7). REMARQUE: Les signaux EGFP-Stub1 ou EGFP-Hsp70 commencent à apparaître 10-20 min après l’éclairage et restent sur tous les peroxysomes endommagés jusqu’à ~40 min après l’éclairage. Les signaux EGFP-Ub apparaissent 30 minutes après l’éclairage et durent 2-3 h. La translocation EGFP-p62 apparaît 60 min après l’éclairage, et les signaux EGFP-LC3B deviennent visibles ~3 h après l’éclairage.</li>
	<li>Quantifier les signaux EGFP sur les peroxysomes endommagés (de Stub1, Ub, p62 ou LC3B) à l’aide d’ImageJ. Procédez comme suit pour utiliser ImageJ afin de quantifier une image à trois canaux (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL).<ol><li>Ouvrez l’image et appliquez des sélections elliptiques ou des sélections à main levée pour enfermer la région contenant tous les peroxysomes illuminés (signal PMP34-TagBFP positif et signal ligand HaloTag blanchi; Figure 8A).</li>
		<li>Cliquez sur Dupliquer pour sélectionner le canal PMP34-TagBFP (Figure 8A). Définissez un seuil à l’aide du menu déroulant Image > Ajuster > seuil pour marquer les peroxysomes (figure 8B).</li>
		<li>Sélectionnez Analyser > Analyser les particules pour déterminer les régions exactes des peroxysomes illuminés. ImageJ enregistre ces régions d’intérêt (ROI) dans le gestionnaire de ROI (Figure 8C).</li>
		<li>Cliquez sur Dupliquer pour sélectionner le canal EGFP permettant d’analyser le signal de fluorescence de Ub, p62 ou LC3B conjugué EGFP (Figure 8D). Sélectionnez tous les ROI dans le Gestionnaire de ROI (Figure 8E).</li>
		<li>Appliquer Mesure dans le gestionnaire de retour sur investissement pour mesurer les signaux EGFP sur les peroxysomes (Figure 8E). Trouvez la valeur de la surface et de la densité intégrée (la somme de toutes les intensités de pixels) pour chaque retour sur investissement dans le tableau Résultats (Figure 8E).</li>
		<li>Pour obtenir les intensités moyennes de fluorescence EGFP à différents moments après l’éclairage, divisez l’intensité EGFP intégrée par la surface totale des peroxysomes éclairés (PMP34-TagBFP signal positif et HaloTag signal négatif du ligand). Pour obtenir le signal accumulé sur les peroxysomes, soustrayez l’intensité moyenne à un point temporel par l’intensité moyenne au temps = 0, puis normalisez par l’intensité moyenne au temps = 0.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Endommager globalement tous les peroxysomes (dans chaque cellule) sur une boîte de culture
<ol><li>Effectuer l’étape 1 (préparation des cellules exprimant le diKillerRed [diKillerRed-VKSKL] ou le SLP [SLP-VKSKL]) et l’étape 2 (coloration des peroxysomes avec le ligand SLP [pour la production de ROS activée par la lumière]).</li>
	<li>Après 1 h de coloration du ligand marqué TMR, retirer le milieu de coloration et ajouter 1 mL de milieu de culture contenant 30 mM de 3-AT (3-amino-1,2,4-triazole; un inhibiteur de la catalase). REMARQUE: La catalase est un piégeur ROS exprimé dans la lumière du peroxysome, de sorte que le traitement 3-AT aide à augmenter les dommages oxydatifs induits par la lumière sur les peroxysomes.</li>
	<li>Placez le plat de culture au-dessus d’une LED (555-570 nm). Illuminer toutes les cellules avec une densité de puissance de 1,8 W/cm2 pendant 9 h dans un incubateur. REMARQUE: Pour effectuer cette étape à l’extérieur d’un incubateur, placez la capsule de culture sur une plaque chauffante à 37 ° C. Ajouter 20 mM HEPES au milieu contenant du 3-AT et couvrir la capsule de culture d’un film transparent pour minimiser les échanges gazeux. HEPES est un agent tampon qui maintient le pH physiologique dans la culture cellulaire à l’extérieur d’un incubateur de CO2 pendant l’éclairage LED.</li>
	<li>Valider le succès des dommages causés par les LED en imageant les signaux EGFP-Ub, EGFP-p62 ou EGFP-LC3B sur les peroxysomes. En utilisant la condition d’éclairage décrite ci-dessus, 82% des cellules SHSY5Y exprimant de manière stable HaloTag-VKSKL présentaient une pexophagie médiée par Stub1.</li>
	<li>Récolter les cellules pour l’analyse biochimique en aval.</li>
</ol>

<ol><li>Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+interplay+between+peroxisomes+and+other+subcellular+organelles+including+mitochondria+and+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83(2016).</li>
<li>He, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetyl-CoA+derived+from+hepatic+peroxisomal+%CE%B2-oxidation+inhibits+autophagy+and+promotes+steatosis+via+mTORC1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation.</a> Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).</li>
<li>Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomal+dysfunction+in+age-related+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Peroxisomal dysfunction in age-related diseases.</a> Trends in Endocrinology & Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).</li>
<li>Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFransen%2C+M+%22Peroxisomes+and+their+Key+Role+in+Cellular+Signaling+and+Metabolism%22">Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism</a>. 69, Springer. Dordrecht, the Netherlands. 45-65 (2013).</li>
<li>Puri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasma+lipidomic+signature+of+nonalcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).</li>
<li>Law, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+peroxisomal+AAA+ATPase+complex+prevents+pexophagy+and+development+of+peroxisome+biogenesis+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).</li>
<li>Nazarko, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pexophagy+is+responsible+for+65%25+of+cases+of+peroxisome+biogenesis+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).</li>
<li>Eberhart, T., Kovacs, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pexophagy+in+yeast+and+mammals%3A+An+update+on+mysteries%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries.</a> Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).</li>
<li>Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -C., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+and+physiological+role+of+pexophagy%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism and physiological role of pexophagy.</a> FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).</li>
<li>Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pexophagy%3A+The+selective+degradation+of+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 512721(2012).</li>
<li>Germain, K., Kim, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pexophagy%3A+A+model+for+selective+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pexophagy: A model for selective autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578(2020).</li>
<li>Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+signals+autophagic+degradation+of+cytosolic+proteins+and+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).</li>
<li>Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane+peroxin+PEX3+induces+peroxisome-ubiquitination-linked+pexophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy.</a> Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).</li>
<li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export-deficient+monoubiquitinated+PEX5+triggers+peroxisome+removal+in+SV40+large+T+antigen-transformed+mouse+embryonic+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts.</a> Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATM+functions+at+the+peroxisome+to+induce+pexophagy+in+response+to+ROS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS.</a> Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).</li>
<li>Chen, B. -H., Chang, Y. -J., Lin, S., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsc70%2FStub1+promotes+the+removal+of+individual+oxidatively+stressed+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 5267(2020).</li>
<li>Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+controlled+induction+of+autophagy-mediated+lysosome+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover.</a> Nature Communications. 4, 2111(2013).</li>
<li>Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryo-electron+tomography+workflow+reveals+protrusion-mediated+shedding+on+injured+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane.</a> Science Advances. 7 (13), eabc6345(2021).</li>
<li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+controlled+initiation+of+parkin-mediated+mitophagy+within+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells.</a> Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).</li>
<li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bit-by-bit+autophagic+removal+of+parkin-labelled+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria.</a> Nature Communications. 4, 2428(2013).</li>
<li>Los, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HaloTag%3A+A+novel+protein+labeling+technology+for+cell+imaging+and+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis.</a> ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).</li>
<li>Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+monitoring+of+subcellular+redox+dynamics+in+living+mammalian+cells+using+RoGFP2-based+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).</li>
<li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+limitations+in+the+use+of+KillerRed+for+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Ce protocole détaille comment déclencher la pexophagie médiée par Stub1 dans les cultures cellulaires en élevant les niveaux de ROS peroxysomaux avec de la lumière. Comme le protocole repose sur la génération de ROS assistée par colorant, il faut s’assurer d’une expression suffisante de la coloration du ligand SLP marqué par diKillerRed-VKSKL ou colorant dans les cellules d’intérêt. Étant donné que différents types de cellules ou de cellules de différents antécédents génétiques peuvent abriter des peroxysomes aux proprié...

Les peroxysomes sont des organites à membrane unique présents dans la plupart des cellules eucaryotes. Les peroxysomes sont un compartiment métabolique essentiel pour effectuer la bêta-oxydation des acides gras à très longue chaîne, le catabolisme purique, et la synthèse des phospholipides éthers et des acides biliaires1. L’acétyl-CoA dérivé du peroxysome contrôle l’homéostasie lipidique en régulant la signalisation centrale dans le métabolisme2. Par conséquent, il n’est pas surprenant que des fonctions peroxysomiques compromises soient impliquées dans diverses maladies, notamment les troubles neurodégénératifs, le vieillissement, les cancers, l’obésité et le diabète 3,4,5. Un processus essentiel dans le maintien du fonctionnement peroxysomal est la pexophagie. La pexophagie est un processus catabolique pour le renouvellement sélectif des peroxysomes par autophagie. Les cellules utilisent la pexophagie pour aider à contrôler la quantité et la qualité des peroxysomes, assurant ainsi une fonction peroxysomale appropriée. Une étude récente a démontré que la perte de peroxysomes causée par des mutations des facteurs de biogenèse peroxysomale PEX1 1 et 6 résulte d’une pexophagie6 non contrôlée. Notamment, 65% de tous les patients atteints de trouble de biogenèse des peroxysomes (PBD) présentent des déficiences dans le complexe peroxysomal AAA ATPase, composé de PEX1, PEX6 et PEX26 dans les cellules de mammifères7.
Un certain nombre de méthodes peuvent être utilisées pour initier et étudier la pexophagie. Chez la levure, la pexophagie est déclenchée lorsque les nutriments fournis passent de sources de carbone dépendantes des peroxysomes à des sources de carbone indépendantes des peroxysomes (pour réduire le nombre de peroxysomes cellulaires)8. Par exemple, le transfert de cellules de Pichia pastoris cultivées au méthanol du milieu méthanol au milieu glucose et au milieu éthanol induit respectivement la micropexophagie et la macropexophagie, respectivement 8,9,10. La micropexophagie séquestre les peroxysomes regroupés pour les dégrader en remodelant la vacuole pour former des membranes de séquestration vacuolaire en forme de coupe et une structure en forme de couvercle appelée appareil membranaire spécifique à la micropexophagie (MIPA). Dans la macropexophagie, les peroxysomes individuels sont engloutis par des structures à double membrane appelées pexophagosomes, suivies d’une fusion avec la vacuole pour la dégradation 8,9,10. La phosphorylation des récepteurs de pexophagie, tels que Atg36p chez Saccharomyces cerevisiae et Atg30p chez Pichia pastoris, est essentielle pour que les récepteurs recrutent la machinerie autophagie centrale et facilitent le ciblage peroxysomal des autophagosomes 8,11.
Dans les cellules de mammifères, la pexophagie peut être induite par ubiquitination. Le marquage des protéines membranaires peroxysomiques PMP34 ou PEX3 avec de l’ubiquitine du côté cytosolique induit la pexophagie12. La surexpression de PEX3 induit l’ubiquitination des peroxysomes et l’élimination des peroxysomes par les lysosomes13. De plus, la fusion de PEX5 avec un EGFP C-terminal nuit à l’exportation de PEX5 monoubiquitiné et aboutit à la pexophagie14. D’autre part, la pexophagie peut également être déclenchée par un traitement H2O2. Les peroxysomes produisent des espèces réactives de l’oxygène (ROS); plus précisément, l’enzyme peroxysomale Acox1, qui catalyse l’étape initiale de la bêta-oxydation des acides gras à très longue chaîne (carbone > 22), produit non seulement de l’acétyl-CoA mais aussi des ROS peroxysomaux. En réponse aux niveaux accrus de ROS sous traitement H2O2, les cellules de mammifères activent la pexophagie pour réduire la production de ROS et atténuer le stress. Il a été rapporté que le traitementH2O2entraîne le recrutement de l’ataxie-télangiectasie mutée (ATM) en peroxysomes. ATM phosphoryle ensuite PEX5 pour favoriser le renouvellement peroxysomal par pexophagie15.
Étant donné que les peroxysomes sont des centres générateurs de ROS, ils sont également sujets aux dommages causés par les ROS. Les lésions peroxysomiques provoquées par les ROS forcent les cellules à activer la pexophagie pour initier des voies de contrôle de la qualité des peroxysomes (élimination du peroxysome endommagé par autophagie). Ici, nous décrivons une approche pour le déclenchement à la demande de lésions peroxysomiques provoquées par les ROS. Le protocole tire parti de la production de ROS activées par la lumière dans les organites 16,17,18,19,20 (Figure 1). Les peroxysomes marqués au colorant sont éclairés, ce qui entraîne la production de ROS dans la lumière peroxysomale, ce qui déclenche spécifiquement des lésions peroxysomales. En utilisant ce protocole, il est démontré que les peroxysomes soumis à un stress ROS sont éliminés par une voie de dégradation dépendante de l’ubiquitine. Les peroxysomes stressés par les ROS recrutent l’ubiquitine E3 ligase Stub1 pour permettre leur immersion dans les autophagosomes pour leur élimination individuelle par pexophagie16. On peut utiliser ce protocole pour comparer le sort des peroxysomes blessés et sains dans la même cellule par microscopie accélérée. La méthode peut également être utilisée pour endommager globalement tous les peroxysomes (dans toutes les cellules) sur une boîte de culture, permettant l’analyse biochimique de la voie pexophagie.

<table><tbody><tr><td>Boîte de culture de 35 mm avec un micropuits en verre de 20 mm de diamètre&nbsp ;</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>20 mm à fond de verre</td></tr><tr><td>3-amino-1,2,4-triazole (3-AT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>sérum bovin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16170060</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur de culture cellulaire</td><td>Nuaire</td><td>NU-4750</td><td></td></tr><tr><td>diKillerRed-PTS1</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>réalisé en ajoutant le dimère tandem KillerRed avec PTS1(VKSKL)</td></tr><tr><td>Milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Mélange de milieux et de nutriments modifiés Dulbecco’s F-12 (DMEM/F-12)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>pEGFP-C1</td><td>L’épine dorsale de l’EGFP-C1 a été utilisée pour le clonage de EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62</td></tr><tr><td>EGFP-Hsp70</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>Gène Hsp70 (HSPA1A) : PCR amplifié à partir de l’ADNc HeLa et cloné en EGFP-C1</td></tr><tr><td>EGFP-LC3B</td><td>Addgene</td><td>11546</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-p62</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>généré par insertion du gène SQSTM1 humain (par amplification PCR de l’ADNc de la cellule HeLa) dans EGFP-C1</td></tr><tr><td>EGFP-Stub1</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>généré par insertion du gène Stub1 de souris (par amplification par PCR de l’ADNc total du rein de souris) dans EGFP-C1</td></tr><tr><td>EGFP-Ub</td><td>Addgene</td><td>11928</td><td></td></tr><tr><td>sérum fœtal bovin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>HaloTag TMR ligand&nbsp ;</td><td>Promega</td><td>G8252</td><td></td></tr><tr><td>HaloTag-PTS1</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>PTS1 ajouté et cloné dans le squelette EGFP-C1</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal inversé&nbsp ;</td><td>Olympus</td><td>FV3000RS</td><td>microscope Ex 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex, avec un incubateur à chambre TOKAI HIT et l’embout de parabole UNIV2-D35</td></tr><tr><td>Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand</td><td>Promega</td><td>GA1120</td><td></td></tr><tr><td>LED</td><td>VitaStar</td><td>PAR64</td><td>80 W, 555-570 nm</td></tr><tr><td>lipofectamine 2000&nbsp ;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668</td><td>réactif de transfection</td></tr><tr><td>NIH3T3 cellule</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td> adhérent <td>ThermoFisher Scientific</td><td>319850</td><td>milieu sérique réduit</td></tr><tr><td>pénicilline/streptomycine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>PMP34-TagBFP</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>PMP34 PCR amplifiée à partir d’ADNc HeLa et clonée intoTagBFP-C (Evrogen FP171)</td></tr><tr><td>roGFP2-PTS1</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>généré par l’ajout d’eroGFP (tiré du plasmide Addgene 20131) avec la séquence d’acides aminés VKSKL, et cloné dans la cellule EGFP-C1</td></tr><tr><td>SHSY5Y</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td>adhérente</td></tr></tbody></table>

surveillance de la pexophagie médiée par stub1

Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy

Les cellules de mammifères peuvent retourner les peroxysomes par pexophagie médiée par Stub1. La voie permet potentiellement le contrôle cellulaire de la quantité et de la qualité des peroxysomes. Au cours de ce processus, la protéine de choc thermique 70 et l’ubiquitine E3 ligase, Stub1, se transloquent sur les peroxysomes pour être retournés pour initier la pexophagie. L’activité de la ligase Stub1 permet l’accumulation d’ubiquitine et d’autres modules liés à l’autophagie sur des peroxysomes ciblés. L’élévation des niveaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans la lumière peroxysomale peut activer la pexophagie médiée par Stub1. On peut donc utiliser la génération de ROS assistée par colorant pour déclencher et surveiller cette voie. Cet article décrit les procédures d’utilisation de deux classes de colorants, les protéines fluorescentes et les fluorophores synthétiques, pour initier la pexophagie dans les cultures de cellules de mammifères. Ces protocoles basés sur la génération de ROS assistés par colorant peuvent non seulement être utilisés pour cibler tous les peroxysomes au sein d’une population cellulaire à l’échelle mondiale, mais peuvent également permettre la manipulation de peroxysomes individuels dans des cellules individuelles. Nous décrivons également comment la pexophagie médiée par Stub1 peut être suivie à l’aide de la microscopie à cellules vivantes.

Le schéma d’induction de la pexophagie médiée par Stub1 illustré ici tire parti de la génération de ROS assistée par colorant dans la lumière du peroxysome. Cette opération nécessite des intensités lumineuses minimales. Les peroxysomes contenant des protéines fluorescentes ou des colorants peuvent donc être éclairés à l’aide de microscopes confocaux standard à balayage laser. L’éclairage focal conduit à une production instantanée et localisée de ROS dans les peroxysomes individuels, comme indiqué par le rapporteur fluore...

Ce protocole fournit des instructions pour déclencher et surveiller la pexophagie médiée par Stub1 dans les cellules vivantes.

Surveillance de la pexophagie médiée par Stub1

Mammalian cells can turn over peroxisomes through Stub1-mediated pexophagy. The pathway potentially permits cellular control of the quantity and quality ...

Les peroxysomes effectuent une oxydation bêta et sont sujets aux dommages causés par les ROS. Cette méthode permet d’étudier comment les cellules traitent les peroxysomes stressés par les ROS. Ce protocole n’est pas seulement utilisé pour cibler globalement tous les peroxysomes au sein d’une population cellulaire, mais peut également permettre la manipulation des peroxysomes individuels dans des cellules individuelles.La génération de ROS assistée par colorant peut également être utilisée pour cibler les organites en dehors des peroxysomes afin de sonder la façon dont les cellules traitent les lésions des organites. Pour commencer, semer deux fois 10 à la cinquième cellule SHSY5Y humaine ou six fois 10 à la quatrième souris NIH H3T3 cellules dans 840 microlitres de milieu de culture sur des boîtes de culture de 35 millimètres à fond de verre avec un micropuits en verre de 20 millimètres de diamètre. Cultivez les cellules sous 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.Ensuite, transfectez les cellules avec les plasmides souhaités à l’aide d’un réactif de transfection ou d’une transfection cellulaire SHSY5Y. Diluer les plasmides dans 55 microlitres de DMEM/F-12 sans sérum et diluer un microlitre de réactif de transfection dans 55 microlitres de DMEM/F-12 sans sérum. Combinez l’ADN dilué avec le réactif dilué.Mélanger délicatement et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Ajouter le complexe au micropuits de 20 millimètres préalablement plaqué avec 100 microlitres de milieu de culture contenant des cellules SHSY5Y sans antibiotiques. Secouez doucement le plat d’avant en arrière.Effectuer la transfection cellulaire NIH 3T3 comme démontré précédemment, mais remplacer le milieu sérique réduit par le DMEM/F-12 sans sérum par le réactif de dilution plasmidique et de transfection. Après deux heures de transfection, retirez le milieu contenant le réactif de transfection et ajoutez un millilitre de milieu de culture frais. Incuber les cellules NIH 3T3 ou SHSY5Y à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures.Pour la production de ROS activés par la lumière, 24 heures après la transfection, retirez le milieu de culture et ajoutez 10 microlitres de ligand HaloTag TMR 200 nanomolaires ou 200 nanomolaires Janelia Fluor 646 HaloTag ligand sur le micropuits en verre de 20 millimètres. Transférez la capsule dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone et laissez-la pendant une heure pour colorer les cellules. Après une heure, retirez soigneusement le milieu de coloration et ajoutez un millilitre de milieu de culture frais.Placez une antenne à fond de verre contenant les cellules souhaitées sur un microscope confocal à balayage laser équipé d’un incubateur à étage. Dans le logiciel, cliquez sur Fenêtre d’outil, choisissez Oculaire et cliquez sur le bouton DIA pour allumer la lumière transmise. Visualisez l’antenne parabolique à travers l’oculaire du microscope et mettez les cellules au point en tournant le bouton de mise au point.Choisissez LSM et cliquez sur le bouton Colore Detector Select (Sélectionner un détecteur de colorant). Double-cliquez sur les colorants souhaités dans la fenêtre contextuelle pour sélectionner les paramètres de laser et de filtre appropriés pour l’imagerie des cellules. Cliquez sur Live4x dans le panneau Live pour lancer un balayage laser rapide afin de commencer à filtrer les signaux fluorescents des cellules.Déplacez la scène à l’aide du contrôleur du joystick et localisez les cellules exprimant le milieu diKillerRed VKSKL ou SLP-VKSKL pour appliquer une contrainte ROS sur les peroxysomes. Acquérir une image de la cellule souhaitée. Cliquez sur Fenêtre d’outil et choisissez LSM Stimulation.Cliquez ensuite sur le bouton ellipse et dans la fenêtre Live Image, utilisez la souris pour dessiner un ROI de 15 micromètres de diamètre contenant les peroxysomes souhaités auxquels la contrainte ROS sera appliquée. Pour appliquer une contrainte ROS, utilisez 561 nanomètres pour les cellules avec le ligand diKillerRed VKSKL ou SLP marqué TMR et utilisez 640 nanomètres pour les cellules colorées avec le ligand SLP marqué Janelia Fluor 646. Sélectionnez la longueur d’onde laser pour appliquer la contrainte ROS.Entrez le pourcentage laser souhaité et la durée. Pour la production de ROS dans les peroxysomes, cliquez sur Acquérir puis sur le bouton Stimulation pour lancer le balayage avec 561 ou 640 nanomètres de lumière à travers les ROI pendant 30 secondes chacun. Cette stimulation correspond à des réglages de puissance laser d’environ 5% pour 561 et 640 nanomètres.Après 30 secondes d’éclairage laser, les peroxysomes dans les ROI perdent leurs signaux diKillerRed VKSKL, TMR ou Janelia Fluor 646. Cette perte de signal permet de distinguer les peroxysomes éclairés et non éclairés à l’intérieur de la cellule. Pour surveiller les cellules vivantes pexophages, suivez la translocation de Stub1, Hsp70, ubiquitine, p62 ou LC3B marqués EGFP sur les peroxysomes éclairés ou stressés par ROS par imagerie accélérée en utilisant des intervalles de 10 minutes entre les images.L’éclairage focal conduit à une production instantanée et localisée de ROS dans les peroxysomes individuels, comme indiqué par le rapporteur fluorescent roGFP2-VKSKL. L’image diKillerRed VKSKL a été prise après que toutes les mesures roGFP2-VKSKL aient été effectuées pour indiquer l’emplacement des peroxysomes endommagés. Les données montrent également que les peroxysomes non éclairés ne sont pas affectés, ce qui indique la précision de la méthodologie.Cette méthodologie a été utilisée pour surveiller la pexophagie médiée par Stub1. Au cours de ce processus, Hsp70, Stub1, les protéines ubiquitinées, les adaptateurs d’autophagie p62 et LC3B apparaissent par la suite dans les peroxysomes stressés par les ROS pour entraîner la pexophagie. En utilisant la même stratégie, il a été possible d’endommager simultanément tous les peroxysomes sur une boîte de culture pour la caractérisation biochimique de la pexophagie médiée par Stub1.Avant l’éclairage LED, la fluorescence EGFP-ubiquitine était homogène dans le cytoplasme et ne colocalisait pas avec les peroxysomes. Après neuf heures d’éclairage LED, les signaux EGFP-ubiquitine se sont accumulés sur tous les peroxysomes dans les cellules cultivées dans une boîte confocale. En utilisant ce protocole, nous avons constaté que les peroxysomes stressés par les ROS sont éliminés par une voie de dégradation dépendante de l’ubiquitine.Les peroxysomes stressés par les ROS recrutent l’ubiquitine E3 ligase Stub1 pour permettre leur élimination par pexophagie.

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Procédé pour surveiller l'activité ubiquitine-protéasome dans les cellules vivantes est décrit. Un degron-GFP déstabilisée-(GFP-dgn) et une protéine de fusion GFP-stable dgnFS sont générés et transduites dans la cellule en utilisant un vecteur d'expression lentiviral. Cette technique permet de générer une lignée stable de cellules exprimant GFP-dgn/GFP-dgnFS dans lequel l'activité ubiquitine-protéasome peut être facilement évaluée en utilisant épifluorescence ou la cytométrie en flux.

Suivi de l&#39;activité ubiquitine-protéasome dans les cellules vivantes aide d&#39;un Degron (dgn)-déstabilisé Green Fluorescent Protein Reporter Protéines (GFP) à base de

Une méthode pratique et puissante pour étudier l’autophagie chez Penicillium chrysogenum en utilisant des coussinets de famine (mélanges d’agarose et d’eau du robinet dans une lame de microscope contenant une cavité centrale) est présentée ici.

Analyse de l&#39;autophagie dans<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; À l&#39;aide de famine Pads en association avec microscopie de fluorescence

Ici, nous décrivons en détail une approche de microscopie vidéo en accéléré pour mesurer le recrutement temporel d’EYFP-Parkin lors de l’élimination sélective des mitochondries endommagées. Ce processus dynamique d’élimination des mitochondries endommagées dépendante de l’EYFP-Parkin peut être utilisé comme indicateur de la santé cellulaire dans différentes conditions expérimentales.

Time-Lapse Video Microscopy pour l&#39;évaluation de EYFP-Parkin Agrégation comme un marqueur pour Cellular Mitophagy

Mitophagy, le processus de compensation endommagée mitochondries, est nécessaire au maintien de l’homéostasie et de la santé mitochondriale. Cet article présente certaines de la mitophagy dernière méthodes de détection dans les cellules humaines, Caenorhabditis eleganset la souris.

In Vitro et In Vivo la détection des Mitophagy dans les cellules humaines, C. Eleganset la souris

Ce protocole décrit une méthode pour l'analyse quantitative de la formation complexe de protéine de mitophagie spécifiquement dans les cellules bêta des échantillons humains primaires d'islet. Cette technique permet ainsi l'analyse de la mitophagie à partir de matériel biologique limité, qui sont cruciaux dans les échantillons précieux de cellules bêta pancréatiques humaines précieuses.

Visualisation des complexes mitophatonus endogènes in situ dans les cellules bêta pancréatiques humaines utilisant l'analyse de la ligation de proximité

Les endosomes de recyclage font partie du réseau tubulaire endosomal. Nous présentons ici une méthode pour quantifier la dynamique du recyclage des endosomes en utilisant GFP-STX13 comme marqueur d’organite.

Le test basé sur la microscopie pour étudier et analyser les endosomes de recyclage à l’aide du trafic SNARE

L’exploration de la mitophagie par microscopie électronique, capteurs génétiques et immunofluorescence nécessite un équipement coûteux, du personnel qualifié et un investissement en temps important. Ici, nous démontrons l’efficacité d’un kit de colorant de fluorescence commercial pour quantifier le processus de mitophagie à la fois chez Caenorhabditis elegans et dans une lignée cellulaire de cancer du foie.

Détection de la mitophagie chez Caenorhabditis elegans et des cellules de mammifères à l’aide de colorants spécifiques aux organites

La lipophagie est une forme sélective d’autophagie qui implique la dégradation des gouttelettes lipidiques. Les dysfonctionnements dans ce processus sont associés au développement du cancer. Cependant, les mécanismes précis ne sont pas encore entièrement compris. Ce protocole décrit des approches d’imagerie quantitative pour mieux comprendre l’interaction entre l’autophagie, le métabolisme des lipides et la progression du cancer.

Explorer la régulation du catabolisme des gouttelettes lipidiques par la lipophagie

Ici, nous présentons la méthodologie permettant d’évaluer de manière concise les niveaux de marqueurs d’autophagosomes LC3-II dans les vésicules extracellulaires (VE) par immunoblottage. L’analyse des niveaux de LC3-II dans les VE, la formation d’autolysosomes et la formation d’omégasomes suggère le nouveau rôle de STX6 dans la libération de VE LC3-II positifs lorsque la fusion autophagosome-lysosome est inhibée.

Évaluation de la libération de LC3-II via les vésicules extracellulaires en relation avec l’accumulation de vésicules intracellulaires LC3-positives

Les sondes PeroxiSPY sont utilisées pour détecter les peroxysomes dans les cellules de mammifères. Ici, nous montrons comment utiliser les sondes pour colorer les peroxysomes dans des cellules vivantes et fixes.

Coloration par peroxysome dans les cellules de mammifères à l’aide de sondes spécifiques aux peroxysomes

Découvrez une méthode d'imagerie en direct pour surveiller la pexophagie médiée par Stub1 dans les cellules SHSY5Y et NIH 3T3. Cette technique permet d'étudier la dégradation des peroxysomes stressés par les ROS et le contrôle qualité des organites.

Surveillance de la pexophagie médiée par Stub1

Explorer plus de vidéos