Name: Dosage de l’absorption d’anticorps pour le suivi de l’endocytose cran/delta au cours de la division asymétrique des progéniteurs de la glie radiale du poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Découvrez un dosage d'absorption d'anticorps pour imager la signalisation Notch/DeltaD dans les progéniteurs de glie radiale du cerveau embryonnaire de Danio rerio. Cette méthode permet de suivre le trafic endocytaire des ligands Notch avec une haute efficacité.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Le projet a été soutenu par NIH R01NS120218, le prix Mary Anne Koda-Kimble Seed Award for Innovation de l’UCSF et le Chan Zuckerberg Biohub.

Nous avons utilisé la lignée de type sauvage AB et la lignée transgénique Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] pour l’étude. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Californie à San Francisco, États-Unis (numéro d’approbation : AN179000).
1. Préparation d’embryons de poisson zèbre
<ol><li>Installez des bassins de croisement de poissons dans l’après-midi avant 17h00, avec une femelle de type sauvage et un poisson mâle Tg [ef1a: Myr-Tdtomato] en utilisant des séparateurs pour les séparer dans chaque réservoir.</li>
	<li>Retirez les séparateurs avant 11 h 00 de tous les réservoirs de passage le lendemain matin. Restez silencieux et ne dérangez pas les poissons pendant qu’ils s’accouplent. Le frai a généralement lieu dans les 30 minutes suivant le retrait des séparateurs. Les œufs fécondés restent au fond du réservoir.<ol><li>Ramassez les œufs fécondés dans les réservoirs avec un filtre à mailles. Transférez les œufs en les lavant dans une boîte de Petri remplie d’eau d’œuf et examinez les embryons au microscope à dissection à un grossissement de 10x à 20x.</li>
	</ol></li>
	<li>Transférer les embryons fécondés dans une boîte de Petri propre contenant environ 20 ml de milieu embryonnaire (100 mL de solution mère 1 000x contient 29,4 g de NaCl, 1,27 g de KCl, 4,85 g de CaCl 2.2H 2 O et 8,13 gde MgSO4,7H 2 O) avec des pipettes Pasteur en verre de gros calibre. Conserver les embryons à 28 °C. Conservez 50 embryons fécondés par boîte de Petri avec 30 ml de milieu embryonnaire à 28,5 °C. REMARQUE: Une paire de poissons produit normalement 100 à 300 embryons, et le taux de fécondation et de survie des embryons sains est supérieur à 95% pour chaque accouplement.</li>
	<li>Le lendemain matin, sortez les embryons de l’incubateur à 8h00, lorsque les embryons ont atteint le stade de développement de ~18-20 h post-fécondation (HPF). Observez-les au microscope à épifluorescence à un grossissement de 20x, en utilisant d’abord la lumière blanche. À ce moment-là, les embryons de poisson zèbre sont au stade 20 somites.<ol><li>Jetez les embryons morts qui sont troubles ou rompus au microscope à l’aide d’une pipette en verre.</li>
	</ol></li>
	<li>Allumez la lampe fluorescente et choisissez le réglage du filtre RFP du microscope. Ensuite, sélectionnez les embryons à forte fluorescence rouge et transférez-les dans un nouveau plat avec de l’eau d’œuf.<ol><li>Déchorioner les embryons manuellement avec deux pinces fines (les extrémités des pinces doivent être tranchantes et intactes) sous lumière blanche (Tableau des matériaux).</li>
		<li>Tenez le chorion avec une paire de forceps et faites une déchirure dans le chorion avec l’autre forceps. Ouvrez soigneusement la déchirure à l’aide des forceps et faites-la suffisamment grande pour que l’embryon puisse passer à travers en poussant doucement l’embryon avec les extrémités des autres forceps.</li>
	</ol></li>
	<li>Transférer les embryons déchorionés dans une nouvelle boîte de Petri avec un milieu embryonnaire frais pour un rinçage rapide avant la micro-injection.</li>
</ol>2. Préparation de la micro-injection
<ol><li>Utilisez les capillaires (1,2 mm OD, 0,9 mm ID, avec filament) pour tirer les aiguilles d’injection fines sur un extracteur. Concevoir et optimiser le programme de traction selon le manuel.</li>
	<li>Ouvrez l’extrémité de l’aiguille avec une pince sous un microscope à dissection stéréo. Faire le diamètre de la pointe autour de 10 μm, et l’angle de conicité autour de 30°.</li>
	<li>Conjuguer l’anticorps monoclonal anti-DLD de souris avec l’anticorps anti-souris-IgG-Atto647N avant l’injection.<ol><li>Pour chaque expérience d’injection, mélanger 0,5 μL de l’anticorps anti-Dld (0,5 mg/mL) avec 2 μL de l’anticorps anti-souris-IgG-Atto647N (1 mg/mL) en pipetant 5 à 10 fois. Ensuite, incuber à température ambiante pendant au moins 30 minutes (ou sur glace pendant 2-3 h).</li>
		<li>Après l’incubation, ajouter 2,5 μL de tampon bloquant (10 mg/mL d’IgG de souris) et 0,5 μL de rouge de phénol à 0,5 % au mélange d’anticorps, et pipeter 10x pour bien mélanger, afin de bloquer les anticorps non conjugués restant dans le mélange. NOTE: Pour chaque essai, préparer un mélange supplémentaire sans l’anticorps anti-DLD et l’utiliser comme témoin.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer 1% d’agarose à bas point de fusion dans le milieu embryonnaire. Chauffer le mélange contenu dans l’agarose à 70 °C jusqu’à ce que le mélange devienne transparent.<ol><li>Aliquote la solution d’agarose dans des tubes microcentrifugés de 2 mL. Conserver les aliquotes dans un bloc thermique à ~40 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Rincer l’embryon dans le tube contenant 1% d’agarose à bas point de fusion pendant 3 s.</li>
	<li>Placez l’embryon sur un couvercle de boîte de Petri en plastique inversé avec des gouttes individuelles d’agarose (~30-40 μL) pour monter chaque embryon séparément sur le couvercle, comme illustré à la figure 1. Posez les embryons à plat latéralement dans l’agarose et maintenez cette position jusqu’à ce que l’agarose se soit solidifiée à température ambiante.</li>
	<li>Montez 12 embryons sur trois rangées un par un comme ci-dessus. Couvrir tous les embryons montés dans l’agarose avec un milieu d’œuf.</li>
</ol>3. Micro-injection
<ol><li>Placez les embryons incrustés sous le stéréomicroscope et couvrez l’agarose avec de l’eau d’œuf.</li>
	<li>Réglez l’injecteur de pression d’air avec des micromanipulateurs, en les plaçant près des microscopes comme illustré à la figure 1. Utiliser la bouteille de gaz en acier contenant de l’azote gazeux (N2) sous haute pression comme ressource d’air.<ol><li>N’ouvrez la valve de gaz qu’après que les embryons ont été montés dans l’agarose. Ensuite, chargez l’aiguille en verre préparée avec 2 μL de mélange d’anticorps sur le micromanipulateur, comme illustré à la figure 1, lors de l’utilisation du module de remplissage avant du micro-injecteur.</li>
		<li>Réglez la pression d’entrée sur ~80-90 psi et la pression d’injection sur ~20 psi.</li>
	</ol></li>
	<li>Calibrer le volume d’injection à l’aide d’un micromètre au microscope, comme décrit précédemment15. Réglez la durée de la mélodie de 10 ms à 120 ms, en fonction de la taille de l’ouverture de l’aiguille. Délivrez chaque impulsion d’injection en tapotant la palette. Réglez le volume d’injection de chaque administration à ~4-5 nL.</li>
	<li>Introduisez la pointe de l’aiguille de micro-injection à travers la plaque de toit dorsale du cerveau postérieur postérieur jusqu’au point de charnière r0/r1 et injectez environ 10 nL (deux ou trois impulsions) de mélange d’anticorps sans toucher le tissu cérébral. Observez l’écoulement des fluides rouges dans le ventricule cérébral. REMARQUE: Le ventricule du cerveau postérieur est postérieur à la limite du cerveau postérieur du mésencéphale. Le mélange d’anticorps injecté contenant du rouge de phénol remplit immédiatement le ventricule cérébral du cerveau postérieur au cerveau antérieur en diffusant avec du liquide céphalorachidien.</li>
	<li>Après l’injection, retirez rapidement la pointe de l’aiguille de l’embryon en tournant le bouton du micromanipulateur. Pour une injection réussie, le colorant rouge du mélange injecté reste dans le ventricule cérébral de manière stable sans fuite dans l’agarose entourée.</li>
	<li>Déplacez la plaque de montage sous le microscope pour localiser un autre embryon monté à une position appropriée pour les répétitions.<ol><li>Après avoir injecté six à huit embryons, pelez l’agarose avec un couteau microchirurgical pour libérer les embryons de l’agarose incrustée. Transférer les embryons microinjectés dans un plat frais contenant 30 ml de milieu embryonnaire et les placer à température ambiante pour les prochaines étapes.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Montage et imagerie en direct accélérée
<ol><li>Après 30 min, transférer les embryons sélectionnés sur 10 mL de milieu embryonnaire. Ajouter 420 μL de tricaïne (4 mg/mL) à 10 mL de milieu embryonnaire pour anesthésier les embryons.</li>
	<li>Pour monter les embryons, préparer 0,8% d’agarose à bas point de fusion contenant la même concentration de tricaïne dans le tube. Conserver les aliquotes dans un bloc thermique à ~40 °C.</li>
	<li>Utilisez une pipette en verre pour immerger les embryons injectés dans l’agarose chaude pendant 3 s. Ensuite, retirez immédiatement les embryons de l’agarose avec la même pipette en verre et placez les embryons au centre de boîtes de culture à fond de verre de 35 mm avec une goutte d’agarose du tube. Placez un seul embryon par goutte sur le verre.</li>
	<li>Orientez doucement les embryons avec une sonde à fibres ou une pointe de chargement pour garder la face dorsale du cerveau embryonnaire aussi près que possible du fond de verre. Ajustez doucement la position de l’embryon pour étendre l’embryon sans se courber à mesure que l’agarose se solidifie progressivement.</li>
	<li>Ensuite, vérifiez la position de l’embryon en retournant le plat de fond en verre. Assurez-vous que tout le cerveau antérieur dorsal avec les embryons correctement montés peut être vu au microscope.</li>
	<li>Ajouter 2 à 3 mL de milieu embryonnaire préchauffé à 28,5 °C contenant de la tricaïne pour couvrir l’embryon. Placez correctement la capsule sur la platine à température contrôlée du microscope confocal, comme illustré à la figure 1. Régler la température de la chambre d’imagerie à 28,5 °C. L’embryon est maintenant prêt pour l’imagerie.</li>
	<li>Effectuez des images en direct en accéléré avec un intervalle de temps fixe à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’eau 40x.<ol><li>Utilisez le logiciel d’imagerie et de contrôle du microscope (μMANAGER : https://micro-manager.org/)16.</li>
		<li>Sélectionnez les canaux d’imagerie de 564 nm et 647 nm pour l’imagerie de la fluorescence membranaire membranaire transgénique MyR-Tdtomato et de l’anti-Dld-Atto647N endosomal dans la cellule (Figure 1).</li>
		<li>Réglez la puissance laser à 30% pour les deux canaux. Utilisez un temps d’exposition par plan z de 200 ms pour chaque canal.</li>
		<li>Pour chaque embryon de poisson-zèbre monté, utilisez un balayage z-step de 1 μm pour 20 z-plans au total, et un cycle de balayage de 100 périodes.</li>
		<li>Définissez l’intervalle de temps entre chaque cycle de numérisation à 20 s et le mode de numérisation sous forme de canal, tranche.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Baonza, A., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+directly+controls+cell+proliferation+in+the+Drosophila+wing+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).</li>
<li>Chitnis, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChitnis%2C+A+%22Developmental+Dynamics%22">Developmental Dynamics</a>. 235 (4), 886-894 (2006).</li>
<li>Daeden, A., Gonzalez-Gaitan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+trafficking+during+mitosis+and+notch-dependent+asymmetric+division%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+and+Subcellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Endosomal trafficking during mitosis and notch-dependent asymmetric division.</a> Progress in Molecular and Subcellular Biology. 57, 301-329 (2018).</li>
<li>Le Borgne, R., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling%3A+endocytosis+makes+delta+signal+better%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Notch signaling: endocytosis makes delta signal better.</a> Current Biology. 13 (7), 273-275 (2003).</li>
<li>Chapman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch1+endocytosis+is+induced+by+ligand+and+is+required+for+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Notch1 endocytosis is induced by ligand and is required for signal transduction.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (1), 166-177 (2016).</li>
<li>Schroeter, E. H., Kisslinger, J. A., Kopan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-1+signalling+requires+ligand-induced+proteolytic+release+of+intracellular+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notch-1 signalling requires ligand-induced proteolytic release of intracellular domain.</a> Nature. 393 (6683), 382-386 (1998).</li>
<li>Coumailleau, F., Fürthauer, M., Knoblich, J. A., González-Gaitán, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+Delta+and+Notch+trafficking+in+Sara+endosomes+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division.</a> Nature. 458 (7241), 1051-1055 (2009).</li>
<li>Derivery, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+endosome+dynamics+by+spindle+asymmetry+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polarized endosome dynamics by spindle asymmetry during asymmetric cell division.</a> Nature. 528 (7581), 280-285 (2015).</li>
<li>Matsuda, M., Chitnis, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+Notch+determines+endocytosis+of+specific+Delta+ligands+in+zebrafish+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Interaction with Notch determines endocytosis of specific Delta ligands in zebrafish neural tissue.</a> Development. 136 (2), 197-206 (2009).</li>
<li>Kressmann, S., Campos, C., Castanon, I., Fürthauer, M., González-Gaitán, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+Notch+trafficking+in+Sara+endosomes+during+asymmetric+cell+division+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Directional Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division in the spinal cord.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 333-339 (2015).</li>
<li>Dong, Z., Yang, N., Yeo, S. -Y., Chitnis, A., Guo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intralineage+directional+Notch+signaling+regulates+self-renewal+and+differentiation+of+asymmetrically+dividing+radial+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Intralineage directional Notch signaling regulates self-renewal and differentiation of asymmetrically dividing radial glia.</a> Neuron. 74 (1), 65-78 (2012).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+endosome+dynamics+engage+cytoplasmic+Par-3+that+recruits+dynein+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Polarized endosome dynamics engage cytoplasmic Par-3 that recruits dynein during asymmetric cell division.</a> Science Advances. 7 (24), (2021).</li>
<li>Zhao, X., Garcia, J., Royer, L. A., Guo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+analysis+for+cryosectioned+and+immunostained+tissue+samples+with+or+without+label+retention+expansion+microscopy+%28LR-ExM%29+by+JACoP%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Colocalization analysis for cryosectioned and immunostained tissue samples with or without label retention expansion microscopy (LR-ExM) by JACoP.</a> Bio-Protocol. 12 (5), 4336(2022).</li>
<li>Gutzman, J. H., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+brain+ventricle+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Zebrafish brain ventricle injection.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1218(2009).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+the+injection+volume+for+microinjection+of+Xenopus+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Calibration of the injection volume for microinjection of Xenopus oocytes and embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+%C2%B5Manager%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using µManager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit 14.20 (2010).</li>
<li>Lukinavičius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+probes+for+multicolor+imaging+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic probes for multicolor imaging in living cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (30), 9365-9368 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons développé un test d’absorption d’anticorps pour le marquage et l’imagerie endosomale Notch/Delta trafic dans les progéniteurs de la glie radiale du poisson zèbre avec une grande efficacité. Par rapport aux méthodes précédentes utilisées pour suivre les anticorps anti-DeltaD marqués dans les cellules SOP de drosophile7,8, notre méthode a utilisé la micro-injection au lieu de l’incubation d’échantillons dans l’anticorps conjugué. Des anticorps anti-DLD c...

La signalisation Notch contrôle la décision et la structuration du destin cellulaire au cours du développement chez les métazoaires1, et des études récentes ont montré que la signalisation Notch dans la division des cellules souches dépend principalement du trafic endocytaire 2,3. Endocytosed Notch / Delta peut activer la signalisation Notch dans le noyau et améliorer la transcription des gènes ciblesNotch 4,5,6. Le trafic endosomal directionnel Notch/Delta a été observé pour la première fois dans les cellules précurseurs d’organes sensoriels (SOP) de la drosophile au cours de sa division cellulaire asymétrique (DCA), ce qui a entraîné une activité de signalisation Notch plus élevée dans pIIa que dans pIIb 7,8. Des tests d’absorption d’anticorps avec des anticorps anti-Delta et anti-Notch ont été appliqués pour surveiller le processus endocytaire dans les cellules SOP mitotiques. Les endosomes Notch/DeltaD se déplacent avec une protéine motrice kinésine vers le fuseau central pendant la cytocinèse et sont transloqués de manière asymétrique dans la cellule pIIa en raison du réseau antiparallèle du fuseau central asymétrique au dernier moment de la division cellulaire 3,8. Ces études ont mis en lumière les mécanismes moléculaires régulant la division asymétrique dans les cellules SOP de drosophile, mais il n’est pas clair si des processus endocytaires similaires se produisent chez les progéniteurs de la glie radiale des vertébrés (RGP).
De plus, les mécanismes moléculaires qui régulent la signalisation asymétrique Notch/DeltaD pendant la division RGP des vertébrés ne sont pas bien compris. Chez le poisson zèbre, il a été rapporté que l’interaction de Notch et Delta facilite l’endocytose du ligand9 DeltaD. On ne sait pas si l’endocytose DeltaD peut avoir un impact sur le choix du devenir cellulaire des cellules filles dans le cerveau des vertébrés en développement. Des études récentes montrent que l’injection d’anticorps anti-DeltaD conjugués par fluorescence dans le tube neural pourrait marquer les endosomes Sara spécifiquement dans les cellules neuroépithéliales, et les endosomes anti-DeltaD contenant Sara se séparent préférentiellement en cellules filles proliférantes10. Il a été suggéré que la signalisation Notch des endosomes pourrait réguler le destin des cellules filles. Des résultats antérieurs ont montré que la plupart des cellules RGP du poisson zèbre dans le cerveau antérieur en développement subissent une DCA et que la détermination du devenir des cellules filles dépend de la signalisation intralignée Notch / DeltaD11. Afin d’élucider la nature de la signalisation intralignée Notch / DeltaD dans les RGP du poisson zèbre, nous avons développé le test d’absorption des anticorps anti-DeltaD dans le cerveau en développement du poisson zèbre. En utilisant ce protocole, nous avons réalisé avec succès le marquage en direct et l’imagerie du trafic endocytaire DeltaD dans les RGP mitotiques.
L’anticorps anti-DeltaD marqué par fluorescence est efficacement internalisé dans les RGP le long du ventricule du cerveau antérieur. Il a grandement facilité la découverte du trafic directionnel des endosomes DeltaD dans les RGP à division asymétrique12,13. Par rapport aux protocoles précédents d’absorption d’anticorps développés pour les cultures de Drosophila notum et la moelle épinière du poisson zèbre 10, ce protocole a permis d’obtenir un marquage anti-DeltaD durable et très efficace dans la couche cellulaire du ventricule cérébral, en particulier avec moins de10 nL de mélange d’anticorps micro-injectés. L’injection du ventricule du cerveau postérieur est très pratique pour appliquer le test d’absorption des anticorps dans le cerveau en développement, car le ventricule du cerveau postérieur est bien élargi chez les embryons de poisson zèbre et rempli de liquide céphalorachidien au stadede développement précoce 14. En injectant le mélange d’anticorps dans le ventricule postérieur du cerveau sans blesser les tissus en développement cruciaux, le protocole a minimisé autant que possible les dommages possibles à la zone d’imagerie dans le cerveau antérieur. La dose réduite de l’anticorps primaire injecté a également évité les effets secondaires potentiels d’interférence avec la signalisation endogène Delta-Notch in vivo. Ce protocole peut être facilement combiné avec d’autres perturbations pharmacologiques ou génétiques, utilisé à différents stades de développement, et éventuellement adapté au cerveau adulte ainsi qu’aux organoïdes cérébraux 2D/3D dérivés de cellules souches pluripotentes humaines. Pris ensemble, le protocole a permis de comprendre comment et quand l’asymétrie de signalisation Notch est établie pendant l’ACD. Le principal défi pour une mise en œuvre réussie de ce protocole est d’obtenir une livraison précise de concentrations appropriées de l’anticorps en fonction de conditions expérimentales spécifiques.

<table><tbody><tr><td>Plat de culture à fond en verre de 35 mm&nbsp ;</td><td>MatTek corporation</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>injecteur de pression d’air&nbsp ;</td><td>Narishige</td><td>IM300</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Souris-IgG-Atto647N&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50185</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires, 1,2 mm de diamètre extérieur, 0,9 mm de diamètre intérieur, avec filament</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-6</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1 Disque rotatif/Champ large haute vitesse</td><td>Nikin</td><td>N/A</td><td>Nikon&nbsp ; Microscope à fluorescence inversée Ti avec CSU-W1 à grand champ de vision confocal.</td></tr><tr><td>Pince à épiler Dumont Medical Style 5</td><td>Thomas Scientific</td><td>72877-D</td><td></td></tr><tr><td>Flaming-Brown P897 extracteur</td><td>Sutter Instruments</td><td>N/A</td><td>https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore</td><td>529552</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Micromanipulateurs</td><td></td> Sigma-Aldrich M2773 <td></td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>WPI M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-Dld&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>AB_1268496</td><td></td></tr><tr><td>Tampon bloquant les IgG de souris de Zenon</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Z25008</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Rouge phénolique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Zeiss&nbsp ;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Agarose à bas point de fusion UltraPureTM&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>16520050</td><td></td></tr></tbody></table>

dosage de l’absorption d’anticorps pour le suivi de l’endocytose cran/delta au cours de la division asymétrique des progéniteurs de la glie radiale du poisson zèbre

Antibody Uptake Assay for Tracking Notch/Delta Endocytosis During the Asymmetric Division of Zebrafish Radial Glia Progenitors

La division cellulaire asymétrique (DCA), qui produit deux cellules filles de destins différents, est fondamentale pour générer la diversité cellulaire. Dans les organes en développement des invertébrés et des vertébrés, la division asymétrique des progéniteurs génère un Notchhi auto-renouvelant et un Notchlo différenciant une fille différenciatrice. Dans le cerveau embryonnaire du poisson-zèbre, les progéniteurs de la glie radiale (RGP) - les principales cellules souches neurales des vertébrés - subissent principalement une DCA pour donner naissance à un neurone RGP et un neurone différenciant. La clarté optique et la facilité d’accès des embryons de poisson zèbre les rendent idéaux pour l’imagerie in vivo en accéléré afin de visualiser directement comment et quand l’asymétrie de la signalisation Notch est établie pendant la DCA. Des études récentes ont montré que l’endocytose dynamique du ligand Notch DeltaD joue un rôle crucial dans la détermination du destin cellulaire pendant la DCA, et le processus est régulé par le régulateur de polarité conservé au cours de l’évolution Par-3 (également connu sous le nom de Pard3) et le complexe moteur de dynéine. Pour visualiser les schémas de trafic in vivo des endosomes de signalisation Notch dans les RGP mitotiques, nous avons développé ce test d’absorption d’anticorps. En utilisant le test, nous avons découvert la dynamique des endosomes contenant DeltaD pendant la division RGP.

Sur la figure 2A, les embryons injectés d’Atto647N, sans liaison avec l’anticorps primaire, ont montré une fluorescence de fond dans le ventricule cérébral. Très peu de particules fluorescentes englouties peuvent être observées dans les cellules. Les embryons de poisson-zèbre injectés anti-Dld-Atto647N ont montré de grandes quantités de particules fluorescentes internalisées dans la plupart des cellules du cerveau antérieur en développement (Figure 2A, panneau d...

Ce travail développe un test d’absorption d’anticorps pour l’imagerie intra-lignée de la signalisation Notch / DeltaD dans la division des progéniteurs de la glie radiale du cerveau embryonnaire du poisson zèbre.

Dosage de l’absorption d’anticorps pour le suivi de l’endocytose cran/delta au cours de la division asymétrique des progéniteurs de la glie radiale du poisson zèbre

Asymmetric cell division (ACD), which produces two daughter cells of different fates, is fundamental for generating cellular diversity. In the developing ...

La signalisation Notch contrôle la décision et la structuration des sulfates pendant le développement chez les métazoaires. Nous avons développé un test d’absorption d’anticorps pour marquer le ligand delta-D de l’encoche et imager son trafic endocytaire dans les progéniteurs de la glie radiale dans le cerveau antérieur du poisson zèbre en développement. L’injection ventriculaire cérébrale cachée du poisson zèbre permet une absorption sélective de l’Anti-Dld-Atto-647N par les progéniteurs de la glie radiale myototique tapissant les ventricules cérébraux en développement avec une efficacité élevée et des effets durables.Ce protocole peut être facilement combiné avec d’autres perturbations pharmacologiques ou génétiques utilisées à différents stades de développement et éventuellement adaptées au cerveau adulte ainsi qu’aux organoïdes cérébraux 2D ou 3D dérivés de cellules souches pluripotentes humaines. Après avoir généré les embryons fécondés et les avoir incubés pendant 18 à 20 heures, retirez-les de l’incubateur. Observez-les au microscope à épifluorescence en utilisant d’abord la lumière blanche à un grossissement de 20 fois.Jetez les embryons morts qui semblent troubles ou rompus au microscope à l’aide d’une pipette en verre. Allumez ensuite la lampe fluorescente et choisissez le réglage du filtre RFP du microscope. Sélectionnez les embryons à forte fluorescence rouge et transférez-les dans un nouveau plat avec de l’eau d’œuf.Maintenant, déchorionez les embryons manuellement avec deux pinces fines sous lumière blanche. Tenez le chorion avec une paire de forceps et faites une déchirure dans le chorion avec l’autre forceps. Ouvrez soigneusement la déchirure à l’aide de la pince et faites-la assez grande pour que l’embryon puisse passer à travers en poussant doucement l’embryon avec les extrémités des autres forceps.Transférer les embryons déchorionés dans une nouvelle boîte de Petri avec un milieu embryonnaire frais pour un rinçage rapide avant la micro-injection. Après avoir tiré de fines aiguilles d’injection sur un tireur, ouvrez l’extrémité de l’aiguille avec une pince au microscope à dissection stéréoscopique. Faites le diamètre de la pointe autour de 10 micromètres et l’angle conique autour de 30 degrés.Maintenant, mélangez 0,5 microlitre de l’anticorps anti-DLD avec deux microlitres de l’anticorps anti-souris L G Atto-647N en pipetant cinq à 10 fois pour les conjuguer et incuber à température ambiante pendant au moins 30 minutes. À la fin de l’incubation, ajouter 2,5 microlitres de tampon bloquant et 0,5 microlitre de rouge de phénol à 0,5% au mélange d’anticorps et mélanger par pipetage pour bloquer les anticorps non conjugués restant dans le mélange. Ensuite, préparez 1% de bas point de fusion agarose dans le milieu embryonnaire.Chauffer le mélange contenant de l’agarose à 70 degrés Celsius jusqu’à ce que le mélange devienne transparent. Après avoir aliquote la solution d’agarose, conservez-les dans un bloc de chaleur à 40 degrés Celsius. Rincer l’embryon dans le tube contenant 1% d’agarose à bas point de fusion pendant trois secondes.Placez l’embryon sur un couvercle de boîte de Petri en plastique inversé avec des gouttes d’agarose individuelles pour monter chaque embryon séparément. Posez les embryons à plat latéralement dans l’agarose et maintenez cette position jusqu’à ce que l’agarose se soit solidifiée à température ambiante. Couvrir tous les embryons montés dans l’agarose avec un milieu d’œuf.Mettez les embryons incrustés sous le stéréomicroscope et couvrez l’agarose avec de l’eau d’œuf. Réglez l’injecteur de pression d’air avec des micro-manipulateurs, en les plaçant près des microscopes. Utilisez la bouteille de gaz en acier contenant de l’azote gazeux sous haute pression comme ressource d’air.Une fois les embryons montés dans l’agarose, ouvrez la valve de gaz. Lors de l’utilisation du module de remplissage frontal du micro-injecteur, chargez l’aiguille en verre préparée avec deux microlitres de mélange d’anticorps sur le micromanipulateur. Maintenant, réglez la pression d’entrée à 80 à 90 livres par pouce carré et la pression d’injection à 20 livres par pouce carré.Calibrer le volume d’injection à l’aide d’un micromètre au microscope. Réglez la durée de la mélodie en fonction de la taille de l’ouverture de l’aiguille de 10 à 120 millisecondes. Appuyez sur la palette pour délivrer chaque impulsion d’injection et réglez le volume d’injection de chaque livraison à quatre à cinq nanolitres.Ensuite, enfoncez la pointe de l’aiguille de micro-injection à travers la plaque de toit dorsale du cerveau postérieur, postérieur au point charnière zéro-un du rondimere et injectez environ 10 nanolitres de mélange d’anticorps sans toucher le tissu cérébral. Observé l’écoulement des fluides rouges dans le ventricule cérébral. Après l’injection, retirez rapidement la pointe de l’aiguille de l’embryon en tournant le bouton du micromanipulateur.Pour une injection réussie, le colorant rouge du mélange injecté reste dans le ventricule cérébral de manière stable sans fuite dans l’agarose entourée. Déplacez la plaque de montage sous le microscope pour localiser un autre embryon monté à une position appropriée pour les répétitions. Après avoir injecté six à huit embryons, pelez l’agarose avec un couteau microchirurgical pour libérer les embryons de l’agarose incrustée.Transférer les embryons micro-injectés dans un plat frais avec 30 millilitres de milieu embryonnaire et les placer à température ambiante pour les étapes suivantes. Après 30 minutes, transférez les embryons sélectionnés dans 10 millilitres de milieu embryonnaire. Pour monter les embryons, préparez de l’agarose à point de fusion bas à 0,8% contenant la même concentration de tricane dans le tube.Utilisez une pipette en verre pour immerger les embryons injectés dans l’agarose chaude pendant trois secondes. Ensuite, retirez immédiatement les embryons de l’agarose avec la même pipette en verre et placez les embryons au centre de boîtes de culture à fond de verre de 35 millimètres avec une goutte d’agarose du tube. Orientez doucement les embryons avec une sonde à fibres ou une pointe de chargement pour maintenir la face dorsale du cerveau embryonnaire aussi près que possible du fond de verre.Tournez doucement la position de l’embryon pour étendre l’embryon sans se courber à mesure que l’agarose se solidifie progressivement. Ensuite, vérifiez la position de l’embryon en retournant le plat de fond en verre. Assurez-vous que tout le cerveau antérieur dorsal avec les embryons correctement montés peut être vu au microscope.Ajouter deux à trois millilitres de milieu embryonnaire préchauffé à 28,5 degrés Celsius contenant du tricane pour couvrir l’embryon. Placez correctement l’antenne parabolique sur la platine à température contrôlée du microscope confocal et réglez la température de la chambre d’imagerie à 28,5 degrés Celsius. L’embryon est maintenant prêt pour l’imagerie.Les embryons injectés Atto-647N ont montré une fluorescence de fond dans le ventricule cérébral. Les embryons de poisson-zèbre injectés anti-Dld-Atto-647N ont montré de grandes quantités de particules fluorescentes internalisées dans la plupart des cellules du cerveau antérieur en développement. L’imagerie accélérée a montré le mouvement des endosomes intracellulaires Anti-Dld-Atto-647N pendant la division cellulaire.La plupart des progéniteurs de la glie radiale mitotique ont montré une ségrégation asymétrique antérieure ou postérieure des endosomes anti-Dld-Atto-647N en deux cellules filles. L’asymétrie s’est stabilisée vers la fin de l’anaphase, entraînant une hérédité asymétrique des endosomes de signalisation notch par les cellules filles par la suite. Assurez-vous que l’aiguille a été insérée dans le ventricule caché de la marque au bon endroit et vérifiez s’il y a une fuite après la micro-injection.En plus du marquage de la signalisation delta notch, le protocole est applicable pour marquer d’autres protéines membranaires ou extracellulaires en utilisant des stratégies similaires, si un bon anticorps contre le domaine extracellulaire est disponible.

antibody-uptake-assay-for-tracking-notchdelta-endocytosis-during

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Ce protocole décrit l'imagerie des neurones individuels ou des cellules de la crête neurale dans la vie des embryons de poisson zèbre. Cette méthode est utilisée pour examiner les comportements cellulaires actine et la localisation utilisant la fluorescence confocale time-lapse microscopie.

Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d&#39;actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres

La clé de la compréhension des processus morphogénétiques qui façonnent l'embryon précoce est la capacité de cellules d'image à haute résolution. Nous décrivons ici une technique de marquage des cellules individuelles ou de petits amas de cellules dans des embryons de zebrafish entier avec membrane cible protéine fluorescente verte.

L&#39;étiquetage et l&#39;imagerie des cellules dans le cerveau postérieur Zebrafish

Une méthode est décrite pour photoactiver cellules individuelles contenant une protéine fluorescente utilisant cage absorption à deux photons à partir d'un Ti: saphir oscillateur laser femtoseconde. Pour mapper le destin de la cellule photoactivé, l'immunohistochimie est utilisée. Cette technique peut être appliquée à n'importe quel type de cellule.

Simple cartographie du destin cellulaire chez le poisson zèbre

Cette vidéo présente un test d’absorption d’anticorps pour imager la signalisation Notch/DeltaD chez les progéniteurs de la glie radiale du poisson-zèbre. Il s’agit de monter des embryons de poisson-zèbre déchorionnés inclus dans de l’agarose, d’injecter une solution de colorant ciblant les ligands DeltaD sur les RGP et d’imager au microscope à fluorescence pour une division cellulaire asymétrique confirmant l’activation de la signalisation Notch/DeltaD.

Un test d’absorption d’anticorps pour l’imagerie de la signalisation Notch/DeltaD chez les progéniteurs de la glie radiale du poisson-zèbre

Processus de développement tels que la prolifération, la structuration, la différenciation et le guidage axonal peuvent être facilement modélisés dans la moelle épinière du poisson zèbre. Dans cet article, nous décrivons une procédure de montage pour embryons de poisson zèbre, qui optimise la visualisation de ces événements.

Dissection et montage latéral embryons de poisson zèbre: Analyse de la moelle épinière développement

Une nouvelle technique de détection des récepteurs endogènes de faible abondance présents dans les embryons de poisson-zèbre est décrite. Nous l’avons nommé AFLIP car il consiste en un marquage par affinité du récepteur par son ligand lié à l’immunoprécipitation.

Affinity Étiquetage Détection de Endogène Receptors de Zebrafish Embryons

la régénération rétinienne Zebrafish a surtout été étudiée en utilisant des rétines fixes. Cependant, les processus dynamiques tels que la migration nucléaire interkinetic se produisent au cours de la réponse régénérative et nécessitent imagerie des cellules vivantes pour étudier les mécanismes sous-jacents. Ici, nous décrivons la culture et d'imagerie conditions pour surveiller Interkinetic Migration nucléaire (INM) en temps réel en utilisant la microscopie multiphoton.

Culture des adultes Zebrafish Retinal explants Transgenic pour des cellules vivantes par imagerie multiphotonique Microscopie

Immunomarquage des méthodes pour analyser des populations distinctes des microtubules dans le cerveau en développement du poisson zèbre sont décrites ici, qui sont largement applicables à d’autres tissus. Le premier protocole décrit une méthode optimisée d’immunomarquage des microtubules stables et dynamiques. Le deuxième protocole fournit une méthode pour l’image et de quantifier les microtubules naissants spécifiquement.

Utilisation d’immunomarquage pour analyser des Microtubules stables et dynamiques naissants dans l’embryon de poisson zèbre

Le but de ce protocole est de décrire une approche pour analyser le comportement des cellules neurales adultes de tige/progéniteur en réponse à la manipulation chimiogénétique d'un circuit neural local spécifique.

Régulation spécifique du circuit d'analyse des cellules neuronales neuronales hippocampales adultes

Le poisson zèbre ciblant les électrophiles et les oxydants réactifs (Z-REX) est une méthode basée sur la biologie chimique pour l’étude de la signalisation réactive des petites molécules. Cette technique peut être appliquée à des poissons vivants de différents stades de développement. Ici, nous associons des tests standard chez le poisson zèbre avec Z-REX pour l’analyse de la voie de signalisation.

Surveillance des réponses de signalisation ciblée chez les larves de poisson-zèbre - Z-REX démasque les mécanismes précis des médicaments électrophiles et des métabolites

Nous faisons la démonstration d’une méthode qui tire parti de la microscopie confocale à balayage rapide pour effectuer une imagerie en direct des cellules microgliales dans le tectum optique du poisson-zèbre en développement, permettant ainsi l’analyse de la dynamique de ces cellules in vivo.

Imagerie en direct et caractérisation de la dynamique de la microglie chez l’embryon de poisson-zèbre

Découvrez un dosage d'absorption d'anticorps pour imager la signalisation Notch/DeltaD dans les progéniteurs de glie radiale du cerveau embryonnaire de Danio rerio. Cette méthode permet de suivre le trafic endocytaire des ligands Notch avec une haute efficacité.

Dosage de l’absorption d’anticorps pour le suivi de l’endocytose cran/delta au cours de la division asymétrique des progéniteurs de la glie radiale du poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal

Dosage de l’absorption d’anticorps pour le suivi de l’endocytose cran/delta au cours de la division asymétrique des progéniteurs de la glie radiale du poisson zèbre

Explorer plus de vidéos