Un modèle murin de fibrose hépatique chronique pour l’étude de l’atrésie biliaire

Nous avons utilisé avec succès cette méthode pour créer un modèle murin plus cohérent avec les changements pathologiques de l’atrésie biliaire. Cette technique peut simuler les symptômes de l’atrésie biliaire aiguë et chronique, ce qui est utile pour la recherche future sur le mécanisme de la maladie. Après l’utilisation d’anticorps, le temps de survie des souris a été prolongé et les symptômes ont été atténués, suggérant l’effet thérapeutique de l’anticorps sur l’atrésie biliaire.

Après avoir divisé les souris néonatales en différents groupes, comme décrit dans le manuscrit, prétraiter chaque souris avec une injection intrapéritonéale de cinq microgrammes d’anticorps anti-Ly6G quatre heures avant l’injection de rotavirus rhésus ou RRV pour épuiser les cellules Gr1-positives. Dans les 24 heures suivant la naissance, injectez par voie intrapéritonéale à la souris néonatale 20 microlitres de rotavirus rhésus ou de solution saline. Après l’injection de RRV, administrer 20 microgrammes d’anticorps anti-Ly6G dans l’abdomen de la souris.

Vérifiez et notez l’apparence, le poids et la survie de toutes les souris quotidiennement. Pour l’injection intrapéritonéale, exposer l’abdomen de la jeune souris en pinçant la peau du cou avec l’index et le pouce d’une main et en tenant doucement les pattes postérieures de la souris avec l’annulaire et l’auriculaire. Soulevez l’aiguille de la seringue vers le haut et insérez l’aiguille dans le milieu de la cuisse arrière droite de la souris à un angle de 15 degrés avec la peau.

Tout en déplaçant l’aiguille le long du chemin sous-cutané jusqu’à ce qu’elle atteigne le bord costal droit de la souris, dirigez l’aiguille vers le bas dans la cavité abdominale et injectez le liquide sous le foie de la souris. Retirez l’aiguille immédiatement après l’injection. Observez s’il y a des saignements ou des fuites au site d’injection.

Après avoir anesthésié la souris le 12ème jour, disséquez-la au microscope. Insérez une seringue d’insuline d’un millilitre dans le ventricule gauche du cœur pour recueillir du sang. Centrifuger le sang à 400 g pendant cinq minutes à température ambiante et séparer le sérum pour les mesures de la fonction hépatique.

Disséquer le foie et la rate de souris des tissus environnants à l’aide de ciseaux et d’une pince à épiler. Photographiez l’aspect général du foie et des voies biliaires. Après l’anesthésie par inhalation, exposer le foie, la vésicule biliaire et les voies biliaires extrahépatiques avec des ciseaux et des cotons-tiges.

Sous un microscope postal, injectez cinq à 10 microlitres du colorant fluorescent Rhodamine 123 dans la vésicule biliaire avec une seringue à insuline d’un millilitre et prenez des photos. Immergez le tissu hépatique frais de souris dans du formol à 10% pendant 24 heures. Une fois que le tissu est incorporé dans la paraffine, utilisez un microtome de paraffine pour couper le bloc de paraffine en sections d’une épaisseur de quatre micromètres et placez deux sections consécutives sur la même lame.

Placez ensuite les tranches dans une grille de tranchage, dépaillez-les dans du xylène et hydratez-les successivement dans de l’éthanol absolu, de l’éthanol à 95%, de l’éthanol à 80%, de l’éthanol à 70% et de l’eau distillée pendant cinq minutes chacune. Colorez les sections avec une solution d’hématoxyline pendant cinq minutes et faites-les tremper dans de l’acide chlorhydrique à 1% et de l’alcool à 75% pendant cinq secondes. Après avoir rincé les sections à l’eau claire, colorez-les avec une solution d’éosine pendant une minute.

Préparer les coupes de tissu pour la coloration, comme démontré précédemment, et effectuer la réparation de l’antigène avec le tampon Tris-EDTA. Chauffer les sections dans un four à micro-ondes à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis les retirer et les refroidir naturellement à température ambiante. Pour éliminer la peroxydase endogène, placez les sections de tissu dans du peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 10 minutes et traitez les tranches avec du sérum de chèvre à 5 % pour bloquer la liaison non spécifique.

Ensuite, ajoutez l’anticorps monoclonal primaire anti-souris Cytokeratin 19 ou Rat anti-souris F4 / 80 aux sections, et incuber pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Incuber les sections avec les anticorps secondaires appropriés pendant 30 minutes à température ambiante. Utilisez la 3, 3-prime-diaminobenzidine comme agent chromogène pour observer la réaction chromogène au microscope.

Observez les tranches au microscope 40x pour obtenir des images et les analyser au besoin. Une fois les sections de tissu préparées et contre-colorées avec de l’hématoxyline, couvrir chaque tissu avec 50 microlitres de solution de colorant rouge sirius à température ambiante pendant une heure. Séchez les lames naturellement à température ambiante pendant quatre heures, ajoutez une goutte de gomme neutre à chaque lame et utilisez un couvercle pour couvrir le tissu afin d’éviter les bulles.

Laissez les lames à température ambiante pendant 24 heures pour solidifier la gomme neutre. Observez les détails du dépôt de collagène à l’aide de la microscopie à contraste polarisé. Sélectionnez un champ de vision clair et approprié, et ajustez la luminosité et la balance des blancs du champ visuel du microscope.

Obtenez des images et analysez-les au besoin sous un microscope 40x. Après l’injection de RRV, le temps de survie médian dans le groupe RRV était de 13 jours. La plupart des souris traitées avec l’anticorps ont développé une légère jaunisse et aucune perte de poids n’a été observée.

Le foie des souris BA présentait des lésions nécrotiques et un segment extrahépatique d’atrésie des voies biliaires. La taille du foie est plus petite que celle des témoins. L’analyse histologique a montré que le traitement anti-Ly6G à faible dose diminuait l’inflammation de la veine porte.

Une accumulation de cellules inflammatoires a encore été observée dans les tranches de tissu hépatique au jour 42. Le jour 12, il y avait une légère augmentation des dépôts de collagène dans la région portail. Au jour 42, l’expression du collagène a été significativement augmentée et un dépôt substantiel de collagène a été observé dans le tissu BA.

Les cellules CK19-positives ont été observées au jour 12. Au jour 42, les cellules CK19-positives ont augmenté, mais il y avait peu de voies biliaires matures. Les voies biliaires extrahépatiques chez les souris BA chroniques étaient bloquées et présentaient des infiltrats inflammatoires de microphages.

Les taux d’ALT et d’ALP dans le foie étaient plus élevés dans le groupe BA chronique que dans le groupe témoin normal. Les taux de bilirubine totale, de bilirubine directe et de bilirubine indirecte ont augmenté, ce qui indique que la fonction hépatique était significativement réduite au stade de la fibrose chronique de l’AB. L’injection doit être faite avec prudence pour ne pas percer le foie de souris. Après l’injection, nous devrions prendre environ 10 secondes pour observer l’état de la souris et nettoyer le sang de la plaie.