Ensemble liposome assisté par octanol sur puce pour la bio-ingénierie

OLA est une plateforme microfluidique polyvalente utile à la communauté de la biologie synthétique. en particulier, pour bio-concevoir des cellules artificielles. Les liposomes à base d’OLA peuvent nous aider à comprendre les principes d’auto-organisation en biologie et à construire des assemblages imitant les cellules.

OLA produit des liposomes monodispersés, unilaminaires, de la taille d’une cellule à haut débit et avec une excellente efficacité d’encapsulation. Il nécessite de très petits volumes d’échantillons, de l’ordre de 50 microlitres, et les liposomes formés sont immédiatement disponibles pour une expérimentation ultérieure sur puce. OLA est utile pour étudier les réactions biologiques dans les microconfinements, la dynamique des vésicules et les condensats biomoléculaires et leurs interactions avec les membranes.

OLA a également été utilisé comme plate-forme à haut débit pour le dépistage de médicaments, par exemple, pour tester la perméabilité et l’activité membraneuse des antimicrobiens. La fonctionnalisation de surface, qui est un traitement PV, est une étape critique pour le protocole et doit être soigneusement effectuée pour empêcher la solution PV de pénétrer dans l’aquée interne et les canaux organiques porteurs de lipides. En outre, le canal de post-production devrait être juste assez long pour que la séparation des poches d’octanol forme des liposomes.

Ketan Ganar, un doctorant de mon laboratoire, aidera Chang Chen à démontrer la procédure. Pour commencer, prenez une plaquette de silicium propre de quatre pouces de diamètre et nettoyez-la davantage en utilisant de l’air sous pression pour éliminer les particules de poussière. Montez la plaquette sur un enrobage et distribuez doucement environ cinq millilitres d’une résine photosensible négative au centre de la plaquette.

Pour obtenir une couche de résine photosensible de 10 micromètres d’épaisseur, réglez les réglages de la couche de rotation à 500 tr/min pendant 30 secondes avec une accélération de 100 prix par seconde pour l’étalement initial, suivie d’une rotation de 60 secondes à 3 000 tr/min avec une accélération de 500 tr/min par seconde. Ensuite, essorez la plaquette. Cuire la gaufrette sur une plaque chauffante pendant deux minutes à 65 degrés Celsius, puis pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius.

Une fois la plaquette refroidie, montez-la dans la chambre d’impression de la machine de lithographie optique droite directe et introduisez l’assemblage de liposomes assisté par octanol ou la conception OLA, dans le logiciel. Une fois le dessin imprimé, faites cuire la gaufrette à 65 degrés Celsius pendant une minute, puis à 95 degrés Celsius pendant trois minutes. Pour laver la résine photosensible non durcie, trempez la plaquette dans un bécher en verre contenant la solution de révélateur jusqu’à ce que la résine photosensible non durcie soit complètement retirée.

Faites cuire la plaquette à 150 degrés Celsius pendant 30 minutes pour vous assurer que le dessin imprimé est fermement attaché à la surface de la plaquette et ne se détache pas dans le processus de fabrication en aval. Pour préparer le dispositif microfluidique, placez la plaquette principale sur un morceau carré d’aluminium et enroulez la feuille d’aluminium autour de la plaquette, formant ainsi une structure bien ressemblante. Verser délicatement le mélange PDMS sur la tranche maîtresse.

Incuber l’ensemble dans un four à 70 degrés Celsius pendant au moins deux heures. Sortez la gaufrette maîtresse du four et laissez-la refroidir. Pour retirer le polydiméthylsiloxane solidifié, ou bloc PDMS, retirez la feuille d’aluminium, puis décollez soigneusement le bloc PDMS du bord de la plaquette.

Prenez un couvercle en verre transparent, versez environ 0,5 millilitre de PDMS sur le centre de la lame de verre et étalez-le sur le couvercle en inclinant doucement la lame de verre, assurant ainsi une couverture totale de la lame de verre avec le PDMS. Montez la lame de verre sur la couche de rotation. Assurez-vous qu’il est placé au centre de manière à ce que le milieu de la glissière chevauche le centre de l’arbre de pression.

Faites ensuite tourner la lame de verre à 500 tr/min pendant 15 secondes par incrément de 100 tr/min par seconde et de 1 000 tr/min pendant 30 secondes à un incrément de 500 tr/min par seconde. Placez la lame de verre revêtue de PDM avec le côté revêtu vers le haut sur une plate-forme surélevée comme un bloc de PDMS dans une boîte de Petri couverte. Faites-le cuire à 70 degrés Celsius pendant deux heures.

Placez le bloc PDMS avec les canaux gravés vers le haut et la lame de verre revêtue de PDM avec le côté revêtu vers le haut dans la chambre à vide du nettoyeur plasma. Allumez le vide et exposez le contenu au plasma de l’air à une fréquence radio de 12 mégahertz pendant 15 secondes pour activer les surfaces. Le plasma d’oxygène peut être vu sous la forme d’une teinte rosâtre.

Immédiatement après le traitement au plasma, placez la lame de verre revêtue de PDMS sur une surface propre, le côté PDMS tourné vers le haut. Placez délicatement le bloc PDMS avec le motif microfluidique maintenant orienté vers la lame de verre revêtue de PDMS, ce qui leur permet de se lier. Faites cuire les appareils collés à 70 degrés Celsius pendant deux heures.

Distribuez 200 microlitres d’alcool polyvinylique à 5%, ou solution OVA, dans un tube de 1,5 millilitre et connectez-le au support du réservoir microfluidique. Insérez le tube de telle sorte qu’une extrémité soit immergée dans la solution PVA et que l’autre extrémité soit connectée à l’entrée du canal aqueux externe du dispositif microfluidique. Augmenter la pression de la phase aqueuse externe à 100 millibars pour faire circuler la solution de PVA dans les canaux aqueux extérieurs.

Augmenter les pressions des phases organiques aqueuses et lipidiques internes à 120 millibars pour empêcher le reflux de la solution PVA à l’intérieur de ces canaux. Faites couler la solution PVA de cette manière pendant environ cinq minutes, en assurant une fonctionnalisation complète du canal de sortie. Augmenter la pression dans les canaux organiques et aqueux internes porteurs de lipides à deux bars pour éliminer la solution de PVA et détacher immédiatement le tube de l’entrée aqueuse externe.

Simultanément, utilisez un tube relié à un canal à pression négative pour éliminer l’excès de PVA du canal de sortie. Faites cuire l’appareil à 120 degrés Celsius pendant 15 minutes et laissez-le refroidir avant utilisation. L’appareil peut être stocké dans des conditions ambiantes pendant au moins un mois.

Distribuez les solutions dans trois tubes de 1,5 millilitre et assemblez-les. Connectez-les à la puce microfluidique traitée au PVA et appliquez une pression positive sur les trois canaux, environ 100 millibars sur les canaux organiques aqueux et lipidiques internes et environ 200 millibars sur le canal aqueux externe. Une fois que les trois phases commencent à co-couler à la jonction, assurez-vous que la production de double émulsion commence et ajustez la pression en fonction de sa qualité.

Au fur et à mesure que les gouttelettes à double émulsion coulent, toutes les poches de l’octanol deviennent de plus en plus proéminentes et finissent par être pincées, formant des liposomes. Une image en champ clair de la génération rapide de gouttelettes à double émulsion est montrée ici. Le canal lipidique fluorescent montre la formation d’un octanol toute la poche due à un démouillage partiel.

Le canal aqueux interne montre l’encapsulation de protéines fluorescentes jaunes. Le mouillage de la poche octanol dans le canal de sortie qui forme un liposome est représenté sur cette figure. Cette image représente le schéma de la transition dépendante du pH de la solution homogène de polylysine et d’ATP encapsulée dans le liposome vers des coacervates d’ATP polylysine séparées en phase.

L’environnement acide initial dans le liposome rend la charge moléculaire de l’ATP neutre, inhibant la coacervation. Lorsque le pH à l’intérieur des liposomes s’équilibre avec l’augmentation du pH appliqué à l’extérieur, l’ATP gagne une charge négative, déclenchant la coacervation. La distribution spatiale de la polylysine et de la membrane et les images en accéléré de la formation de coacervates de polylysine ATP dans les liposomes sont montrées dans cette figure.

L’édition externe d’un tampon de base augmente le niveau de pH à l’intérieur des liposomes au cours de quelques minutes et initie la coacervation. T est égal à zéro minute fait référence au temps juste avant l’apparition du premier événement de coacervation. Tout en démontrant la procédure, il est crucial d’ajuster patiemment la pression du canal afin de générer une production régulière de double émulsion.

L’OLA et ses variantes ont été utilisés dans diverses études, par exemple, la croissance et la division des liposomes comprenant la dynamique des condensats biomoléculaires, l’expression cellulaire des protéines, ainsi que l’encapsulation des bactéries. Donc, en contusion, nous croyons que OLA est une plate-forme polyvalente pour la biologie synthétique.