Name: Visualisation d’organites in situ par tomographie cryo-STEM (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Découvrez la tomographie cryo-STEM pour visualiser les organites dans des cellules intactes avec une résolution 3D de quelques nanomètres. Cette technique non invasive préserve les structures biologiques dans leur état natif.

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Le protocole devrait aider les microscopistes des sciences de la vie qui souhaitent obtenir une vue 3D des organites intracellulaires dans des régions de la cellule qui ne sont pas accessibles à la tomographie TEM conventionnelle. Le même protocole peut également être utilisé pour la tomographie STEM des sections en plastique, avec des contraintes assouplies sur l’exposition. Le protocole devrait être considéré comme un point de départ plutôt que comme un ensemble de règles strictes. En effet, la puissance des STIM réside dans leur flexibilité; Il n’y a pas une seule bonne façon de l’exploiter.
Nous soulignons que STEM, en soi, ne fait référence qu’à la sonde scannée et ne définit pas la formation de l’image. Le contraste dépend principalement de la configuration des détecteurs. Les méthodes les plus simples utilisent des détecteurs à symétrie axiale, soit un disque centré sur l’axe optique, soit un anneau l’entourant. En général, lorsque l’éclairage frappe directement le détecteur, nous enregistrons une image BF où l’échantillon (diffusion d’électrons) apparaît sombre; à l’inverse, lorsque le détecteur ne collecte que des électrons dispersés, nous enregistrons une image DF où le spécimen dense apparaît brillant. Lorsque le matériel approprié est disponible, SerialEM peut acquérir et enregistrer ces deux signaux simultanément. Des configurations encore plus sophistiquées sont disponibles, allant des détecteurs à segments multiples aux caméras entièrement pixélisées. L’imagerie de contraste de phase peut être réalisée, par exemple, en évaluant la différence entre les éléments détecteurs hors axe32,33. La collecte de l’ensemble du motif de diffusion 2D (diffraction) par pixel définit la méthode connue sous le nom de 4D STEM34, qui permet la reconstruction de plusieurs contrastes d’image à partir des mêmes données d’origine. Le STEM quadridimensionnel permet la ptychographie électronique, ce qui fournit un autre moyen d’obtenir un contraste de phase35.
Nous nous sommes concentrés sur la modalité STEM particulière que nous considérons comme la plus utile pour l’étude des organites et des cellules intactes ou des sections de cellules de l’épaisseur du micron. Cela implique spécifiquement l’utilisation de l’imagerie BF avec un petit angle de semi-convergence dans l’éclairage et un angle de collecte relativement grand au niveau du détecteur. La petite convergence offre une grande profondeur de champ de sorte que l’ensemble de l’échantillon reste au point tout au long de la série d’inclinaison19. En pratique, avec un bon étage de microscope, il peut également éliminer le besoin d’ajustement de la mise au point lors de l’acquisition. Le prix est un compromis dans la résolution, tel que décrit à la section 3 du protocole. Nous avons suggéré des images 4k avec une sonde de ~2 nm, qui avec un espacement de pixels de 1 nm atteint un champ de vision de 4 μm. Cependant, le lecteur est fortement encouragé à expérimenter. La deuxième considération est du côté du détecteur. Lorsque le disque d’éclairage sous-remplit le détecteur BF sur axe, le contraste de phase est supprimé et le contraste de diffusion (amplitude) domine; Cette condition a été appelée contraste de champ lumineux incohérent36. La question est de savoir par quelle fraction sous-remplir, et la réponse dépend de l’échantillon. Un échantillon très mince montrera le meilleur contraste avec le détecteur complètement rempli (c’est-à-dire que l’angle de collecte correspond à celui de l’éclairage), mais un échantillon plus épais dispersera toute l’intensité, laissant un signal bruyant avec un faible contraste. Une règle empirique utile est que plus l’échantillon est épais, plus l’angle de coupure externe du détecteur BF doit être de21. La taille et la position du détecteur sont bien sûr fixes, de sorte que la taille du disque de diffraction est ajustée en fonction de la longueur de la caméra, comme décrit dans la section 1. Si les réglages de l’amplificateur du détecteur sont tels que le signal remplit la plage dynamique mais ne sature pas sous éclairage direct (1.12.3), la longueur de la caméra peut être augmentée jusqu’à ce qu’une intensité et un contraste raisonnables soient atteints. Encore une fois, le lecteur est encouragé à expérimenter. L’art, pour ainsi dire, est dans les angles.
Un autre paramètre, non abordé dans le protocole, est la tension d’accélération du microscope. L’interaction des électrons éclairants avec l’échantillon sera plus forte à une tension inférieure. Toutes choses égales par ailleurs, nous pouvons nous attendre à un contraste plus élevé à une tension inférieure. D’autre part, c’est le début de la diffusion multiple dans l’échantillon qui limite l’épaisseur utilisable de l’échantillon, de sorte qu’une tension plus élevée permet l’utilisation d’échantillons plus épais. Ces effets sont cependant plutôt subtils. Nos expériences à ce jour avec les accélérations de 200 kV et 300 kV sont similaires.
Compte tenu de ce que l’on peut attendre de STEM en termes de résolution, cela dépend encore une fois de l’échantillon et de la configuration du détecteur. En utilisant une approche d’analyse de particules unique, les ions métalliques sur ferritine pourraient être localisés par champ noir annulaire STEM avec une précision de quelques angströms37. Plus récemment, une résolution subnanométrique a été atteinte pour des échantillons de virus et de protéines en utilisant des images obtenues par contraste de phase différentiel intégré (iDPC) STEM32 ainsi que par ptychographie35. Pour des objets uniques dans des spécimens cellulaires épais, et avec les méthodes décrites ici, une telle résolution élevée n’est pas réaliste. La résolution optimale est le diamètre de la sonde, qui se rapporte à l’angle de semi-convergence tel que décrit. D’autres facteurs dégraderont la résolution, en particulier un échantillonnage grossier des pixels pour atteindre un grand champ de vision, des désalignements dans la série d’inclinaison et l’étalement du faisceau de la sonde lors de la transmission. Les images se comparent bien à la tomographie en coupe. Avec la configuration décrite ici, par exemple, il devrait être facile de voir le noyau creux des microtubules, mais pas les protofilaments individuels.
Pour résumer, les méthodes et le matériel STEM sont tous deux en phase de développement. Nous pouvons nous attendre à ce que les innovations en imagerie aient également un impact sur la tomographie, conduisant les STIM dans des domaines qui n’ont pas été accessibles par d’autres techniques. Nous nous attendons à ce qu’une convergence avec l’imagerie cryogénique de fluorescence corrélative basée sur des méthodes modernes de super-résolution optique soit particulièrement fructueuse. L’échelle des organites, 100-1 000 nm, est une cible idéale pour ces méthodes émergentes.

La visualisation tridimensionnelle (3D) des organites est une tâche primordiale en biologie cellulaire moderne. Compte tenu des échelles impliquées, allant de dizaines de nanomètres pour les vésicules sécrétoires à de nombreux microns pour le noyau cellulaire, il est difficile de trouver une seule technique de microscopie adaptée à toutes les applications. Alors que la microscopie à fluorescence moderne peut couvrir une grande partie de la gamme en termes de résolution, seules les molécules marquées apparaissent. Le théâtre cellulaire reste le domaine de la microscopie électronique. Les méthodes conventionnelles de fixation chimique, d’enrobage plastique et de coloration avec des métaux lourds sont fortement invasives, de sorte que les résultats peuvent dépendre des détails de la préparation des échantillons. La cryo-EM, d’autre part, est contrainte par la nécessité de vitrifier le milieu aqueux; Les cristaux de glace qui forment diffractent l’illumination électronique, provoquant des artefacts de contraste plus contrastés que le matériau organique d’intérêt.
La dernière décennie a vu une prolifération de techniques d’imagerie EM développées ou adaptées pour les études cellulaires1. La congélation à haute pression combinée au fraisage itératif par faisceau d’ions focalisés (FIB) et à l’imagerie de surface en série à l’aide du microscope électronique à balayage (c.-à-d. FIB-SEM) est actuellement la méthode de choix pour les grands échantillons2. La tomographie cryogénique à rayons X mous (cryo-SXT) convient aux échantillons de plusieurs microns, limités par la longueur d’absorption caractéristique des rayons X mous dans l’eau 3,4,5. Cette échelle comprend de nombreux types de cellules intactes, et la nature quantitative du contraste d’absorption des rayons X ajoute un aspect de mesure de concentration6 ou spectroscopie7. Lorsqu’elle est combinée à la moyenne des sous-tomogrammes, la cryotomographie électronique à transmission (cryo-ET), basée sur la microscopie électronique à transmission à contraste de phase (MET), offre la résolution la plus élevée pour les macromolécules ou les complexes 8,9,10. Cependant, il est rare que les organites intacts soient si réguliers qu’ils puissent être moyennés entiers. De plus, le mode conventionnel de TEM grand champ est limité pour l’épaisseur de l’échantillon à quelques centaines de nanomètres par la combinaison de la diffusion inélastique (impliquant une perte d’énergie) dans l’échantillon et de l’aberration chromatique dans la lentille magnétique de l’objectif11,12. La grande dispersion d’énergie dicte l’utilisation d’un filtre à énergie pour éliminer la brume floue qui en résulte, mais l’échantillon sensible subit toujours des dommages de rayonnement tandis que le signal d’image devient exponentiellement plus faible avec l’épaisseur croissante.
Le mode d’imagerie alternatif, la transmission à balayage EM (STEM), contourne le besoin de filtrage de l’énergie et conserve les électrons dispersés inélastiquement pour la formation d’images, bien qu’actuellement à une résolution inférieure à celle de la tomographie TEM (Figure 1). En fait, aucune image réelle n’est formée. Au lieu de cela, comme dans un EM de numérisation, les mesures sont effectuées point par point et l’image est assemblée par l’ordinateur. Le grossissement est déterminé uniquement par la taille des étapes de numérisation sans modifier les courants de l’objectif. Lorsqu’elle est correctement configurée, la plage utile d’épaisseur de l’échantillon pour la tomographie cryo-STEM (CSTET) peut atteindre 1,5 ou même 2 μm, bien que la zone de confort, où l’intensité du signal utile reste une fraction significative de l’éclairage, soit d’environ 600-900 nm11,13. Ceci est suffisant pour voir une grande fraction du cytoplasme, et parfois un bord du noyau cellulaire. En pratique, nous constatons que la vitrification par la méthode standard de plongée dans le fluide cryogénique impose une contrainte d’épaisseur plus sévère que l’imagerie STEM. L’objectif de cet article vidéo est de faciliter l’incorporation du CSTET dans le coffre à outils pour l’imagerie cellulaire et organite dans les laboratoires de recherche et les installations de microscopie.
Le premier défi est que les opérations de microscope au CSTET ne sont pas encore normalisées pour les applications des sciences de la vie comme elles l’ont été pour la tomographie cryo-TEM. Le matériel STEM a rarement (voire jamais) été ciblé sur le marché cryo-EM. Cependant, cela change avec la dernière génération de microscopes, et de nombreux outils existants peuvent être installés ultérieurement. Les STIM en tant que technique ont pris leur envol et ont largement pris le dessus dans les sciences des matériaux, où il existe également un intérêt naissant pour les méthodes cryogéniques et à faible dose14,15. La littérature sur la science des matériaux regorge d’acronymes BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM, etc., qui ajoutent à la confusion. Nous proposons ici un point de départ recommandé qui, dans notre expérience collective à l’Institut Weizmann des sciences, fournit le protocole le plus général pour des résultats utiles basés sur l’imagerie STEM en fond clair (BF)16. Il n’épuise ni n’explore en aucun cas l’éventail des possibilités, mais il servira de base à d’autres améliorations. Bien que nous mettions l’accent sur la cryo-STEM, la majeure partie du protocole est également pertinente pour la tomographie STEM à température ambiante des sections incorporées dans du plastique.
L’essence de STEM est de scanner l’échantillon avec une sonde électronique focalisée (Figure 1), le cône d’éclairage, et d’enregistrer les signaux du plan de diffraction (diffusion) en transmission, pixel par pixel, pour produire des images 2D17,18. Les échantillons amorphes, y compris la plupart des matériaux cellulaires, produiront un schéma de diffusion diffuse lors de la transmission. La configuration pratique la plus simple consiste à placer un détecteur circulaire pour enregistrer le disque central (c.-à-d. l’éclairage de la sonde qui serait transmis sans échantillon). L’échantillon disperse les électrons loin de ce cône d’illumination dans la mesure où le signal diminue. Cela produit une image BF - le spécimen apparaît sombre sur un fond clair. Un détecteur annulaire peut également (ou à la place) être utilisé pour détecter la diffusion de l’échantillon à l’extérieur du cône d’éclairage. Une fois l’échantillon retiré, il n’y a pas de signal. Lorsqu’un spécimen est en place, les objets apparaissent lumineux sur un fond sombre dans l’image en champ sombre (DF). La nomenclature pour les STEM (BF, champ noir annulaire [ADF], champ noir annulaire à angle élevé [HAADF], etc.) se réfère principalement aux gammes d’angles de collecte pour les détecteurs.
L’angle de convergence de l’éclairage représente une adaptation essentielle des STEM à la tomographie cellulaire. Lorsque la priorité absolue est la haute résolution, l’angle de convergence doit être aussi grand que possible. (Ceci est similaire à la microscopie confocale à balayage laser; la résolution est déterminée par le diamètre de la sonde, qui évolue comme la longueur d’onde divisée par l’ouverture numérique. Notez que nous nous référons au demi-angle ou à l’angle de semi-convergence pour EM.) Lorsque la priorité est la profondeur de champ, en revanche, un compromis de résolution offre un grand avantage, car le faisceau focalisé reste à peu près parallèle sur une distance égale à deux fois la longueur d’onde divisée par un demi-angle au carré. Idéalement, l’ensemble du volume cellulaire reste au centredes préoccupations 19. Par exemple, à 300 keV, la longueur d’onde de deBroglie de l’électron est de 0,002 nm, donc une convergence de 1 mrad donne une résolution de 2 nm et une profondeur de champ de 4 microns. Dans ces conditions, la tomographie peut être effectuée même sans focalisation pendant le processus de collecte des données, mais une seule fois au début de l’acquisition. Un STEM conventionnel capable de tomographie peut atteindre un angle de semi-convergence de 7 ou 8 mrad; Par conséquent, en principe, nous pourrions atteindre une résolution de l’ordre de 0,25 nm, mais avec une profondeur focale de seulement 62 nm. C’est clairement trop mince pour l’imagerie cellulaire. Les microscopes plus avancés avec trois lentilles à condensateur offrent un réglage continu de l’angle de semi-convergence sur une plage considérable. Avec la configuration plus traditionnelle à deux condensateurs, la convergence est fixée discrètement par l’ouverture du condensateur (C2).
Pour les échantillons robustes et incorporés dans du plastique, on peut enregistrer une série focale à chaque inclinaison et les combiner pour une haute résolution20, mais pour les échantillons cryogéniques, le bilan de rayonnement est trop sévèrement limité. Enfin, en pesant les avantages de l’imagerie BF ou DF, pour les éprouvettes épaisses, il faut tenir compte des effets de la diffusion élastique multiple dans l’échantillon. Le signal BF est moins corrompu par la diffusion multiple et montre une résolution plus élevée pour les échantillons épais16,21.
Une règle empirique utile a été de définir des angles de collecte plusieurs fois plus grands que la convergence. Plus le spécimen est épais, plus le disque de collecte doit être grand. Un disque trop petit fournira une faible intensité de signal; Un disque trop grand entraînera un mauvais contraste d’image, car seule la diffusion à angle le plus élevé y contribuera. Les angles de collecte doivent être optimisés pour un échantillon donné. Les angles du détecteur en fonction de la longueur (diffraction) de la caméra doivent être étalonnés indépendamment. Ils peuvent être affichés commodément par le logiciel de microscope. Dans la pratique, un facteur de deux à cinq dans le rapport entre les demi-angles de collecte et d’éclairage, θ à α, respectivement (figure 1), est un point de départ recommandé pour le CSTET d’échantillons cellulaires.
Le protocole suivant décrit le fonctionnement de la tomographie STEM à l’aide du logiciel populaire SerialEM pour le contrôle du microscope22,23. SerialEM n’est pas lié à un fabricant spécifique et est largement utilisé en tomographie TEM. La plupart des opérations de mise en place de la tomographie peuvent être reportées directement de TEM. La stratégie de SerialEM consiste à modéliser le système de numérisation comme une caméra. Cela permet un passage simple de TEM à STEM. Il faut cependant garder à l’esprit que les paramètres tels que le grossissement et le regroupement sont entièrement artificiels. Les paramètres importants sont le champ de vision en microns, le nombre de pixels dans le champ de vision et le temps d’exposition. L’espacement des pixels, ou échantillonnage, est le champ linéaire divisé par le nombre de pixels, tandis que le temps de séjour est le nombre de pixels divisé par le temps d’exposition.
La configuration minimale pour STEM et CSTET implique trois caractéristiques sur le microscope: un générateur de balayage, un détecteur STEM et un logiciel de contrôle de la tomographie. Le protocole fait référence à la nomenclature de FEI/Thermo Fisher Scientific (TFS), mais les concepts sont génériques. Le logiciel propriétaire de TFS a été décrit dans JoVE pour TEM24, et le fonctionnement STEM est très similaire.
Nous supposons que le microscope a été aligné à l’avance par l’équipe de service ou le personnel expérimenté et qu’un alignement de colonne peut être appelé en chargeant un fichier. Les ajustements mineurs sont appelés alignements directs et peuvent être stockés dans des registres dits FEG (microscopes TFS). Les alignements directs comprennent le centre de rotation, les points de pivot, l’alignement de diffraction et la compensation de l’astigmatisme du condenseur. Les ajustements doivent être effectués de manière itérative. Notez que les microscopes TFS implémentent des modes distincts de nanosonde (nP) et de microsonde (μP); pour une ouverture de condensateur donnée, ceux-ci fournissent un champ de vision relativement étroit ou large avec un éclairage parallèle en TEM et un faisceau d’électrons plus ou moins convergent (étroitement focalisé) en STEM, respectivement. D’autres fabricants utilisent des schémas différents pour couvrir la gamme des angles de convergence.
Avant de commencer, le champ de vision, L, et l’échantillonnage (largeur de pixels), l, doivent être choisis en fonction de l’échantillon étudié. Par exemple, pour l = 1 nm/pixel, une image de 4 000 x 4 000 pixels qui couvrira un champ de vision de 4 μm2 doit être choisie. La résolution sera, au mieux, deux fois supérieure à l’échantillonnage spatial, donc 2 nm, et le diamètre de la sonde, d, devrait correspondre à cela. L’étalonnage de l’angle de la sonde dépasse le cadre de ce protocole, nous supposons donc qu’un tableau ou une lecture d’écran est disponible. Le diamètre de la sonde est approximativement la longueur d’onde électronique divisée par l’angle de semi-convergence (en radians): d = λ/θ. La longueur d’onde, λ, est de 0,002 nm pour 300 keV et de 0,0025 nm pour les électrons de 200 keV, de sorte que θ de 1 mrad fournira un diamètre de point de 2 ou 2,5 nm, respectivement.
Le protocole est présenté dans une progression de plus en plus complexe. La première tâche consiste à produire une image STEM, qui dépend du logiciel du fabricant du microscope, puis une série d’inclinaison, pour laquelle nous utilisons SerialEM. De nombreux lecteurs seront sans aucun doute familiers avec SerialEM, de sorte que les tâches les plus compliquées viendront naturellement. Il n’est pas nécessaire de suivre strictement les procédures. Les développements relatifs à l’automatisation peuvent être mis en œuvre directement pour les STEM ainsi que pour la GDT. Les utilisateurs expérimentés inverseront probablement le protocole, en commençant par l’enregistrement corrélatif des cartes de fluorescence et en continuant à mettre en place la tomographie par lots. Vous trouverez plus de détails dans la documentation complète et les bibliothèques de tutoriels de SerialEM lui-même, y compris un article récent de JoVE sur les derniers développements en matière d’automatisation25.

<table><tbody><tr><td>&nbsp ; SerialEM</td><td>Université du Colorado</td><td>Veriosn 4.0</td><td>SerialEM est une plate-forme logicielle gratuite pour le contrôle des microscopes et l’acquisition de données.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Le protocole a été rédigé sur la base de l’expérience acquise avec plusieurs microscopes de Thermo Fisher Scientific : Titan Krios, Talos Arctica et Tecnai T20-F. En principe, il devrait également être applicable à d’autres fabricants.</td></tr></tbody></table>

visualisation d’organites in situ par tomographie cryo-stem

Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography

La microscopie électronique cryogénique (cryo-EM) repose sur l’imagerie de spécimens biologiques ou organiques incorporés dans leur milieu aqueux natif; L’eau est solidifiée en verre (c.-à-d. vitrifiée) sans cristallisation. La méthode cryo-EM est largement utilisée pour déterminer la structure de macromolécules biologiques récemment à une résolution quasi atomique. L’approche a été étendue à l’étude des organites et des cellules par tomographie, mais le mode conventionnel d’imagerie EM à transmission à grand champ souffre d’une limitation sévère de l’épaisseur de l’échantillon. Cela a conduit à une pratique de broyage de lamelles minces à l’aide d’un faisceau d’ions focalisés; La haute résolution est obtenue par sous-tomogramme en faisant la moyenne des reconstructions, mais les relations tridimensionnelles à l’extérieur de la couche restante sont perdues. La limitation d’épaisseur peut être contournée par l’imagerie par sonde scannées, similaire à l’EM à balayage ou au microscope confocal à balayage laser. Alors que la microscopie électronique à transmission à balayage (STEM) en science des matériaux fournit une résolution atomique dans des images uniques, la sensibilité des échantillons biologiques cryogéniques à l’irradiation électronique nécessite des considérations particulières. Ce protocole présente une configuration pour la cryotomographie utilisant STEM. La configuration topique de base du microscope est décrite pour les systèmes à deux et trois condensateurs, tandis que l’automatisation est fournie par le logiciel non commercial SerialEM. Les améliorations apportées à l’acquisition des lots et à l’alignement corrélatif sur les cartes de fluorescence acquises précédemment sont également décrites. À titre d’exemple, nous montrons la reconstruction d’une mitochondrie, en soulignant la membrane interne et externe et les granules de phosphate de calcium, ainsi que les microtubules, les filaments d’actine et les ribosomes environnants. La tomographie cryo-STEM excelle à révéler le théâtre des organites dans le cytoplasme et, dans certains cas, même la périphérie nucléaire des cellules adhérentes en culture.

Un montage de grille complet préparé dans STEM montre les zones avec des cellules d’intérêt (Figure 4). Notez que l’image est en champ sombre, de sorte que les trous vides apparaissent sombres. Les cellules apparaissent partiellement brillantes, où les électrons sont dispersés vers le détecteur HAADF. Dans les parties les plus épaisses, généralement les centres ou près des barres de grille, le contraste redevient sombre. Cela est dû à la diffusion multiple, par laquelle les électrons atteignent des angles non capturés par le détecteur. En pratique, ces zones seront trop épaisses pour la tomographie.
L’étape suivante implique des cartes de grossissement intermédiaire (Figure 10). Celles-ci sont souvent appelées cartes de montage moyen, ou cartes carrées, se référant aux carrés de la grille plutôt qu’à la forme. Même au mode STEM de microsonde le plus bas, ils seront également acquis sous forme d’images de montage. Cliquez sur l’élément dans la fenêtre Navigateur pour charger l’image de la carte dans la fenêtre principale. Des points spécifiques pour l’acquisition du tomogramme sont choisis dans cette zone. Utilisez le mode Aperçu pour localiser la zone au niveau du grossissement de l’enregistrement. Gardez à l’esprit qu’il peut y avoir un décalage latéral entre l’aperçu et l’enregistrement, en fonction des vitesses d’analyse. Une seule série d’inclinaison peut être enregistrée ici. Les mitochondries, par exemple, peuvent souvent être identifiées dans l’image Aperçu et enregistrement (Figure 12).
Pour la tomographie par lots, l’étage se déplacera autour de la grille et ne pourra pas revenir exactement au même endroit. Les cartes d’ancrage sont utilisées pour s’assurer que les zones d’enregistrement souhaitées sont réidentifiées de manière fiable en faisant correspondre l’image d’aperçu à une vue à grossissement inférieur, même si le mouvement de la scène a changé. PyEM23,24 offre une alternative plus rapide qui est certainement recommandée, mais ne fait pas encore partie de l’installation standard.
Dans l’approche CLEM, une carte de fluorescence peut être utilisée pour identifier les zones d’intérêt pour la tomographie. La fluorescence est acquise à l’extérieur et doit être enregistrée sur le montage de la grille complète. Il est utile d’avoir les barres de grille et les trous visibles, de sorte qu’un composite fluorescence + champ clair fusionné peut être préparé avant l’importation, par exemple dans le logiciel GIMP (https://www.gimp.org) ou ImageJ31 (veillez à ce qu’ImageJ inverse l’axe vertical). Lorsque la plage dynamique de la fluorescence est grande, il peut être difficile de créer une telle fusion sans saturation. Dans ce cas, les deux cartes peuvent être importées séparément, puis enregistrées ensemble comme décrit (Figure 13). De cette façon, un point sur la carte de fluorescence dans la fenêtre du navigateur, suivi de « Go To XY », amène la scène à la position correspondante sur la grille telle que montée dans le TEM. Veillez à ce que de petites incohérences dans la création du montage (ou de la carte de fluorescence, s’il s’agit également d’un montage) entraînent de petits déplacements; Par conséquent, pour une précision optimale, la fluorescence doit être réenregistrée spécifiquement sur la carte carrée. Il suffit souvent de faire cet enregistrement à l’œil, sur la base de trous dans le film de support ou de caractéristiques partagées avec l’image de lumière en champ lumineux.
La reconstruction de la série d’inclinaison donne un volume 3D (Figure 14). Cet exemple a une taille de pixel de 2,042 nm, ce qui donne un champ de vision de ~4 μm. Les dépôts de phosphate de calcium (pointes de flèches orange) se distinguent par leur numéro atomique plus élevé par rapport à l’environnement. Les microtubules (pointes de flèches rouges) peuvent être tracés dans tout le champ de vision. En outre, les membranes mitochondriales internes et externes (pointes de flèches vertes) peuvent être clairement vues. L’actine peut être observée sous forme de faisceaux ou de filaments individuels. Pour obtenir une résolution plus isotrope, la reconstruction peut être traitée par déconvolution.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig01.jpg"> Figure 1 : Comparaison entre la GDT et les STIM. En TEM, le champ de vision est éclairé par un faisceau quasi parallèle et l’objectif forme une image agrandie sur la caméra. Pour la cryo-TEM, l’ouverture de l’objectif est ouverte pour laisser passer les ondes électroniques diffusées (ligne rouge pointillée) qui, avec la défocalisation, produisent un contraste de phase par interférence avec les ondes non diffusées (vertes). STEM, d’autre part, rasters un faisceau focalisé à travers l’échantillon et recueille les électrons diffusés de manière pixel par pixel. Plusieurs détecteurs peuvent recueillir des électrons dispersés sous différents angles. Ce chiffre a été modifié par rapport à30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig02.jpg"> Figure 2 : Exemple de distorsion de l’image sur le côté gauche en raison de la fréquence de numérisation élevée. Notez la distorsion marquée par les pointes de flèches jaunes, ainsi que les trous ovales déformés dans le Quantifoil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig03.jpg"> Figure 3 : Boîte de dialogue de configuration du montage pour l’ensemble du montage de la grille. Choisissez le grossissement et le nombre de pièces dans X et Y afin que la surface totale atteigne environ 2 000 μm pour obtenir une carte pour la majeure partie de la grille. Choisissez également Déplacer l’étape au lieu de déplacer l’image et Utiliser le mappage de montage, pas les paramètres d’enregistrement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig04.jpg"> Figure 4 : GridMap à faible grossissement complet enregistré en mode STEM. Les zones brisées apparaissent complètement noires dans l’image en champ sombre. Les zones gris foncé sont probablement trop épaisses et mal vitrifiées. Les bonnes zones candidates pour la tomographie sont le blanc ou le gris clair dans ce scan. Barre d’échelle = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig05.jpg"> Figure 5 : Passage au processus de marqueur. Un objet reconnaissable est marqué dans la carte basse résolution par Ajouter des points (38 dans cette image). Notez le décalage entre la carte basse résolution (cercle vert) et la carte de résolution moyenne (cercle orange). Ensuite, l’objet est marqué par le marqueur (croix verte, cercle rouge) et la boîte de dialogue Shift to Marker est lancée. L’option choisie déplace toutes les cartes à 245x de la même quantité. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig06.jpg"> Figure 6 : Boîte de dialogue de configuration de la série d’inclinaison pour une série d’inclinaison STEM. Le schéma dose-symétrique est utilisé de -60° à +60° par pas de 2°. L’autofocus est ignoré en raison de la profondeur de champ élevée lors de l’utilisation d’un faible angle de convergence. Pas besoin d’affiner l’eucentrisme comme cela a déjà été fait. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig07.jpg"> Figure 7 : Boîte de dialogue des propriétés de fichier pour les cartes de résolution moyenne. Enregistrez en tant que fichier de pile MRC, choisissez des entiers et enregistrez des informations supplémentaires dans un fichier de métadonnées .mdoc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig08.jpg"> Figure 8 : boîte de dialogue de configuration du montage pour enregistrer des cartes de résolution moyenne. Pour un carré sur une grille de 200 mailles, d’une largeur de 90 μm, une surface totale d’au moins 90 μm x 90 μm est conseillée. Choisissez Déplacer l’étape au lieu de déplacer l’image et Utiliser les paramètres d’affichage en mode Faible dose. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig08large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig09.jpg"> Figure 9 : Carte d’enregistrement de résolution moyenne. Acquérir dans la boîte de dialogue Items pour enregistrer des cartes de résolution moyenne. Choisissez Mapping, Acquérir et enregistrer une image ou un montage, puis cochez Créer une carte Navigator. Dans les Tâches avant ou après la Primaire, choisissez Eucentricité rugueuse et fine. En cas d’absence d’assistance, choisissez éventuellement la case Aucun message en cas d’erreur et Fermer les vannes de colonne à la fin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig09large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig10.jpg"> Figure 10 : Image de la carte de résolution moyenne. Carte moyenne résolution (Square Map) enregistrée en mode STEM par un montage de 3 x 3. Les deux cartes d’ancrage de résolution moyenne pour la collecte de données sont indiquées par les carrés bleus. Barre d’échelle = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig10large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig11.jpg"> Figure 11 : Données de série d’inclinaison par lots. Acquérir dans la boîte de dialogue Items pour collecter des séries d’inclinaison par lots. Pour la collecte de données de série d’inclinaison, choisissez Données finales et Acquérir la série d’inclinaison. Dans Tâches avant ou après l’analyse principale, cochez Gérer Dewars/Vacuum (choisissez les paramètres appropriés dans le menu Configuration), Réaligner sur l’élément, Eucentricité fine et Exécuter le script avant l’action. Dans les options Général, cochez la case Aucun message en cas d’erreur et Fermez les vannes de colonne à la fin (voir 5.14). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig11large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig12.jpg"> Figure 12 : inclinaison de 0° d’une série d’inclinaison STEM d’une mitochondrie. Les pointes de flèches orange pointent vers des dépôts de phosphate de calcium (granules de matrice), les pointes de flèches vertes vers les cristae et les pointes de flèches rouges vers des marqueurs fiduciaux d’or de 15 nm. Barre d’échelle = 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig12large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig13.jpg"> Figure 13 : Cartes cryo-CLEM enregistrées. (A) Carte STEM moyenne résolution (carte carrée, 26-A) est enregistrée sur la carte STEM basse résolution, (C) la carte cryo-FM du canal BF et (D) la carte cryo-FM du canal GFP. Les neuf points d’enregistrement (étiquettes 4 à 21) sont indiqués dans le navigateur (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig13large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig14.jpg"> Figure 14 : Rendu du volume. Rendu volumique de sections (A) 60 nm et A (B) 40 nm d’épaisseur à travers un tomogramme filtré de type SIRT (30 cycles) à différentes profondeurs. La taille des pixels est de 2,048 nm, ce qui donne un champ de vision d’environ 4 μm. Veuillez noter la densité inversée par rapport à la figure 12, ce qui signifie que les caractéristiques de haute intensité sont lumineuses. Les pointes de flèches orange, blanche, rouge, verte et bleu clair indiquent des dépôts de phosphate de calcium, des ribosomes, des microtubules, la membrane mitochondriale interne et externe et des filaments d’actine, respectivement. Barre d’échelle = 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig14large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

La tomographie cryo-STEM permet de visualiser les organites de cellules intactes sans enrobage, sectionnement ou autres préparations invasives. La résolution 3D obtenue est actuellement de l’ordre de quelques nanomètres, avec un champ de vision de plusieurs micromètres et une épaisseur accessible de l’ordre de 1 μm.

Visualisation d’organites in situ par tomographie cryo-STEM

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) relies on the imaging of biological or organic specimens embedded in their native aqueous medium; water is ...

La tomographie TEM est largement utilisée pour l’imagerie des cellules, mais elle est très limitée en termes d’épaisseur de l’échantillon. Le MEB FIB et la tomographie à rayons X mous peuvent être utilisés pour des échantillons plus importants, mais à une résolution inférieure. La tomographie STEM comble parfaitement cette lacune.La tomographie STEM permet d’examiner des échantillons d’épaisseur de quelques microns à une résolution de quelques nanomètres. La combinaison avec la préparation cryogénique nous permet de regarder des échantillons biologiques et des coupes en 3D. Passez en revue les bases de l’optique STEM afin de comprendre la formation de l’image et assurez-vous que l’ingénieur de service a bien aligné les modes tige et Lomax et que les étapes d’étalonnage ressemblent à celles de la vidéo.Pour commencer, chargez le fichier d’alignement des colonnes et ouvrez les valeurs des colonnes. Si vous utilisez un support cryogénique à entrée latérale, ouvrez le bouclier cryogénique et démarrez en mode TEM. Le faisceau doit apparaître à l’écran.Réduisez le grossissement si le faisceau n’apparaît pas. Amenez le microscope à la mise au point eucentrique en appuyant sur le bouton du panneau de commande. Réglez la taille du spot sur une valeur pratique pour visualiser l’écran fluorescent directement ou avec la caméra intégrée.Réglez le microscope en mode STEM et vérifiez que la mise au point utilise les lentilles du condensateur plutôt que l’objectif. Sur le panneau, réglez la mise au point eucentrique et sortez du mode de diffraction pour les réglages initiaux. Assurez-vous que le faisceau n’est pas vide et réduisez le grossissement jusqu’à ce que le faisceau apparaisse à l’écran.Ajustez le décalage du faisceau vers le centre et augmentez le grossissement par pas jusqu’à 70 000, tout en maintenant le faisceau au centre. Insérez ensuite l’ouverture souhaitée du condenseur, généralement 50 micromètres pour le mode micro-sonde, et vérifiez le centrage de l’ouverture. Tout en tournant le bouton de mise au point d’avant en arrière, l’endroit doit se dilater et se contracter, mais rester en place, comme si un avion coupait un sablier vertical imaginaire.Si l’ouverture n’est pas centrée, l’éclairage se déplacera latéralement comme si le sablier était incliné. Mettez le faisceau au point, appuyez sur la liste d’intensité dans l’onglet Alignements ou revenez à la mise au point eucentrique. Réajustez la position du faisceau au centre et réglez le centre de rotation.Maintenant, tournez la roue de mise au point au minimum, ou un pas au-dessus, de sorte que le faisceau pulse doucement et assurez-vous qu’il reste immobile lorsque la mise au point se déplace de haut en bas. Sélectionnez les points pivots et réunissez les deux points avec les réglages X et Y. Ajustez les stigmateurs du condenseur pour rendre le faisceau rond.Montez et descendez dans la mise au point pour optimiser. Il ne devrait pas y avoir de tendance à s’allonger dans un sens ou dans l’autre lors du passage au foyer. Normalisez les lentilles, puis augmentez progressivement le grossissement jusqu’à environ 240 000, tout en utilisant le décalage du faisceau pour garder le point centré et répétez les réglages du centre de rotation et du point de pivot.Revenez au mode de diffraction. À ce stade, le faisceau doit apparaître comme un disque uniforme sur l’écran fluorescent. La longueur de la caméra contrôle désormais efficacement la distance optique au détecteur sous forme de cristallographie aux rayons X.Changez-le et regardez le disque se contracter et s’agrandir comme si l’emplacement de l’écran se déplaçait vers ou loin du spécimen. Ce cône représente l’éclairage en fond clair. Pour activer le mode STEM à fort grossissement, commencez avec le détecteur de tige en fond clair et ajustez l’alignement de diffraction pour centrer le faisceau en utilisant la longueur de caméra souhaitée.Activez le marquage en fond clair à l’écran, réduisez la longueur de la caméra à 330, soulevez l’écran et insérez les détecteurs. Lancez une numérisation dans le logiciel de microscope. Utilisez l’affichage de la portée pour vous aider à ajuster les paramètres de luminosité et de contraste comme décrit dans le manuscrit.Itérez l’ajustement plusieurs fois. Remettez le microscope à un grossissement relativement faible dans le registre à fort grossissement, sans passer en mode de grossissement faible. Insérez l’écran fluorescent et notez le courant de l’écran pour référence.Comme dans la MET, le courant peut être modifié avec les réglages de la lentille du pistolet et de la taille du spot avec des nombres croissants correspondant à un courant réduit. À ce stade, enregistrez un registre FEG pour faciliter le retour aux valeurs standard. Passez en mode LMTEM pour voir le spécimen.Insérez le spécimen. Amener l’échantillon à la hauteur eucentrique. Il existe plusieurs méthodes pour ce faire.Par exemple, utilisez le vacillement de scène pour incliner la grille tout en déplaçant la hauteur de l’échantillon le long de l’axe Z jusqu’à ce que l’image cesse de se déplacer latéralement. Vous pouvez également marquer certaines caractéristiques sur l’écran de visualisation et incliner la scène de 10 à 30 degrés. La fonctionnalité se déplacera latéralement.Ajustez la hauteur de l’échantillon pour le ramener à sa position initiale. Augmentez le grossissement ou l’inclinaison de la scène pour affiner et ramener l’inclinaison à zéro degré. Revenez maintenant en mode STEM et insérez le détecteur STEM.Assurez-vous que l’option Activer l’analyse LM n’est pas cochée. Passez au mode d’agrandissement élevé le plus bas. Réglez l’astigmatisme du condensateur par la méthode.Avec le faisceau sur une zone d’échantillon mince, concentrez-vous sur le point où le faisceau transmis explose entre les images d’ombre de l’échantillon de chaque côté. Ajustez ensuite le réglage du condensateur pour arrondir le disque central. Cela nécessite une certaine pratique, en particulier pour les échantillons cryogéniques.Revenez à l’ouverture de 50 micromètres et mettez à jour le registre FEG. Passez en mode LMSTEM et continuez à numériser pour trouver une zone intéressante. Si nécessaire, réajustez les paramètres de luminosité et de contraste du détecteur à peu près à ce stade.Appuyez sur la mise au point eucentrique, augmentez le grossissement et affinez la mise au point tout en scannant à l’aide de la boucle de mise au point fournie par le microscope et vérifiez l’astigmatisme sur les perles d’or. Jusqu’à présent, tout est effectué en mode nano sonde. Notez que l’insertion d’une ouverture de condenseur plus petite diminue l’angle de semi-convergence, ce qui est utile pour les échantillons épais.Une autre approche avec les instruments TFS consiste à passer en mode micro-sonde, ce qui conduit à un angle de semi-convergence réduit. Ensuite, réglez la longueur de la caméra afin que l’angle de collecte soit trois fois plus grand que l’angle de convergence; c’est-à-dire que les marquages de zone du détecteur BF sur l’écran sont environ trois fois plus grands que le faisceau.Estimer la dose pour l’enregistrement à l’aide d’une équation. En règle générale, visez de 100 à 150 électrons par encerre carré pour l’ensemble du tomographe. Remettez la scène dans un tout et ajustez le courant du faisceau à l’aide de la taille du spot et/ou des réglages de l’objectif du pistolet pour atteindre le courant d’écran souhaité.La carte complète de la grille à faible grossissement enregistrée en mode STEM montre les zones avec des cellules d’intérêt. Les cellules apparaissent partiellement brillantes avec des électrons dispersés vers le détecteur HAADF. La carte de résolution moyenne enregistrée en mode STEM affichait deux cartes d’ancrage de résolution moyenne.L’inclinaison de zéro degré d’une série d’inclinaison de tige a permis de visualiser les dépôts de phosphate de calcium, les marqueurs cristae et fiducial d’or d’une mitochondrie. Le rendu volumique de 60 nanomètres et des sections de 40 nanomètres d’épaisseur sont affichés. La cryotomographie tige, ou CSTET, fournit un pont entre la biologie structurale et la biologie cellulaire, ainsi qu’un contexte pour la fluorescence à super résolution.Sans avoir besoin de sectionnement ou de préparation de lamelles, nous pouvons voir tout le théâtre cellulaire dans un état presque natif.

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