ATAC-Seq spécifique aux adipocytes avec tissus adipeux par tri des noyaux activés par fluorescence

ATAC-seq est une technique puissante pour comprendre les mécanismes de régulation de l’expression génique. Cependant, le tissu adipeux est difficile à utiliser cette technique en raison de sa grande teneur en lipides, de sa forte contamination mitochondriale et de son hétérogénéité cellulaire. Dans ce protocole, le séquençage ATAC spécifique des adipocytes a été effectué en utilisant le tri des noyaux activé par fluorescence, qui génère des données de haute qualité avec une contamination minimale de l’ADN mitochondrial.

Cette méthode peut également être utilisée dans d’autres tissus où des lignées de souris Cre spécifiques au type cellulaire sont disponibles avec des lignées rapporteures transgéniques de marquage nucléaire. Commencez l’isolement du noyau en refroidissant les homogénéisateurs Dounce en verre sur de la glace avec un verre Dounce par échantillon. Ensuite, ajoutez 7 millilitres du mélange NPB à chaque verre Dounce.

Ensuite, placez 50 à 100 milligrammes de tissu adipeux congelé dans le verre Dounce, et coupez-le en quelques petits morceaux à l’aide d’une longue paire de ciseaux. Frapper 10 fois avec un pilon lâche pour tous les échantillons, puis 10 fois avec un pilon serré. Filtrer le contenu à travers une crépine de 100 micromètres dans un nouveau tube de 50 millilitres avant de transférer les homogénats filtrés dans un tube de 15 millilitres pour la centrifugation.

Après avoir retiré le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 500 microlitres de PBS-N en tapotant doucement mais minutieusement au doigt. Ensuite, filtrez la suspension à travers une crépine de 40 micromètres dans un tube de 50 millilitres et rincez la crépine avec 250 microlitres de PBS-N. Transférer la suspension nucléaire filtrée dans un tube de tri cellulaire activé par fluorescence ou FACS à l’aide d’une micropipette.

Préparez le tube de collecte en ajoutant 500 microlitres de PBS-N au nouveau tube de 1,5 millilitre et inversez-le plusieurs fois pour mouiller toutes les surfaces intérieures avec le tampon. Faites tourner brièvement les tubes pour faire descendre tout le liquide avant de les placer sur de la glace jusqu’au tri. Pour FACS, utilisez le point de contrôle FSC-A/FSC-H pour les singlets et le point de contrôle FSC-A/SSC-A pour l’enlèvement des petits ou des gros débris.

Porte pour la population de noyaux adipocytaires positifs pour la cerise/GFP, et recueillir 10 000 noyaux dans chaque tube de prélèvement préparé plus tôt. Pour la préparation post-tri du noyau, ajoutez 500 microlitres de PBS-N à chaque tube collecteur et mélangez-le en inversant le tube plusieurs fois avant de centrifuger les tubes de collecte à 200 G pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Retirez complètement le surnageant.

Pour préparer 25 microlitres de mélange maître Tn5, mélanger 12,5 microlitres de tampon ADN de marquage 2x ou tampon TD, 1,25 microlitre de transposase Tn5 ou enzyme TDE I et 11,25 microlitres d’eau sans nucléase. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de mélange maître Tn5 à chaque pastille de noyau et remettez-la en suspension par pipetage doux. Incuber à 600 tr/min pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius à l’aide d’un mélangeur thermique.

Ajouter 25 microlitres d’eau sans nucléase aux 25 microlitres du mélange de resuspension du noyau Tn5 pour obtenir le volume final de 50 microlitres. Ensuite, ajoutez 250 microlitres de tampon PB et 5 microlitres d’acétate de sodium 3 M avec un pH de 5,2. Après avoir transféré le mélange dans une colonne fournie avec le kit référencé, centrifugez-le à 17 900 G pendant 1 minute à température ambiante.

Après avoir éliminé le flux, replacez une colonne de rotation dans le même tube de collecte. Ajouter 750 microlitres de PE tampon contenant de l’éthanol absolu dans le tube. Centrifugez la colonne, jetez l’écoulement continu et replacez la colonne de rotation dans le même tube de collecte.

Centrifuger le tube et jeter le tube de collecte avec l’écoulement. Pour amplifier les fragments d’ADN transposés, préparez le mélange maître PCR sans ajouter d’Ad2 unique. n amorce de codage à barres.

Exécutez la PCR. Exécutez la PCR quantitative ou qPCR. Vérifiez les courbes d’amplification et identifiez le nombre de cycles PCR supplémentaires nécessaires en estimant le nombre de cycles qui ont atteint environ 35% du maximum.

Utilisez les calculs pour exécuter la PCR pour les 45 microlitres restants de la réaction PCR. En utilisant les procédures précédentes, éluer les fragments d’ADN amplifiés avec 20 microlitres de tampon EB. Transférer l’ADN élué dans un nouveau tube PCR et ajuster le volume à 100 microlitres en ajoutant 80 microlitres de tampon EB. Ensuite, ajoutez 55 microlitres de billes SPRI et mélangez par pipetage. Après 5 minutes d’incubation à température ambiante, séparez-le sur un mini support magnétique pendant 5 minutes.

Une fois cela fait, transférez 150 microlitres du surnageant dans un nouveau tube PCR, ajoutez 95 microlitres de billes SPRI et mélangez par pipetage. Incuber la réaction pendant 5 minutes avant de séparer les billes sur le mini support magnétique. Jetez soigneusement le surnageant et lavez les billes pendant 1 minute en utilisant 200 microlitres d’éthanol à 70%.

Répétez deux autres lavages. Après le lavage final, centrifuger les tubes à 1000 G pendant 1 minute. Extraire à la pipette l’éthanol restant et sécher la pastille à 37 degrés Celsius pendant 2 minutes sur une machine de PCR avec le couvercle ouvert.

Une fois séché, remettre la pastille en suspension dans 20 microlitres de tampon EB par pipetage et incuber le tube pendant 5 minutes à température ambiante. Séparez les billes pendant 5 minutes sur le mini support magnétique avant de transférer 18 microlitres du surnageant contenant la bibliothèque finale dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Les noyaux adipocytaires marqués mCherry et GFP se distinguaient des autres types de noyaux cellulaires isolés des tissus adipeux d’une souris Adipoq-NuTRAP.

Selon le type de dépôt adipeux, la différence est d’environ 50% dans eWAT, 30% dans iWAT et 65% dans BAT ont été observés dans les fractions adipocytaires. Les échantillons nécessitant plus de 15 cycles de PCR indiquaient des échantillons de faible qualité. L’analyse de la distribution granulométrique des bibliothèques ATAC-seq a montré plusieurs pics correspondant à la région sans nucléosomes, ou NFR, et des mono, di et multinucléosomes avec des tailles moyennes d’environ 500 à 800 paires de bases.

Les échantillons de mauvaise qualité présentaient généralement principalement de la NFR avec peu ou pas de pics nucléosomales. Les tests de contrôle de qualité par l’analyse qRT-PCR ont montré des enrichissements de 10 à 20 fois avec les éléments génomiques positifs proches des gènes marqueurs adipocytaires tels que Adipoq, Fabp4, Plin1 et Pnpla2, tandis qu’aucun enrichissement n’a été montré avec le témoin négatif. L’enrichissement avec le gène thermogénique Ucp1 a été observé spécifiquement dans les MTD.

Les lectures mitochondriales étaient inférieures à 2% et la fraction sous les pics était d’environ 18% à 44%Plusieurs pics forts avec des rapports signal sur bruit élevés ont été révélés près des gènes marqueurs adipocytaires tels que Adipoq, Fabp4 et Plin1 de tous les dépôts adipeux. De forts pics ATAC-seq ont été observés au locus du marqueur adipocytaire brun Ucp1 dans l’échantillon BAT. Le facteur le plus critique pour ce protocole est la qualité du noyau.

Il est important d’utiliser des échantillons de tissus de haute qualité et de manipuler délicatement les noyaux tout au long de l’expérience, en particulier pendant la remise en suspension après centrifugation et tri. Il est important de se rappeler que ce protocole repose sur des souris rapporteures transgéniques marquées au nucléaire. Des souris NuTRAP ont été utilisées ici, mais tout système similaire peut être utilisé.

Avec nos données FACS, on peut effectuer des analyses multiples computationnelles pour trouver des facteurs transcriptomiques clés qui régulent l’expression des gènes dans des contextes biologiques.