Name: Analyse de la calcification vasculaire extracellulaire à médiation vésiculaire à l’aide de modèles in vitro et in vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-27T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse de la calcification vasculaire par isolation d'aortes murines et extraction de vésicules extracellulaires. Cette technique permet d'étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans la calcification des cellules musculaires lisses vasculaires.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par des subventions du National Heart, Lung, and Blood Institute des National Institutes of Health (NIH) (1R01HL160740 et 5 T32GM132054-04) et de la Florida Heart Research Foundation. Nous tenons à remercier Kassandra Gomez pour son aide dans la synthèse et l’imagerie des hydrogels.

Le travail in vivo a été approuvé et supervisé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de la Florida International University et conforme aux directives actuelles des National Institutes of Health (NIH). Pour ce protocole, la procédure ne diffère pas en fonction de la souche, du poids, de l’âge et du sexe de la souris. Le type de calcification étudié, les régimes alimentaires et les traitements peuvent modifier la durée de l’étude et le poids de la souris utilisée et peuvent dépendre d’une souche spécifique et du sexe de la souris utilisée dans l’étude. Pour ce protocole, des souris C57BL / 6J mâles et femelles ont été utilisées, et elles ont été nourries avec un régime de calcification. Les souris ont été sacrifiées entre 20 semaines et 24 semaines.
1. Isolement et excision de l’aorte
<ol><li>Marqueurs fluorescents<ol><li>Quarante-huit heures avant l’euthanasie, injectez aux souris 20 μM d’OsteoSense 680, un agent d’imagerie fluorescent, à la dose recommandée de 100 μL par 25 g par injection intraveineuse.</li>
		<li>Sous la hotte, placez un panneau de polystyrène expansé muni de quatre épingles en T, un seau tapissé d’une serviette en papier, un tube de 50 ml rempli d’une serviette en papier, un tube à microcentrifugeuses de 1,5 mL, des outils de dissection (voir le tableau des matières) et de l’éthanol dans un vaporisateur. Placez les béchers avec PBS sur la glace.</li>
	</ol></li>
	<li>Prise de sang<ol><li>Ajouter 2 mL d’isoflurane dans un tube conique de 50 mL bourré avec le papier absorbant. Placez le tube dans le seau et fermez-le avec son couvercle. MISE EN GARDE : L’isoflurane doit être manipulé dans un espace bien ventilé sans recirculation de l’air évacué en raison de la toxicité d’une exposition à court terme.</li>
		<li>Transférez une souris dans le compartiment à la fois. Une fois sous sédation, placez la souris sur la serviette en papier en position dorsale. En tenant la souris avec la paume de la main non dominante, placez les oreilles en arrière à l’aide du pouce et du doigt pointeur.</li>
		<li>À l’aide de la pince à épiler, excisez l’un des yeux. Tenez la souris au-dessus du tube de 1,5 mL pour commencer le prélèvement sanguin, au cours duquel 1 mL de sang doit être prélevé. Une fois que le sang cesse de s’écouler, replacez la souris dans le seau pour une sédation supplémentaire.</li>
	</ol></li>
	<li>Euthanasie<ol><li>Placez une serviette en papier sur le tapis de dissection. Une fois la souris sous sédation, placez-la sur le tapis en décubitus dorsal. Fixez la souris en décubitus dorsal à l’aide d’une broche en T pour maintenir chaque membre enfoncé.</li>
		<li>Vaporisez de l’alcool sur l’abdomen de la souris. À l’aide de la pince à épiler, soulevez la peau au niveau de la région thoracique. Avec les ciseaux, coupez la ligne médiale dans la cavité thoracique. Une fois que le sternum a été coupé au centre, coupez le diaphragme de chaque côté de la cage thoracique.</li>
		<li>Si nécessaire, coupez la partie frontale de la cage thoracique pour exposer le cœur et les poumons.</li>
	</ol></li>
	<li>Prélèvement d’organes<ol><li>À l’aide d’une pince à épiler, soulevez la peau et faites une incision le long de la ligne médiane. Enlevez tout excès de peau ou de graisse. Retirez les organes reproducteurs et la vessie, ainsi que toute graisse à l’extérieur de la ligne médiane.</li>
		<li>Déplacez les organes gastro-intestinaux (GI) vers la droite et suivez les intestins dans la ligne médiane. Une fois trouvé, soulevez la ligne médiane et excisez le tractus gastro-intestinal jusqu’à l’estomac.</li>
		<li>Extrayez les reins en les soulevant loin de la ligne médiane. Couper le plus près possible du rein.</li>
		<li>Ensuite, commencez l’ablation du foie en soulevant les lobes et en coupant loin de la ligne médiane.</li>
		<li>Perfuser le cœur et l’aorte. À l’aide d’une seringue de 10 mL, injecter du PBS froid dans le ventricule droit. Attendez que les poumons se gonflent et deviennent blancs. Retirez les poumons, ainsi que tout excès de diaphragme ou de cage thoracique.</li>
	</ol></li>
	<li>Ablation osseuse<ol><li>Ouvrez une paire de ciseaux en grand et placez-les dans la partie inférieure de la souris au-dessus de la queue. Coupez vers le bas et commencez à soulever la colonne vertébrale de la peau. Enlevez la graisse des côtés de la ligne médiane. Une fois que la peau est détachée, excisez la colonne vertébrale et les organes intacts en coupant juste au-dessus du cœur. Si vous transportez vers un stéréoscope, placez la colonne vertébrale et les organes intacts dans un bécher de PBS dans le seau à glace.</li>
		<li>Déplacez la colonne vertébrale et les organes dans le plat de dissection. Remplir de PBS glacé. Épinglez la colonne vertébrale et la cage thoracique à l’aide d’aiguilles.</li>
		<li>Sous le microscope à dissection, utilisez une pince à épiler pour soulever le cœur avec précaution et commencez à couper au-dessus de la colonne vertébrale et sous l’aorte. Continuez jusqu’à ce que le bas de la colonne vertébrale soit atteint. Retirez la colonne vertébrale du plat de dissection et épinglez le cœur et toute graisse ou muscle étranger.</li>
	</ol></li>
	<li>Microdissection<ol><li>En partant de la zone située juste en dessous du cœur, identifiez les trois structures tubulaires: l’œsophage, la veine cave et l’aorte. Retirez l’œsophage et la veine cave pour avoir un champ visuel clair de l’aorte.</li>
		<li>À l’aide de la pince à microdissection et des ciseaux, commencez à soulever le tissu adipeux et à couper le plus près possible de l’aorte. Assurez-vous de ne pas couper l’aorte. Continuez ceci le long de la ligne médiale jusqu’à ce que toutes les artères de l’aorte ainsi que les artères fémorales soient exposées.</li>
		<li>Au cœur, retirez tout le tissu adipeux, exposant les trois branches de l’arc aortique. Retirez la racine aortique du ventricule gauche en insérant les ciseaux de microdissection dans le ventricule gauche et en coupant le muscle entourant l’aorte.</li>
		<li>Une fois l’aorte isolée et nettoyée, imagez l’aorte à l’aide d’un scanner proche infrarouge pour visualiser la calcification vasculaire.</li>
		<li>Utilisez le script MATLAB personnalisé (fichier supplémentaire 1) pour quantifier le signal total du traceur de calcium, qui est normalisé à la surface totale de l’aorte scannée. Le script MATLAB fonctionne à l’aide du complément de la boîte à outils Bioinformatics. MATLAB est d’abord dirigé vers l’emplacement des fichiers TIFF à partir de l’analyse proche infrarouge des aortes, les fichiers individuels sont ensuite ouverts et les valeurs d’intensité en pixels sont extraites des fichiers TIFF.<ol><li>Une fois l’image présentée à l’utilisateur avec une carte de couleurs, sélectionnez l’aorte avec la plus grande calcification comme échelle maximale.</li>
			<li>Lorsque MATLAB demande « Combien de spécimens y a-t-il dans l’image ? » dans la fenêtre de commande, saisissez le nombre d’aortes dans l’image actuelle et sélectionnez chaque aorte une par une. Une fois l’aorte sélectionnée, MATLAB crée une image binaire avec un masque de la surface totale de l’aorte et une autre image binaire avec un masque de la zone calcifiée de l’aorte. Les valeurs de ces images masquées sont ensuite utilisées pour déterminer la surface calcifiée totale, la surface totale de l’aorte, le pourcentage de surface positive pour la calcification et l’intensité moyenne de la zone calcifiée.</li>
			<li>Pour sélectionner une aorte, créez une boîte autour de l’aorte d’intérêt sur la figure la plus récente à l’écran en sélectionnant quatre coins avec un clic gauche et en créant une boîte autour de l’image. Pour fermer la boîte, double-cliquez sur le premier coin. NOTE: Le seuil peut être différent selon le modèle de calcification utilisé. Il appartient à l’utilisateur de déterminer quelle valeur détermine un signal positif pour la calcification vasculaire. Une fois le seuil fixé pour une expérience, il doit rester le même pendant toute la durée de l’expérience.</li>
		</ol></li>
		<li>Une fois les données quantitatives extraites, effectuez une ANOVA unidirectionnelle avec le test post-hoc de Tukey pour montrer l’importance entre les groupes.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Isoler et extraire les VE des aortes
REMARQUE: Une fois que les aortes ont été isolées et enlevées, les VE peuvent être extraits du tissu. À l’aide d’une solution digestive et de plusieurs cycles de centrifugeuses, les VE peuvent être collectés et utilisés pour de nombreuses techniques différentes, y compris les tests de calcification, l’électrophorèse sur gel et l’immunoblotting13. Le protocole d’isolement et d’extraction des véhicules électriques est le suivant :
<ol><li>Immédiatement après avoir scanné les aortes, mettez deux à trois aortes pour obtenir une concentration suffisante en protéines.</li>
	<li>Préparer une solution digestive contenant 0,25 M de saccharose, 0,12 M de chlorure de sodium (NaCl), 0,01 M de chlorure de potassium (KCl), 0,02 M de chlorhydrate de tris et 600 U/mL de collagénase13.</li>
	<li>Incuber deux à trois aortes regroupées dans 1,5 mL de solution digestive pendant 2 h à 37 °C. Récupérez la solution. Centrifuger la solution à 1 000 × g pendant 15 min pour éliminer les débris cellulaires.</li>
	<li>Centrifuger le surnageant pendant 30 minutes supplémentaires à 33 000 × g pour enlever les microvésicules. Recueillir et évaluer le potentiel de calcification du surnageant (voir rubrique 3). REMARQUE: Suivez les étapes suivantes si l’électrophorèse sur gel et l’immunoblotissement des protéines des VE doivent être effectués.</li>
	<li>Ultracentrifuger le surnageant à 100 000 × g pendant 1 h pour isoler les VE d’intérêt.</li>
	<li>Pendant que le surnageant subit une ultracentrifugation, préparer la lyse RIPA et le tampon d’extraction (voir le tableau des matériaux) en ajoutant l’inhibiteur de protéase et en tourbillonnant jusqu’à dissolution.</li>
	<li>Une fois l’ultracentrifugation terminée, aspirer le surnageant, en laissant la pastille, qui contient les VE. Suspendre la pastille dans le mélange préparé de lyse RIPA et d’inhibiteur de protéase. Les échantillons sont prêts pour l’électrophorèse sur gel et le Western blotting.</li>
</ol>3. Évaluation du potentiel de calcification des vésicules extracellulaires avec absorbance de diffusion de la lumière
REMARQUE: Pour mesurer la formation minérale en temps réel des VE, nous avons utilisé un test développé à l’origine pour étudier la formation de minéraux à partir de VE de cartilage sur plaque de croissance à partir de culture cellulaire14. Étant donné que le dépôt de phosphate de calcium est la caractéristique de la calcification, une augmentation de l’absorbance de diffusion de la lumière résultant de la formation de composés de phosphate de calcium est indicative du potentiel de calcification14. In vitro Les modèles VSMC sont pratiques pour mesurer le potentiel de calcification des véhicules électriques. Dans cette technique, un lecteur de plaques avec un filtre à courte longueur d’onde peut quantifier la calcification in vitro des véhicules électriques. La valeur absorbante est enregistrée à 340 nm, et une absorbance plus élevée indique une formation minérale de phosphate de calcium plus importante. Le protocole du test d’absorbance par diffusion de la lumière est le suivant :
<ol><li>Centrifuger le milieu collecté conditionné des VSMC à 1 000 × g pendant 5 min pour éliminer les débris cellulaires14.</li>
	<li>Centrifuger le surnageant à 33 000 × g pendant 30 min, recueillir le surnageant et le transférer dans un nouveau tube. REMARQUE: La présence de VE dans le surnageant collecté peut être confirmée par diffusion dynamique de la lumière (DLS) ou analyse de suivi des nanoparticules (NTA)</li>
	<li>Préparer une solution stérile de phosphate de sodium monobasique de 300 mM (NaH2PO4). Filtrer la solution pour assurer des conditions stériles si nécessaire.</li>
	<li>Ajouter 1 % (v/v) de 300 mM NaH2PO4 aux échantillons de VE et pipeter doucement la solution pour bien mélanger. Transférer 200 μL de la solution de mélange dans une plaque de 96 puits. Incuber la plaque de 96 puits dans le lecteur de microplaques à 37 °C.</li>
	<li>Réglez le lecteur de plaques pour enregistrer l’absorbance à une longueur d’onde de 340 nm toutes les 1 min.</li>
</ol>4. Évaluation de la formation minérale de calcification des vésicules extracellulaires avec des hydrogels de collagène
NOTE: L’agrégation des VE et la formation de microcalcifications sont observées à travers les hydrogels de collagène. Ces hydrogels agissent comme un échafaudage qui imite la densité de collagène observée in vivo15. Cela démontre l’effet du collagène sur la croissance de la calcification. Le protocole d’évaluation de la formation minérale de VE dans les hydrogels est le suivant:
<ol><li>Jour 1<ol><li>Préparer une solution de collagène à 2,5 mg/mL dans du DMEM. Ajouter lentement l’hydroxyde de sodium 5 M au mélange collagène/DMEM jusqu’à ce que la couleur passe au rouge. Vérifiez que le pH de la solution est d’environ 7. REMARQUE: Si la solution devient violette et devient trop basique, redémarrez le processus.</li>
		<li>Pipeter 300 μL de la solution de collagène à 2,5 mg/mL avec un pH de 7 dans chaque puits d’un verre de chambre à 8 puits. Incuber à 37 °C et 5% CO2 humidité contrôlée pendant 72 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 4<ol><li>Ajouter 300 μL de DMEM comme témoin dans les puits.</li>
		<li>Ajouter 300 μL des échantillons de milieu EV prélevés précédemment dans les puits restants.</li>
		<li>Incuber à 37 °C et 5% CO2 d’humidité contrôlée pendant 6 jours.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 10<ol><li>Préparer 2,5 μL d’Osteosense 680EX avec 22,5 μL de DMEM.</li>
		<li>Pipeter 2,5 μL du mélange Osteosense et DMEM dans chaque puits. Incuber à 37 °C et 5% CO2 humidité contrôlée pendant 24 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 11<ol><li>Imagez les hydrogels avec des filtres appropriés pour la fluorescence Osteosense. Imagez-les à travers le bas d’une chambre de verre à l’aide d’un microscope inversé ou à partir du haut avec un objectif à longue distance de travail.</li>
		<li>Évaluez le nombre de calcifications et la taille de calcification dans les images collectées à l’aide des options d’analyse des particules disponibles dans ImageJ.<ol><li>Utiliser l’image | Ajuster | Commande de seuil pour binariser les images de sorte que seul le signal Osteosense apparaisse blanc. Utiliser l’analyse | Commande d’analyse des particules pour obtenir des informations pour chaque calcification dans l’image. Veillez à utiliser les mêmes paramètres de seuil pour chaque image analysée à des fins de cohérence.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+mediators+of+cardiovascular+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78(2017).</li>
<li>Ho, C. Y., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medial+arterial+calcification%3A+an+overlooked+player+in+peripheral+arterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Medial arterial calcification: an overlooked player in peripheral arterial disease.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (8), 1475-1482 (2016).</li>
<li>Marinelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+arterial+media+calcification+in+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiorenal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of arterial media calcification in chronic kidney disease.</a> Cardiorenal Medicine. 3 (2), 89-95 (2013).</li>
<li>Moe, S. M., Chen, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+vascular+calcification+in+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of vascular calcification in chronic kidney disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (2), 213-216 (2008).</li>
<li>Mir, B., Goettsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+delivery+vehicles+of+specific+cellular+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as delivery vehicles of specific cellular cargo.</a> Cells. 9 (7), 1601(2020).</li>
<li>Ruiz, J. L., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+calcification%3A+Current+controversies+and+novel+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular calcification: Current controversies and novel concepts.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (4), 207-212 (2015).</li>
<li>New, S. E., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+extracellular+vesicles+in+de+novo+mineralization%3A+An+additional+novel+mechanism+of+cardiovascular+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of extracellular vesicles in de novo mineralization: An additional novel mechanism of cardiovascular calcification.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 1753-1758 (2013).</li>
<li>Aikawa, E., Hutcheson, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAikawa%2C+E+%22Cardiovascular+Calcification+and+Bone+Mineralization%22">Cardiovascular Calcification and Bone Mineralization</a>. , Humana Press. Cham, Switzerland. (2020).</li>
<li>Johnson, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P-407-induced+murine+model+of+dose-controlled+hyperlipidemia+and+atherosclerosis%3A+A+review+of+findings+to+date%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The P-407-induced murine model of dose-controlled hyperlipidemia and atherosclerosis: A review of findings to date.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43 (4), 595-606 (2004).</li>
<li>Shobeiri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+calcification+in+animal+models+of+CKD%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Vascular calcification in animal models of CKD: A review.</a> American Journal of Nephrology. 31 (6), 471-481 (2010).</li>
<li>El-Abbadi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphate+feeding+induces+arterial+medial+calcification+in+uremic+mice%3A+role+of+serum+phosphorus%2C+fibroblast+growth+factor-23%2C+and+osteopontin%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Phosphate feeding induces arterial medial calcification in uremic mice: role of serum phosphorus, fibroblast growth factor-23, and osteopontin.</a> Kidney International. 75 (12), 1297-1307 (2009).</li>
<li>Veseli, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Animal models of atherosclerosis.</a> European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).</li>
<li>Chen, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transglutaminase+2+accelerates+vascular+calcification+in+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Transglutaminase 2 accelerates vascular calcification in chronic kidney disease.</a> American Journal of Nephrology. 37 (3), 191-198 (2013).</li>
<li>Wu, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+characterization+of+the+nucleational+core+of+matrix+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Physicochemical characterization of the nucleational core of matrix vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4404-4411 (1997).</li>
<li>Hutcheson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genesis+and+growth+of+extracellular-vesicle-derived+microcalcification+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques.</a> Nature Materials. 15 (3), 335-343 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Lors de l’exécution du protocole, il est important de noter les étapes critiques pour obtenir des résultats positifs. Lors de l’isolement de l’aorte murine, il est essentiel que la perfusion soit effectuée correctement. Lors de l’injection du PBS, il faut veiller à ne pas percer le ventricule droit. Cela provoquerait une fuite du liquide directement hors du ventricule et ne parviendrait pas à circuler dans les poumons, laissant du sang dans l’aorte. Une fois que la perfusion a été effectuée correctement et que la microdi...

La calcification est le prédicteur le plus significatif de la mortalité et de la morbidité par maladie cardiovasculaire1. La calcification modifie la mécanique de la paroi artérielle en raison de l’accumulation de minéraux de calcium et de phosphate2. Dans l’athérosclérose, la calcification peut exacerber le stress local et entraîner la rupture de la plaque, qui est la principale cause de crises cardiaques. La calcification médiale, souvent due à une maladie rénale chronique, est plus répandue et entraîne un raidissement artériel important, un dysfonctionnement et une surcharge cardiaque 2,3. Actuellement, il n’existe aucune option thérapeutique pour le traitement ou la prévention de la calcification vasculaire.
Les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC) adoptent un phénotype semblable à celui des ostéoblastes et libèrent des vésicules extracellulaires calcifiantes (VE) qui nucléent les minéraux naissants, entraînant ainsi la calcification 4,5,6. Ce processus ressemble à la minéralisation physiologique des ostéoblastes dans l’os7. Bien que le critère d’évaluation de la minéralisation soit similaire dans la paroi vasculaire et la matrice osseuse, les mécanismes par lesquels les VE calcifiants proviennent diffèrent dans les deux tissus8. Il existe de nombreux types de modèles utilisés pour étudier la calcification vasculaire. In vitro, les modèles de culture cellulaire imitent la transition ostéogénique des VSMC et la formation subséquente de minéraux avec des milieux spécialisés.
Lors de l’étude de la calcification in vivo, le modèle utilisé dépend du type de calcification étudié. Des modèles murins hyperlipidémiques sont souvent utilisés pour étudier la calcification athéroscléreuse, qui apparaît plus focale dans les plaques riches en lipides9. En revanche, la calcification médiale est plus répandue dans tout le système vasculaire et est souvent étudiée à l’aide de modèles de maladie rénale chronique qui utilisent un régime riche en adénine pour induire une insuffisance rénale ou des techniques chirurgicales pour enlever des parties importantes des reins10,11. Les modèles agressifs de calcification vasculaire ont utilisé une combinaison de modèles d’hyperlipidémie et d’insuffisance rénale chronique12. Ce protocole fournit une méthode pour évaluer la calcification vasculaire dans les aortes murines pour la calcification médiale et athéroscléreuse, extraire les VE de la paroi aortique et observer le potentiel de minéralisation dans les VE obtenus à partir de modèles de culture cellulaire in vitro. Les études futures pourront utiliser ces procédures dans les analyses mécanistes de la calcification vasculaire et pour évaluer les interventions thérapeutiques potentielles.

<table><tbody><tr><td>Verre de protection à 8 puits</td><td>Thermo Scientific</td><td>155409PK</td><td></td></tr><tr><td>Seringue</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>20 g Aiguille de 1 pouce</td><td>BD</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>collagène, haute concentration,</td><td>queue</td> de rat <td>354249</td><td></td></tr><tr><td>collagénase</td><td>Worthington Pince biochimique</td><td>LS004174</td><td></td></tr><tr><td>courbée</td><td>Instrument chirurgical</td><td>Roboz RS-8254</td><td></td></tr><tr><td>Plat de dissection</td><td>Systèmes vivants Instrumentation</td><td>DD-90-S</td><td></td></tr><tr><td>Plateau de dissection et cire</td><td>United Scientific Supplies</td><td>DSPA01-W</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cytiva</td><td>SH30022. </td><td></td>FS</tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey</td><td>LI-COR</td><td>DLx</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissection Ciseaux Courbés (Lame de 24 mm)&nbsp ;</td><td>Instrument chirurgical</td><td>Roboz RS-5913</td><td></td></tr><tr><td>Micro ciseaux à ressort de dissection (lame de 13 mm)</td><td>Instrument chirurgical</td><td>Roboz RS-5677</td><td></td></tr><tr><td>Micro ciseaux à ressort de dissection (lame de 5 mm)</td><td>Instrument chirurgical Roboz</td><td>RS-5600</td><td></td></tr><tr><td>Micro pince à épiler de dissection (pointe de 0,10 x 0,06 mm)</td><td>Instrument chirurgical Roboz</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-TL Ultracentrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>B11229</td><td></td></tr><tr><td>OsteoSense 680EX</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEV10020EX</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Inhibiteur de protéase</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32963</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fischer Chemical</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Tampon de lyse et d’extraction</td><td>G Biosciences</td><td>786-489</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fischer Chemical</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Thermo Scientific</td><td>A4782602</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HTX Lecteur multimode</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire, 96 puits</td><td>Thermo Fisher</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>T-Pins</td><td>United Scientific Supplies</td><td>TPIN02-PK/100</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de tris</td><td>Fischer Chemical</td><td>BP153</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse de la calcification vasculaire extracellulaire à médiation vésiculaire à l’aide de modèles in vitro et in vivo

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de décès dans le monde, et la calcification vasculaire est le prédicteur le plus important des événements cardiovasculaires; Cependant, il n’existe actuellement aucun traitement ou option thérapeutique pour la calcification vasculaire. La calcification commence dans des vésicules extracellulaires spécialisées (VE), qui servent de foyers de nucléation en agrégeant les ions calcium et phosphate. Ce protocole décrit les méthodes permettant d’obtenir et d’évaluer la calcification dans les aortes murines et d’analyser les VE extraites associées. Tout d’abord, la dissection grossière de la souris est effectuée pour collecter tous les organes pertinents, tels que les reins, le foie et les poumons. Ensuite, l’aorte murine est isolée et excisée de la racine aortique à l’artère fémorale. Deux à trois aortes sont ensuite regroupées et incubées dans une solution digestive avant de subir une ultracentrifugation pour isoler les VE d’intérêt. Ensuite, le potentiel de minéralisation des VE est déterminé par incubation dans une solution à haute teneur en phosphate et mesure de l’absorbance de la lumière à une longueur d’onde de 340 nm. Enfin, les hydrogels de collagène sont utilisés pour observer la formation et la maturation des minéraux calcifiés produits par les VE in vitro.

Une fois les aortes extraites, l’imagerie à l’aide d’un scanner optique proche infrarouge montre une représentation visuelle de l’aorte ainsi que de la calcification vasculaire (Figure 1). Les valeurs d’intensité en pixels dans l’image fluorescente numérisée représentent la distribution de la calcification et sont affichées ici à l’aide d’une carte thermique colorée. Les méthodes de quantification comprennent l’identification d’un seuil positif et la déclaration de la zone en pourcentage de ...

Cet article présente la méthodologie pour obtenir et évaluer la calcification vasculaire en isolant les aortes murines suivie de l’extraction des vésicules extracellulaires calcifiées pour observer le potentiel de minéralisation.

Analyse de la calcification vasculaire extracellulaire à médiation vésiculaire à l’aide de modèles in vitro et in vivo

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

Ce protocole fournit une méthode qui peut être utilisée pour aider à évaluer et, à l’avenir, à développer des traitements pour la calcification vasculaire, qui est le prédicteur le plus important de maladie cardiovasculaire. La capacité d’isoler les VE nous permet d’étudier plus avant les mécanismes qui conduisent à la calcification vasculaire et au changement phénotypique des cellules musculaires lisses vasculaires. Cette technique donne un aperçu des mécanismes moléculaires précoces de la calcification médiée par les cellules musculaires lisses vasculaires.Comprendre cela permet d’étudier les options thérapeutiques pour le mécanisme compris. Tous les véhicules électriques d’intérêt peuvent être étudiés à l’aide de cette méthode. Il n’est pas exclusif aux cellules musculaires lisses vasculaires, aux ostéoblastes ou à la calcification vasculaire.Après avoir euthanasié la souris, soulevez la peau à l’aide d’une pince à épiler et faites une incision le long de la ligne médiane. Enlevez tout excès de peau ou de graisse. Ensuite, retirez les organes reproducteurs, la vessie et la graisse à l’extérieur de la ligne médiane.Ensuite, déplacez les organes gastro-intestinaux vers la droite et suivez les intestins dans la ligne médiane. Une fois trouvé, soulevez la ligne médiane et excisez le tractus gastro-intestinal jusqu’à l’estomac. Extrayez les reins en les soulevant loin de la ligne médiane.Couper le plus près possible du rein. Enlevez le foie en soulevant les lobes et en coupant loin de la ligne médiane. Ensuite, perfusez le cœur et l’aorte en injectant du PBS froid dans le ventricule droit à l’aide d’une seringue de 10 millilitres.Attendez que les poumons se gonflent et deviennent blancs. Retirez les poumons et tout excès de diaphragme ou de cage thoracique. Pour retirer l’os, ouvrez une paire de ciseaux en grand et placez-les dans la partie inférieure de la souris au-dessus de la queue.Couper vers le bas, soulever la colonne vertébrale de la peau et enlever la graisse des côtés de la ligne médiane. Une fois que la peau est détachée, excisez la colonne vertébrale et les organes intacts en coupant juste au-dessus du cœur. Placez la colonne vertébrale et les organes intacts dans un bécher de PBS dans le seau à glace si vous les transportez vers un stéréoscope.Après avoir déplacé la colonne vertébrale et les organes dans le plat de dissection, remplissez-le de PBS glacé et épinglez la colonne vertébrale et la cage thoracique à l’aide d’aiguilles. Sous le microscope à dissection, soulevez le cœur avec précaution à l’aide d’une pince à épiler et commencez à couper au-dessus de la colonne vertébrale et sous l’aorte. Continuez jusqu’à ce que le bas de la colonne vertébrale soit atteint.Retirez la colonne vertébrale du plat à disséquer et épinglez le cœur et toute graisse ou muscle étranger. En partant de la zone située juste en dessous du cœur, identifiez l’œsophage, la veine cave et l’aorte. Retirez l’œsophage et la veine cave pour avoir un champ visuel clair de l’aorte.À l’aide de la pince à micro-dissection et des ciseaux, commencez à soulever le tissu adipeux et coupez le plus près possible de l’aorte. Continuez ainsi le long de la ligne médiale jusqu’à ce que toutes les artères de l’aorte et du fémur soient exposées. Au cœur, retirez tout le tissu adipeux exposant les trois branches de l’arc aortique.Retirez la racine aortique du ventricule gauche en insérant les ciseaux de micro-dissection dans le ventricule gauche et en coupant le muscle entourant l’aorte. Une fois l’aorte isolée et nettoyée, imagez l’aorte à l’aide d’un scanner proche infrarouge pour visualiser la calcification vasculaire. À l’aide du script MATLAB personnalisé, quantifiez le signal total du traceur calcique normalisé à la surface totale de l’aorte balayée.Dirigez le MATLAB vers l’emplacement des fichiers TIF à partir de l’analyse proche infrarouge des aortes, ouvrez les fichiers individuels et extrayez les valeurs d’intensité en pixels des fichiers TIF. Sélectionnez l’aorte avec la plus grande calcification comme échelle maximale sur l’image mappée en couleur. Lorsque la commande Combien de spécimens sont dans l’image apparaît dans la fenêtre, entrez le nombre d’aortes dans l’image actuelle et sélectionnez chaque aorte une par une.Une fois l’aorte sélectionnée, MATLAB crée des images binaires avec un masque de la surface totale et de la zone calcifiée de l’aorte. Les valeurs de ces images masquées sont ensuite utilisées pour déterminer la surface calcifiée totale, la surface totale de l’aorte, le pourcentage de surface positive pour la calcification et l’intensité moyenne de la zone calcifiée. Immédiatement après avoir scanné les aortes, mettez deux à trois aortes pour obtenir une concentration suffisante en protéines.Incuber deux à trois aortes regroupées dans 1,5 millilitre de solution digestive pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Recueillir la solution et centrifuger à 1 000 g pendant 15 minutes pour éliminer les débris cellulaires. Ensuite, pour retirer les microvésicules, centrifuger à nouveau le surnageant pendant 30 minutes à 33 000 g.Recueillir et évaluer le surnageant pour le potentiel de calcification. Après avoir retiré les débris cellulaires du milieu collecté conditionné par centrifugation, faire tourner le surnageant recueilli à 33 000 g pendant 30 minutes. Récupérez le surnageant et transférez-le dans un nouveau tube.Ajoutez ensuite 1% de 300 millimolaires de dihydrogénophosphate de sodium aux échantillons de vésicules extracellulaires et mélangez la solution par pipetage. Transférer 200 microlitres de la solution de mélange dans une plaque de 96 puits et incuber la plaque de 96 puits dans le lecteur de microplaques à 37 degrés Celsius. Réglez le lecteur de plaques pour enregistrer l’absorbance à une longueur d’onde de 340 nanomètres toutes les minutes.Pipeter 300 microlitres de la solution de collagène dans chaque puits d’une chambre de verre à huit puits, et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 72 heures. Après l’incubation, ajoutez 300 microlitres de DMEM comme témoin dans les puits. Ajouter 300 microlitres des échantillons de milieu de vésicules extracellulaires prélevés précédemment dans les puits restants et incuber pendant six jours, comme démontré précédemment.Le 10e jour, pipeter 2,5 microlitres du mélange OsteoSense et DMEM dans chaque puits et incuber pendant 24 heures. À la fin de l’incubation, imagez les hydrogels avec des filtres pour la fluorescence OsteoSense à travers le bas d’une chambre de verre à l’aide d’un microscope inversé, ou du haut avec un objectif à longue distance de travail. Évaluez le nombre de calcifications, la taille de calcification et les images collectées à l’aide des options d’analyse des particules disponibles dans ImageJ.Accédez ensuite à Image, sélectionnez Ajuster, puis cliquez sur Seuil pour binariser les images, de sorte que seul le signal OsteoSense apparaisse en blanc. Utilisez ensuite la commande Analyser, puis cliquez sur Analyser les particules pour obtenir des informations sur chaque calcification de l’image. Utilisez les mêmes paramètres de seuil pour assurer la cohérence de chaque image analysée.L’imagerie par scanner optique proche infrarouge des aortes disséquées a montré un signal OsteoSense plus élevé dans toute l’aorte d’une souris atteinte d’insuffisance rénale chronique que les deux aortes de souris témoins. Le milieu conditionné obtenu à partir de cellules musculaires lisses vasculaires cultivées dans un milieu pro-calcifié a montré une absorbance plus élevée à 340 nanomètres que le milieu témoin. L’augmentation de l’absorbance s’est produite 1,5 fois plus rapidement dans l’échantillon pro-calcifié que dans un échantillon témoin.Le milieu conditionné à partir de cellules cultivées dans des conditions pro-calcifiantes contenait des dépôts minéraux. Lors de la micro-dissection de l’aorte, il est important de couper soigneusement la graisse entourant l’aorte. Vous voulez analyser autant d’aorte que possible, mais cela peut être assez fastidieux.Une fois les VE isolés, des tests supplémentaires, tels qu’un test d’activité de la phosphatase alcaline, ou immuno-corps pourraient être effectués. Ces tests montreraient en outre les mécanismes et les protéines présents dans les VE.

analysis-extracellular-vesicle-mediated-vascular-calcification-using

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Cette vidéo présente une technique de coloration pour évaluer la calcification artérielle médiale des cellules musculaires lisses vasculaires in vitro. La méthode von Kossa utilise une réaction photochimique pour déposer de l’argent métallique sur les sites de calcification et conférer une coloration noire.

Coloration de von Kossa des cellules musculaires lisses vasculaires aortiques : une technique in vitro pour l’évaluation de la calcification de la couche médiale artérielle

Source : Hakim, M. A. et al., Isolement et analyse fonctionnelle de l’endothélium artériolaire du parenchyme cérébral de souris. J. Vis. Exp. (2022). Cette vidéo démontre l’analyse fonctionnelle d’un tube endothélial artériolaire isolé du cerveau d’une souris. Il décrit les étapes de mesure des niveaux de calcium intracellulaire et du potentiel membranaire, à la fois au départ et en réponse à une stimulation pharmacologique.

Analyse de la dynamique calcique et des modifications du potentiel membranaire dans l’endothélium artériolaire d’une souris

Targeted-estérase induite colorant chargement (TED) appuie l'analyse de la dynamique intracellulaire des magasins de calcium par imagerie de fluorescence. La méthode se fonde sur le ciblage d'une carboxylestérase recombinant pour le réticulum endoplasmique (RE), où il améliore le démasquage locale de synthétique de faible affinité...

Imagerie directe du calcium ER avec Targeted-estérase colorant induit Chargement (TED)

La calcification vasculaire est un prédicteur important et un contributeur aux maladies cardiovasculaires humaines. Ce protocole décrit des méthodes pour induire la calcification de cellules musculaires lisses vasculaires primaires en culture et pour quantifier la calcification et la charge macrophage dans les aortes animales à l’aide de l’imagerie par fluorescence proche infrarouge.

Calcification vasculaire des cellules musculaires lisses et imagerie de Aortic calcification et Inflammation

Nous présentons un protocole pour étudier les interactions endothéliale péricytes humaines chez la souris en utilisant une variante du test d'angiogenèse bouchon de gel de matrice.

Etude in vivo de Human Interaction Endothelial-péricytes Utilisation du Gel Matrice Plug - test chez la souris

Ce protocole décrit l’isolement, la culture et la calcification des cellules interstitielles vanne dérivé de rat, un modèle hautement physiologique in vitro d’une valvulopathie aortique calcifiée (CAVD). L’exploitation de ce modèle de rat facilite la recherche CAVD dans l’exploration de la cellule et les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ce complex processus pathologique.

Isolement et caractérisation des primaires de Rat vanne cellules interstitielles : un nouveau modèle pour étudier la Calcification de la Valve aortique

Dans ce travail, nous décrivons les protocoles afin d’étudier le rôle des vésicules extracellulaires (EVs) libéré par les érythrocytes de Plasmodium falciparum infectés. En particulier, nous nous concentrons sur les interactions des véhicules électriques avec des cellules endothéliales.

Évaluation de la fonction vésiculaire extracellulaire au cours de l’Infection palustre

Cet article décrit l’isolement des cellules de valve aortique de souris par un procédé en deux étapes de collagénase. Les cellules valvulaires isolées de la souris sont importantes pour effectuer différents essais, tels que ce test de calcification in vitro, et pour étudier les voies moléculaires menant à la minéralisation de la valve aortique.

Isolement des cellules valvulaires interstitielles de souris pour étudier la calcification de la valve aortique in vitro

Ici, nous présentons un protocole pour marquer les vésicules extracellulaires dérivées du lysat plaquettaire afin de surveiller leur migration et leur absorption dans les explants cartilagineux utilisés comme modèle pour l’arthrose.

Marquage des vésicules extracellulaires pour surveiller la migration et l’absorption dans les explants cartilagineux

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de décès dans le monde. La calcification vasculaire contribue considérablement au fardeau de la morbidité et de la mortalité cardiovasculaires. Ce protocole décrit une méthode simple pour quantifier la précipitation du calcium médiée par les cellules musculaires lisses vasculaires in vitro par imagerie fluorescente.

Une méthode biologique semi-automatisée et reproductible pour quantifier le dépôt de calcium in vitro

Le protocole utilise une lignée de souris rapporteure CD63-GFP spécifique aux adipocytes pour visualiser et quantifier la sécrétion de vésicules extracellulaires (EV) dérivées des adipocytes et démontrer leur captation par les cellules progénitrices, révélant une voie paracrine au sein du tissu adipeux.

Caractérisation de la sécrétion de vésicules extracellulaires dérivées des adipocytes à l’aide d’un modèle murin rapporteur CD63-GFP in vivo et in vitro

Découvrez une méthode d'analyse de la calcification vasculaire par isolation d'aortes murines et extraction de vésicules extracellulaires. Cette technique permet d'étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans la calcification des cellules musculaires lisses vasculaires.

Analyse de la calcification vasculaire extracellulaire à médiation vésiculaire à l’aide de modèles in vitro et in vivo

Explorer plus de vidéos