Visualisation d’organites in situ par tomographie cryo-STEM

La tomographie TEM est largement utilisée pour l’imagerie des cellules, mais elle est très limitée en termes d’épaisseur de l’échantillon. Le MEB FIB et la tomographie à rayons X mous peuvent être utilisés pour des échantillons plus importants, mais à une résolution inférieure. La tomographie STEM comble parfaitement cette lacune.

La tomographie STEM permet d’examiner des échantillons d’épaisseur de quelques microns à une résolution de quelques nanomètres. La combinaison avec la préparation cryogénique nous permet de regarder des échantillons biologiques et des coupes en 3D. Passez en revue les bases de l’optique STEM afin de comprendre la formation de l’image et assurez-vous que l’ingénieur de service a bien aligné les modes tige et Lomax et que les étapes d’étalonnage ressemblent à celles de la vidéo.

Pour commencer, chargez le fichier d’alignement des colonnes et ouvrez les valeurs des colonnes. Si vous utilisez un support cryogénique à entrée latérale, ouvrez le bouclier cryogénique et démarrez en mode TEM. Le faisceau doit apparaître à l’écran.

Réduisez le grossissement si le faisceau n’apparaît pas. Amenez le microscope à la mise au point eucentrique en appuyant sur le bouton du panneau de commande. Réglez la taille du spot sur une valeur pratique pour visualiser l’écran fluorescent directement ou avec la caméra intégrée.

Réglez le microscope en mode STEM et vérifiez que la mise au point utilise les lentilles du condensateur plutôt que l’objectif. Sur le panneau, réglez la mise au point eucentrique et sortez du mode de diffraction pour les réglages initiaux. Assurez-vous que le faisceau n’est pas vide et réduisez le grossissement jusqu’à ce que le faisceau apparaisse à l’écran.

Ajustez le décalage du faisceau vers le centre et augmentez le grossissement par pas jusqu’à 70 000, tout en maintenant le faisceau au centre. Insérez ensuite l’ouverture souhaitée du condenseur, généralement 50 micromètres pour le mode micro-sonde, et vérifiez le centrage de l’ouverture. Tout en tournant le bouton de mise au point d’avant en arrière, l’endroit doit se dilater et se contracter, mais rester en place, comme si un avion coupait un sablier vertical imaginaire.

Si l’ouverture n’est pas centrée, l’éclairage se déplacera latéralement comme si le sablier était incliné. Mettez le faisceau au point, appuyez sur la liste d’intensité dans l’onglet Alignements ou revenez à la mise au point eucentrique. Réajustez la position du faisceau au centre et réglez le centre de rotation.

Maintenant, tournez la roue de mise au point au minimum, ou un pas au-dessus, de sorte que le faisceau pulse doucement et assurez-vous qu’il reste immobile lorsque la mise au point se déplace de haut en bas. Sélectionnez les points pivots et réunissez les deux points avec les réglages X et Y. Ajustez les stigmateurs du condenseur pour rendre le faisceau rond.

Montez et descendez dans la mise au point pour optimiser. Il ne devrait pas y avoir de tendance à s’allonger dans un sens ou dans l’autre lors du passage au foyer. Normalisez les lentilles, puis augmentez progressivement le grossissement jusqu’à environ 240 000, tout en utilisant le décalage du faisceau pour garder le point centré et répétez les réglages du centre de rotation et du point de pivot.

Revenez au mode de diffraction. À ce stade, le faisceau doit apparaître comme un disque uniforme sur l’écran fluorescent. La longueur de la caméra contrôle désormais efficacement la distance optique au détecteur sous forme de cristallographie aux rayons X.

Changez-le et regardez le disque se contracter et s’agrandir comme si l’emplacement de l’écran se déplaçait vers ou loin du spécimen. Ce cône représente l’éclairage en fond clair. Pour activer le mode STEM à fort grossissement, commencez avec le détecteur de tige en fond clair et ajustez l’alignement de diffraction pour centrer le faisceau en utilisant la longueur de caméra souhaitée.

Activez le marquage en fond clair à l’écran, réduisez la longueur de la caméra à 330, soulevez l’écran et insérez les détecteurs. Lancez une numérisation dans le logiciel de microscope. Utilisez l’affichage de la portée pour vous aider à ajuster les paramètres de luminosité et de contraste comme décrit dans le manuscrit.

Itérez l’ajustement plusieurs fois. Remettez le microscope à un grossissement relativement faible dans le registre à fort grossissement, sans passer en mode de grossissement faible. Insérez l’écran fluorescent et notez le courant de l’écran pour référence.

Comme dans la MET, le courant peut être modifié avec les réglages de la lentille du pistolet et de la taille du spot avec des nombres croissants correspondant à un courant réduit. À ce stade, enregistrez un registre FEG pour faciliter le retour aux valeurs standard. Passez en mode LMTEM pour voir le spécimen.

Insérez le spécimen. Amener l’échantillon à la hauteur eucentrique. Il existe plusieurs méthodes pour ce faire.

Par exemple, utilisez le vacillement de scène pour incliner la grille tout en déplaçant la hauteur de l’échantillon le long de l’axe Z jusqu’à ce que l’image cesse de se déplacer latéralement. Vous pouvez également marquer certaines caractéristiques sur l’écran de visualisation et incliner la scène de 10 à 30 degrés. La fonctionnalité se déplacera latéralement.

Ajustez la hauteur de l’échantillon pour le ramener à sa position initiale. Augmentez le grossissement ou l’inclinaison de la scène pour affiner et ramener l’inclinaison à zéro degré. Revenez maintenant en mode STEM et insérez le détecteur STEM.

Assurez-vous que l’option Activer l’analyse LM n’est pas cochée. Passez au mode d’agrandissement élevé le plus bas. Réglez l’astigmatisme du condensateur par la méthode.

Avec le faisceau sur une zone d’échantillon mince, concentrez-vous sur le point où le faisceau transmis explose entre les images d’ombre de l’échantillon de chaque côté. Ajustez ensuite le réglage du condensateur pour arrondir le disque central. Cela nécessite une certaine pratique, en particulier pour les échantillons cryogéniques.

Revenez à l’ouverture de 50 micromètres et mettez à jour le registre FEG. Passez en mode LMSTEM et continuez à numériser pour trouver une zone intéressante. Si nécessaire, réajustez les paramètres de luminosité et de contraste du détecteur à peu près à ce stade.

Appuyez sur la mise au point eucentrique, augmentez le grossissement et affinez la mise au point tout en scannant à l’aide de la boucle de mise au point fournie par le microscope et vérifiez l’astigmatisme sur les perles d’or. Jusqu’à présent, tout est effectué en mode nano sonde. Notez que l’insertion d’une ouverture de condenseur plus petite diminue l’angle de semi-convergence, ce qui est utile pour les échantillons épais.

Une autre approche avec les instruments TFS consiste à passer en mode micro-sonde, ce qui conduit à un angle de semi-convergence réduit. Ensuite, réglez la longueur de la caméra afin que l’angle de collecte soit trois fois plus grand que l’angle de convergence; c’est-à-dire que les marquages de zone du détecteur BF sur l’écran sont environ trois fois plus grands que le faisceau.

Estimer la dose pour l’enregistrement à l’aide d’une équation. En règle générale, visez de 100 à 150 électrons par encerre carré pour l’ensemble du tomographe. Remettez la scène dans un tout et ajustez le courant du faisceau à l’aide de la taille du spot et/ou des réglages de l’objectif du pistolet pour atteindre le courant d’écran souhaité.

La carte complète de la grille à faible grossissement enregistrée en mode STEM montre les zones avec des cellules d’intérêt. Les cellules apparaissent partiellement brillantes avec des électrons dispersés vers le détecteur HAADF. La carte de résolution moyenne enregistrée en mode STEM affichait deux cartes d’ancrage de résolution moyenne.

L’inclinaison de zéro degré d’une série d’inclinaison de tige a permis de visualiser les dépôts de phosphate de calcium, les marqueurs cristae et fiducial d’or d’une mitochondrie. Le rendu volumique de 60 nanomètres et des sections de 40 nanomètres d’épaisseur sont affichés. La cryotomographie tige, ou CSTET, fournit un pont entre la biologie structurale et la biologie cellulaire, ainsi qu’un contexte pour la fluorescence à super résolution.

Sans avoir besoin de sectionnement ou de préparation de lamelles, nous pouvons voir tout le théâtre cellulaire dans un état presque natif.