Analyse de la calcification vasculaire extracellulaire à médiation vésiculaire à l’aide de modèles in vitro et in vivo

Ce protocole fournit une méthode qui peut être utilisée pour aider à évaluer et, à l’avenir, à développer des traitements pour la calcification vasculaire, qui est le prédicteur le plus important de maladie cardiovasculaire. La capacité d’isoler les VE nous permet d’étudier plus avant les mécanismes qui conduisent à la calcification vasculaire et au changement phénotypique des cellules musculaires lisses vasculaires. Cette technique donne un aperçu des mécanismes moléculaires précoces de la calcification médiée par les cellules musculaires lisses vasculaires.

Comprendre cela permet d’étudier les options thérapeutiques pour le mécanisme compris. Tous les véhicules électriques d’intérêt peuvent être étudiés à l’aide de cette méthode. Il n’est pas exclusif aux cellules musculaires lisses vasculaires, aux ostéoblastes ou à la calcification vasculaire.

Après avoir euthanasié la souris, soulevez la peau à l’aide d’une pince à épiler et faites une incision le long de la ligne médiane. Enlevez tout excès de peau ou de graisse. Ensuite, retirez les organes reproducteurs, la vessie et la graisse à l’extérieur de la ligne médiane.

Ensuite, déplacez les organes gastro-intestinaux vers la droite et suivez les intestins dans la ligne médiane. Une fois trouvé, soulevez la ligne médiane et excisez le tractus gastro-intestinal jusqu’à l’estomac. Extrayez les reins en les soulevant loin de la ligne médiane.

Couper le plus près possible du rein. Enlevez le foie en soulevant les lobes et en coupant loin de la ligne médiane. Ensuite, perfusez le cœur et l’aorte en injectant du PBS froid dans le ventricule droit à l’aide d’une seringue de 10 millilitres.

Attendez que les poumons se gonflent et deviennent blancs. Retirez les poumons et tout excès de diaphragme ou de cage thoracique. Pour retirer l’os, ouvrez une paire de ciseaux en grand et placez-les dans la partie inférieure de la souris au-dessus de la queue.

Couper vers le bas, soulever la colonne vertébrale de la peau et enlever la graisse des côtés de la ligne médiane. Une fois que la peau est détachée, excisez la colonne vertébrale et les organes intacts en coupant juste au-dessus du cœur. Placez la colonne vertébrale et les organes intacts dans un bécher de PBS dans le seau à glace si vous les transportez vers un stéréoscope.

Après avoir déplacé la colonne vertébrale et les organes dans le plat de dissection, remplissez-le de PBS glacé et épinglez la colonne vertébrale et la cage thoracique à l’aide d’aiguilles. Sous le microscope à dissection, soulevez le cœur avec précaution à l’aide d’une pince à épiler et commencez à couper au-dessus de la colonne vertébrale et sous l’aorte. Continuez jusqu’à ce que le bas de la colonne vertébrale soit atteint.

Retirez la colonne vertébrale du plat à disséquer et épinglez le cœur et toute graisse ou muscle étranger. En partant de la zone située juste en dessous du cœur, identifiez l’œsophage, la veine cave et l’aorte. Retirez l’œsophage et la veine cave pour avoir un champ visuel clair de l’aorte.

À l’aide de la pince à micro-dissection et des ciseaux, commencez à soulever le tissu adipeux et coupez le plus près possible de l’aorte. Continuez ainsi le long de la ligne médiale jusqu’à ce que toutes les artères de l’aorte et du fémur soient exposées. Au cœur, retirez tout le tissu adipeux exposant les trois branches de l’arc aortique.

Retirez la racine aortique du ventricule gauche en insérant les ciseaux de micro-dissection dans le ventricule gauche et en coupant le muscle entourant l’aorte. Une fois l’aorte isolée et nettoyée, imagez l’aorte à l’aide d’un scanner proche infrarouge pour visualiser la calcification vasculaire. À l’aide du script MATLAB personnalisé, quantifiez le signal total du traceur calcique normalisé à la surface totale de l’aorte balayée.

Dirigez le MATLAB vers l’emplacement des fichiers TIF à partir de l’analyse proche infrarouge des aortes, ouvrez les fichiers individuels et extrayez les valeurs d’intensité en pixels des fichiers TIF. Sélectionnez l’aorte avec la plus grande calcification comme échelle maximale sur l’image mappée en couleur. Lorsque la commande Combien de spécimens sont dans l’image apparaît dans la fenêtre, entrez le nombre d’aortes dans l’image actuelle et sélectionnez chaque aorte une par une.

Une fois l’aorte sélectionnée, MATLAB crée des images binaires avec un masque de la surface totale et de la zone calcifiée de l’aorte. Les valeurs de ces images masquées sont ensuite utilisées pour déterminer la surface calcifiée totale, la surface totale de l’aorte, le pourcentage de surface positive pour la calcification et l’intensité moyenne de la zone calcifiée. Immédiatement après avoir scanné les aortes, mettez deux à trois aortes pour obtenir une concentration suffisante en protéines.

Incuber deux à trois aortes regroupées dans 1,5 millilitre de solution digestive pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Recueillir la solution et centrifuger à 1 000 g pendant 15 minutes pour éliminer les débris cellulaires. Ensuite, pour retirer les microvésicules, centrifuger à nouveau le surnageant pendant 30 minutes à 33 000 g.

Recueillir et évaluer le surnageant pour le potentiel de calcification. Après avoir retiré les débris cellulaires du milieu collecté conditionné par centrifugation, faire tourner le surnageant recueilli à 33 000 g pendant 30 minutes. Récupérez le surnageant et transférez-le dans un nouveau tube.

Ajoutez ensuite 1% de 300 millimolaires de dihydrogénophosphate de sodium aux échantillons de vésicules extracellulaires et mélangez la solution par pipetage. Transférer 200 microlitres de la solution de mélange dans une plaque de 96 puits et incuber la plaque de 96 puits dans le lecteur de microplaques à 37 degrés Celsius. Réglez le lecteur de plaques pour enregistrer l’absorbance à une longueur d’onde de 340 nanomètres toutes les minutes.

Pipeter 300 microlitres de la solution de collagène dans chaque puits d’une chambre de verre à huit puits, et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 72 heures. Après l’incubation, ajoutez 300 microlitres de DMEM comme témoin dans les puits. Ajouter 300 microlitres des échantillons de milieu de vésicules extracellulaires prélevés précédemment dans les puits restants et incuber pendant six jours, comme démontré précédemment.

Le 10e jour, pipeter 2,5 microlitres du mélange OsteoSense et DMEM dans chaque puits et incuber pendant 24 heures. À la fin de l’incubation, imagez les hydrogels avec des filtres pour la fluorescence OsteoSense à travers le bas d’une chambre de verre à l’aide d’un microscope inversé, ou du haut avec un objectif à longue distance de travail. Évaluez le nombre de calcifications, la taille de calcification et les images collectées à l’aide des options d’analyse des particules disponibles dans ImageJ.

Accédez ensuite à Image, sélectionnez Ajuster, puis cliquez sur Seuil pour binariser les images, de sorte que seul le signal OsteoSense apparaisse en blanc. Utilisez ensuite la commande Analyser, puis cliquez sur Analyser les particules pour obtenir des informations sur chaque calcification de l’image. Utilisez les mêmes paramètres de seuil pour assurer la cohérence de chaque image analysée.

L’imagerie par scanner optique proche infrarouge des aortes disséquées a montré un signal OsteoSense plus élevé dans toute l’aorte d’une souris atteinte d’insuffisance rénale chronique que les deux aortes de souris témoins. Le milieu conditionné obtenu à partir de cellules musculaires lisses vasculaires cultivées dans un milieu pro-calcifié a montré une absorbance plus élevée à 340 nanomètres que le milieu témoin. L’augmentation de l’absorbance s’est produite 1,5 fois plus rapidement dans l’échantillon pro-calcifié que dans un échantillon témoin.

Le milieu conditionné à partir de cellules cultivées dans des conditions pro-calcifiantes contenait des dépôts minéraux. Lors de la micro-dissection de l’aorte, il est important de couper soigneusement la graisse entourant l’aorte. Vous voulez analyser autant d’aorte que possible, mais cela peut être assez fastidieux.

Une fois les VE isolés, des tests supplémentaires, tels qu’un test d’activité de la phosphatase alcaline, ou immuno-corps pourraient être effectués. Ces tests montreraient en outre les mécanismes et les protéines présents dans les VE.