Établissement, entretien, différenciation, manipulation génétique et transplantation d’organoïdes lacrymaux et humains

Avec les organoïdes des glandes lacrymales, on peut examiner comment certains gènes contrôlent l’homéostasie des glandes lacrymales. De plus, les organoïdes peuvent être utilisés pour la médecine régénérative. Le principal avantage de la technologie organoïde des glandes lacrymales dérivées de cellules souches adultes est qu’elle permet la croissance et l’étude de cellules épithéliales saines et non transformées de glandes lacrymales.

Ces organoïdes pourraient éventuellement être utilisés pour traiter les patients atteints de sécheresse oculaire. Commencez par préparer le milieu et le matériel requis pour l’expérience, puis combinez tous les composants du milieu de digestion avant l’expérience. Pré-mouiller les scalpels dans ce milieu pour éviter que des morceaux de tissu ne s’y collent.

Récupérez le tissu lacrymal de la souris dans le milieu, placez-le dans la boîte de Petri et hachez-le à l’aide de scalpels pré-mouillés. Une fois que les morceaux de tissu sont inférieurs à 0,5 millimètre cube, grattez-les de la boîte de Petri avec le scalpel et transférez-les dans un tube de 15 millilitres contenant le milieu de digestion. Pour une très petite biopsie humaine, placez-la directement dans le milieu digestif sans hacher.

Incuber le tube de 15 millilitres contenant des morceaux de tissu jusqu’à 15 minutes dans un bain-marie de 37 degrés Celsius. Pendant ce temps, réduisez l’embout d’une pipette Pasteur dans une flamme et pré-mouillez-la dans le milieu de base. Pour faciliter le processus de dissociation, pipeter le mélange haché de haut en bas toutes les cinq minutes avec la pipette Pasteur pré-mouillée et rétrécie.

Lorsque de nombreuses cellules individuelles et de petits amas sont visibles au microscope, arrêtez la dissociation en ajoutant 10 millilitres du milieu de base. Après avoir tourné à 400 g pendant cinq minutes, retirez le surnageant et remettez le granulé en suspension dans 10 millilitres du milieu de base pour répéter le lavage et le granulé dans les cellules. Retirez les gros morceaux de tissu non digérés et les fibres de collagène restantes en filtrant le mélange haché à travers une passoire de 70 micromètres.

Faire tourner l’éluat à 400g pendant cinq minutes. Après avoir retiré le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 100 microlitres de matrice extracellulaire froide, ou ECM, pour une seule glande lacrymale de souris et 50 microlitres d’ECM froide pour une biopsie humaine, sans créer les bulles. Ensemencer jusqu’à 100 microlitres de cellules par puits d’une plaque de suspension de 12 puits à l’aide d’un P200 pour fabriquer des gouttelettes d’environ 20 microlitres dans le puits.

Placez la plaque à l’envers dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes pour permettre la solidification de l’ECM. Une fois l’ECM solidifié, ajoutez environ un millilitre de milieu d’expansion souris à température ambiante par puits d’une plaque de 12 puits. Préparez fraîchement un millilitre de milieu de différenciation humain contenant des composants individuels qui induisent la sécrétion par les organoïdes de la glande lacrymale.

À l’aide d’un microscope accéléré à fond clair automatisé, définissez les positions à imager dans la plaque, l’intervalle de temps de cinq minutes et la durée de quatre heures. Assurez-vous qu’une gouttelette ECM entière est visible à chaque position. Avant de commencer à imager, retirez le milieu de culture des puits à imager sans déplacer la plaque du microscope et remplacez-le par le milieu de différenciation humain fraîchement préparé et bien remis en suspension contenant des composés, y compris la forskoline et la noradrénaline.

Comme témoin négatif, inclure un puits avec un milieu de différenciation rafraîchi. Cliquez sur le bouton Exécuter du microscope et analysez les résultats après quatre heures. Après avoir dissocié les organoïdes comme mentionné dans le texte, jeter le surnageant.

Remettez les cellules en suspension dans 80 microlitres du tampon d’électroporation. Dans un tube de 1,5 millilitre, préparez les plasmides nécessaires à l’expérience. Ajouter les plasmides aux cellules, et bien mélanger en pipetant de haut en bas.

Configurez l’électroporateur avec les paramètres d’impulsion de pores et d’impulsion de transfert. Placer les cellules avec les plasmides dans une cuvette d’électroporation. Mesurez immédiatement la résistance, qui doit être comprise entre 0,3 ampère et 0,55 ampère, et électroportez immédiatement.

Une fois cela fait, transférez les cellules dans un tube de 1,5 millilitre et ajoutez 400 microlitres de tampon d’électroporation complété par un inhibiteur de la rho-kinase. Laissez les cellules récupérer à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, pelletez les cellules à 500g pendant cinq minutes.

Après avoir jeté le surnageant, plaquez les cellules dans 200 microlitres d’ECM. Après solidification, ajouter le milieu d’expansion de la souris. Pour la préparation organoïde, diviser les organoïdes de la glande lacrymale humaine environ trois jours avant le jour de la transplantation.

Pour extraire les organoïdes de l’ECM, ajoutez de la dispase au milieu de culture pour atteindre une concentration finale de 0,125 unité par millilitre, et remettez soigneusement en suspension les gouttelettes ECM pour les perturber à l’aide d’un P1000. Replacez l’assiette dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Remettez les organoïdes en suspension dans 10 millilitres de milieu basique pour éliminer l’enzyme.

Après avoir granulé les cellules à 400g pendant cinq minutes, les remettre en suspension dans 50 microlitres de milieu d’expansion humain froid complété par 5% ECM. Placez la suspension organoïde sur de la glace et procédez immédiatement à la transplantation. Pour la transplantation orthotopique chez la souris, aspirer la suspension organoïde dans une aiguille à insuline.

Lorsque la souris est endormie, placez-la rapidement sur le côté avec la glande lacrymale principale accessible. Injectez cinq microlitres de la suspension organoïde directement à travers la peau dans la glande lacrymale. Laissez la souris récupérer et évaluez quotidiennement la présence de tout inconfort lié à la transplantation, en particulier dans l’œil.

Suite à la dissection de la glande lacrymale de la souris, la digestion enzymatique et mécanique a généré de petits fragments de tissus, y compris les acini et les canaux. Dans la dérivation réussie des organoïdes de la glande lacrymale de souris, des organoïdes kystiques d’environ 500 micromètres de diamètre ont été trouvés après sept jours. Les organoïdes des glandes lacrymales humaines se sont développés sous forme de kystes en trois à quatre jours et ont atteint une taille adulte en 10 à 14 jours après l’isolement tissulaire.

Après cinq jours et sept jours, respectivement, dans le milieu de différenciation, les organoïdes de la glande lacrymale humaine et de la souris sont devenus plus denses. L’application de l’activateur cyclique de l’AMP forskoline ou du neurotransmetteur noradrénaline a entraîné un gonflement organoïde en moins de trois heures. Lors d’une électroporation réussie, des organoïdes résistants à l’hygromycine se sont développés.

Les clones organoïdes en croissance de plus de 300 micromètres ont été choisis avant leur différenciation. L’amplification par PCR du locus Pax6 ciblé par l’ARN guide a donné une bande de paires de bases 367 pour tous les clones sélectionnés. Un clone homozygote de glande lacrymale de souris knock-out sur six séquencés a été obtenu en utilisant l’ARN guide ciblant Pax6.

Certains clones ont bien poussé, mais certains clones organoïdes ont été perdus après la cueillette ou ont commencé à se différencier. Sur les 10 clones organoïdes choisis, sept ont bien poussé. La greffe d’organoïdes a été confirmée un mois après l’injection des organoïdes dans la glande lacrymale de la souris par coloration pour un marqueur spécifique à l’homme, l’antigène nucléolaire humain.

Une chose à laquelle il faut faire attention est de ne pas trop digérer les tissus, ni les organoïdes. Sinon, les cellules pourraient mourir, ce qui réduirait le taux d’établissement organoïde. Les organoïdes des glandes lacrymales peuvent être analysés par histologie.

Ce faisant, on peut avoir un aperçu de leur composition cellulaire.