Quantification et caractérisation du génome entier de l’ARN du SRAS-CoV-2 dans les eaux usées et les échantillons d’air

L’épidémiologie basée sur les eaux usées est actuellement utilisée pour compléter les stratégies de lutte contre la COVID-19 dans le monde entier en détectant l’ARN viral dans les échantillons d’eaux usées et en identifiant les épidémies potentielles. Cette technique fournit un aperçu de la prévalence de la COVID-19 dans notre communauté à l’échelle de la population, y compris les cas asymptomatiques. L’échantillonnage de l’air est également un ajout important à ce protocole.

Le diagnostic clinique reste le moyen le plus précis de gérer les épidémies et les pandémies. Cependant, cette technique est toujours utile en complément de celle-ci. Cette méthode comporte de nombreuses étapes et points critiques.

Une démonstration visuelle est indispensable, car elle permettra aux laboratoires moins familiers avec la biologie moléculaire de reproduire la procédure. Pour commencer, prélevez un litre d’un échantillon d’eaux usées composites de 24 heures. Injectez 20 microlitres de mengovirus dans 70 millilitres de l’échantillon.

Après avoir centrifugé l’échantillon à 700G pendant 10 minutes, concentrer le surnageant obtenu à l’aide d’un dispositif d’ultrafiltration centrifuge avec une coupure de 10 kilodaltons par centrifugation. Éluer le concentré en centrifugeant à 700G pendant 40 minutes, et en inversant la position du dispositif d’ultrafiltration. Utilisez le concentré obtenu pour l’extraction de l’ARN.

Pour prélever les échantillons d’air, placez un cône stérile dans l’échantillonneur d’air avant de commencer le prélèvement. Une fois l’échantillonnage terminé, extrayez l’ARN du PBS lavé du cône à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN viral commercial ou d’une méthode interne. Préparez le mélange principal de réactions pour chaque cible, le mengovirus, les gènes SARS-CoV-2, N1 et N2 dans une hotte propre dans la salle d’installation des réactifs.

Mélangez le mélange amorces-sonde et l’enzyme en inversant cinq fois ou en effectuant un vortex d’impulsion. En gardant les tubes de microcentrifugation dans une grille froide, distribuez 15 microlitres du mélange dans des tubes PCR en bandelette ou une plaque PCR à 96 puits placée sur une grille de refroidissement. Couvrez la plaque et déplacez-la vers la zone de manipulation des acides nucléiques.

Enroulez doucement une aliquote de l’ARN extrait pendant cinq secondes. Pipetez cinq microlitres d’ARN dans le mélange réactionnel pour obtenir 25 microlitres et démarrez la RT-qPCR. Dans une plaque PCR, pipetez 16 microlitres de chaque échantillon jusqu’à sa position sur la plaque et ajoutez quatre microlitres de quintuple transcription inverse ou de mélange maître RT.

Lancez ensuite la réaction PCR. Ensuite, préparez 10 dilutions micromolaires de chaque jeu d’apprêts et le mélange principal pour chaque ensemble d’amorces. Dans une nouvelle plaque PCR, pipeter 20 microlitres du mélange maître, puis cinq microlitres de l’échantillon RT à chaque mélange.

Après avoir recouvert la plaque, démarrez la réaction PCR. Une fois la PCR terminée, faites tourner la plaque à 1000 G pendant 15 à 30 secondes. Pour la purification par PCR, ajoutez 50 microlitres de réactif à base de billes dans chaque puits et mélangez par pipetage pour procéder à la séparation magnétique.

Retirez la plaque du support magnétique. Remettre chaque pastille en suspension avec 15 microlitres d’eau de qualité PCR et incuber la plaque à température ambiante pendant deux minutes. Replacez la plaque sur le support magnétique et laissez les perles s’agglutiner pendant deux minutes.

Ensuite, pipetez soigneusement 15 microlitres de surnageant de chaque échantillon dans une nouvelle plaque PCR. Ensuite, pour la préparation de la bibliothèque, ajoutez 1,75 microlitre de tampon de réaction du kit de préparation de la banque d’ADN et 0,75 microlitre de mélange enzymatique à chaque échantillon. Faites tourner brièvement la plaque recouverte et faites-la tourner à 1000G pendant 15 à 30 secondes.

Incuber pendant cinq minutes à 21 degrés Celsius et cinq minutes à 65 degrés Celsius. Pipeter trois microlitres d’eau de qualité PCR pour chaque échantillon dans une nouvelle plaque PCR. Ajoutez 0,75 microlitre des échantillons préparés et 1,25 microlitre de codes-barres pour la préparation de la bibliothèque de séquençage.

Ajoutez ensuite cinq microlitres de mélange maître de T4 DNA ligase et mélangez bien par pipetage. Après avoir fait tourner la plaque dans la centrifugeuse, incubez la plaque à 21 degrés Celsius pendant 20 minutes et à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après avoir regroupé tous les échantillons, ajoutez 192 microlitres de réactif à base de billes dans le pool pour la purification par PCR.

Bien mélanger par pipetage et incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Placez le tube sur un support magnétique. Attendez que le surnageant se dissipe et qu’une pastille de billes se forme.

Retirez le surnageant et le tube du support magnétique. Ajouter 700 microlitres de tampon à fragments courts ou SFB et mélanger par pipetage. Replacez le tube sur le support magnétique et attendez que la pastille se forme et que le liquide se dégage.

Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. Ajoutez 35 microlitres d’eau de qualité PCR dans le tube, mélangez par pipetage et incubez à température ambiante pendant deux minutes. Placez le tube sur le support magnétique et laissez les billes s’agglutiner et le liquide s’écouler.

Pipeter 35 microlitres de surnageant dans un nouveau tube. Ensuite, préparez le mélange réactionnel de ligature de l’adaptateur comme décrit dans le manuscrit du texte et incubez à température ambiante pendant 10 minutes. Mélangez 20 microlitres de réactif à base de billes au mélange réactionnel de ligature pour la purification par PCR et incubez pendant 10 minutes à température ambiante.

Placez le tube sur le support magnétique et attendez que la pastille de bille se forme et que le surnageant devienne incolore. Éliminez soigneusement le surnageant par pipetage. Mélangez 125 microlitres de SFB dans le tube et replacez-le sur le support magnétique pour séparer les billes.

Lorsque le liquide devient clair, jetez le surnageant et répétez l’ajout de SFB comme indiqué précédemment. Laissez le tube sur le support magnétique ouvert pendant 30 secondes. Ajouter 15 microlitres de tampon d’élution et bien mélanger par pipetage.

Après un bref essorage et une incubation à température ambiante pendant cinq minutes, placez-le sur le support magnétique pendant deux minutes. Pipeter 15 microlitres de surnageant dans un nouveau tube à faible liaison pour mesurer la concentration à l’aide d’un kit de quantification de l’ADN fluorométrique. Ensuite, insérez la cellule d’écoulement dans le dispositif de séquençage de l’ADN et de l’ARN en temps réel.

Insérez l’embout d’une pipette de 1 000 microlitres réglée à 200 microlitres dans l’orifice d’amorçage. Tournez la molette de réglage du volume pour augmenter le volume jusqu’à ce que vous voyiez le liquide dans l’embout, puis jetez l’embout. Ajoutez 800 microlitres de mélange d’amorçage dans l’orifice d’amorçage sans bulles et attendez cinq minutes.

Pipeter 200 microlitres de la bibliothèque mélangés dans l’orifice d’amorçage. Fermez l’orifice de capot et l’orifice d’amorçage. Lancez l’expérience de séquençage dans le logiciel et sélectionnez Base Calling On.Cette méthode a permis de détecter et de quantifier l’ARN du SRAS-CoV-2 dans les eaux usées et les échantillons d’air.

Les échantillons d’eaux usées présentaient un écart-type de 1,91 % à 13,98 % parmi les trois exemplaires, et variaient de 3,05 fois 10 à 3 à 2,83 fois 10 à huit copies de gènes par litre. Les échantillons d’air variaient de 6,17 fois 10 à trois à 5,48 fois 10 à neuf, l’écart-type dans les doublons se situant entre 0,54 % et 10,95 %Comme décrit dans ce protocole, les échantillons ont été séquencés, et un exemple de résultats de trois échantillons séquencés est résumé ici. Dans les trois échantillons, la lignée BA.5.

x a été désigné comme le plus répandu par l’outil Freyja. La concentration des échantillons d’eaux usées est une étape cruciale car l’ARN viral est présent à de faibles concentrations dans les eaux usées. Cette étape est donc fondamentale pour une détection et une quantification précises.

Cette procédure peut être adaptée en utilisant différentes amorces dans le protocole RT-qPCR pour être utilisées pour détecter et quantifier d’autres agents infectieux. La technique a quantifié avec précision le SRAS-CoV-2 dans les eaux usées et les échantillons d’air. Différents agents pathogènes peuvent être détectés et quantifiés à différents endroits.