Name: BS3 Chemical Crosslinking Assay: Évaluation de l’effet du stress chronique sur la surface cellulaire Présentation du récepteur GABAA dans le cerveau des rongeurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T12:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Découvrez l'essai de réticulation chimique BS3 pour évaluer l'expression des récepteurs GABA A en surface cellulaire dans le cerveau de souris soumises à un stress psychosocial chronique. Cette méthode révèle les bases moléculaires de l'anxiété.

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Les auteurs remercient le personnel de l’animalerie de CAMH d’avoir pris soin des animaux pendant toute la durée de l’étude. Ces travaux ont été financés par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC Project Grant #470458 à T.T.), le Fonds de découverte du CAMH (à T.P.), la National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (NARSAD award #25637 à E.S.) et le Campbell Family Mental Health Research Institute (à E.S.). E.S. est le fondateur de Damona Pharmaceuticals, une société biopharmaceutique dédiée à l’introduction de nouveaux composés GABAergiques à la clinique.

Tous les travaux sur les animaux prévus dans ce protocole ont été effectués conformément à la Loi sur les animaux destinés à la recherche de l’Ontario (L.R.O. 1990, chapitre A.22) et au Conseil canadien de protection des animaux (CCPA) et ont été approuvés par le Comité de protection des animaux de l’établissement.
1. Préparation des animaux
<ol><li>Déterminez le nombre d’animaux à utiliser dans les expériences et divisez-les en groupes ou cohortes expérimentales appropriés. Voir la section de discussion pour une discussion sur la taille du groupe, le sexe et la puissance statistique. REMARQUE : Ce protocole est personnalisé pour les souris (souche C57BL6/J; âge de 2 à 4 mois; généralement 20 à 30 g de poids corporel; nombre équivalent de mâles et de femelles à utiliser).</li>
	<li>Placer les animaux sous UCMS ou contrôler des conditions non stressées pendant 5 à 8 semaines, en suivant le protocole décrit précédemment14.</li>
	<li>Après la dernière procédure UCMS, laissez les animaux rester dans leurs cages domestiques pendant 1 jour avant de les utiliser pour le test de réticulation afin d’éviter les effets de stress aigus sur l’expression des récepteurs.</li>
</ol>2. Préparation des solutions mères
<ol><li>Préparez et conservez les solutions suivantes comme indiqué avant l’essai.<ol><li>Préparer 5 M de NaCl en dissolvant 14,6 g de NaCl dans 40 mL d’eau désionisée. Conserver à température ambiante (RT).</li>
		<li>Préparer 1,08 M de KCl en dissolvant 3,22 g de KCl dans 40 mL d’eau désionisée. Magasin chez RT.</li>
		<li>Préparer 400 mM de MgCl2en dissolvant 3,25 g de MgCl2.6H2O dans 40 mL d’eau désionisée. Magasin chez RT.</li>
		<li>Préparer 1 M de glycine en dissolvant 3 g de glycine dans 40 mL d’eau désionisée et conserver à 4 °C.</li>
		<li>Préparer 1 M dithiothréitol (DTT) en dissolvant 1,54 g de DTT dans 10 mL d’eau désionisée. Filtrez-stérilisez à travers un filtre avec une taille de pores de 0,2 μm, et aliquote dans des tubes de 2 mL. Conserver à −20 °C.</li>
		<li>Préparer 10% de Nonidet-P40 (NP-40) en le diluant dans un rapport de 1:10 (v/v) dans de l’eau désionisée. Magasin chez RT.</li>
		<li>Préparer 0,5 M d’EDTA (pH = 8,0) et conserver à TA.</li>
		<li>Préparer un tampon HEPES 1 M (pH = 7,2-7,5) et conserver à 4 °C.</li>
		<li>Préparer 2,5 M ou 45 % (p/v) de glucose et conserver à 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Préparation du poste de travail
<ol><li>Le jour de l’essai de réticulation BS3, rassembler les matériaux suivants dans la salle de dissection des animaux (figure 1), avec plusieurs éléments prérefroidis sur glace : un seau à glace, un bloc de température métallique (prérefroidi sur de la glace), du PBS glacé dans un tube conique de 50 ml et du PBS congelé dans une boîte de Pétri, du papier filtre humidifié avec du PBS et placé sur une surface plane réfrigérée ou de la glace bleue, une matrice cérébrale (intervalle de 1 mm pour l’insertion de la lame de rasoir) prérefroidie sur de la glace, des lames de rasoir (~10) prérefroidies sur de la glace, des outils de dissection (ciseaux, pinces, sonde incurvée), un poinçon en tissu, du papier d’essuyage et des essuie-tout à l’éthanol à 70 %, des embouts de pipette (200 μL), une pipette (P200), un chronomètre, un bloc-notes, un stylo et des tubes de microcentrifugation (1,5 mL).<ol><li>Avant l’essai, étiquetez les tubes de microcentrifugation avec les renseignements sur l’échantillon (p. ex., numéro d’identification de l’animal, type de traitement [SMCU versus absence de stress (NS)], région du cerveau, avec ou sans BS3, etc.). REMARQUE : Pour les essais de réticulation BS3, deux échantillons de chaque région du cerveau doivent être prélevés; un échantillon sera utilisé pour la réticulation (avec BS3) et l’autre pour la réaction de non-réticulation (sans BS3) comme témoin. Par conséquent, afin d’échantillonner deux régions du cerveau (c.-à-d. le cortex préfrontal [PFC] et l’hippocampe [HPC]) chez 12 souris, étiqueter 48 tubes pour l’échantillonnage initial (= 2 échantillons × 2 régions × 12 souris) (à utiliser dans la section 6). Étiqueter deux autres ensembles de 48 tubes pour un stockage ultérieur (pour stocker deux volumes différents [100 μL, 300 μL] de chaque échantillon) (à utiliser à la section 7). Ainsi, il est nécessaire d’étiqueter 144 tubes au total pour cette taille de cohorte.</li>
	</ol></li>
	<li>De plus, assurez-vous que l’équipement suivant est disponible dans le laboratoire : une microcentrifugeuse réfrigérée de table, un sonicateur, un rotateur tubulaire (à utiliser dans la chambre froide ou à l’intérieur du réfrigérateur [4 °C]), un congélateur (−80 °C) pour stocker les échantillons et un seau de glace sèche pour le stockage temporaire des échantillons (à utiliser dans la section 7)</li>
</ol>4. Préparation des solutions de travail et des tampons
NOTE: Le matin de l’essai, préparer les solutions suivantes. Ce calcul est basé sur les solutions nécessaires pour traiter deux régions du cerveau (c.-à-d. le PFC et le HPC) de 12 souris.
<ol><li>Préparer le liquide céphalorachidien artificiel (aLCR, pH = 7,4) comme mentionné dans le tableau 1. Distribuer 750 μL d’aLCR dans chaque tube de prélèvement (les 48 tubes étiquetés à l’étape 3.1.1) et les placer dans le bloc de température métallique sur de la glace pour prérefroidir le tampon.</li>
	<li>Préparez le tampon de lyse comme mentionné dans le tableau 2. Conserver sur de la glace (400 μL à utiliser par échantillon).</li>
	<li>Préparer une solution mère BS3 de 52 mM (26x) dans un tampon de citrate de sodium de 5 mM (pH = 5,0).<ol><li>Tout d’abord, préparez 100 mM d’acide citrique (stock A) et 100 mM de citrate de sodium (stock B).</li>
		<li>Diluer le stock A et le stock B dans un rapport de 1:20 avec de l’eau désionisée. Ajouter 100 μL chacun à 1,9 mL d’eau pour préparer 5 mM d’acide citrique (stock C) et 5 mM de citrate de sodium (stock D), respectivement.</li>
		<li>Mélanger 410 μL de C brut et 590 μL de bloc D pour préparer un tampon de citrate de sodium de 5 mM (pH = 5,0) (solution E, 1 mL).</li>
		<li>Confirmer le pH de la solution E à l’aide d’une bandelette indicateur de pH.</li>
		<li>Dissoudre 24 mg de BS3 dans 806,4 μL de solution E en tourbillonnant pendant 30 s pour préparer la solution mère de BS3 (26x).</li>
		<li>Préparer encore 1 mL de solution E à utiliser comme témoin du véhicule pour les échantillons non réticulants. REMARQUE: Préparez la solution mère BS3 lorsque tout le reste est prêt et que l’expérience est sur le point de commencer. Le BS3 doit être conservé desséché à 4 °C jusqu’à utilisation. Une fois reconstitué, BS3 ne reste actif que pendant environ ≤3 h. Comme le pH du tampon de citrate de sodium de 5 mM (solution E) augmente avec le temps, provoquant une hydrolyse accélérée de BS3, il est recommandé de préparer la solution E fraîche à partir des solutions mères A et B9. En raison de la solubilité limitée de BS3 à basse température, conserver le BS3 reconstitué à RT. Utiliser le BS3 reconstitué en 3 h, et ne pas congeler/décongeler ou réutiliser le BS3 reconstitué.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Dissection des tissus cérébraux
REMARQUE: À partir de cette étape, au moins deux personnes doivent travailler ensemble de manière coordonnée. Pendant qu’une personne se concentre sur la dissection animale (étapes 5.2-5.10 et étape 6.3), l’autre personne doit travailler comme chronométreur et aider à coordonner l’essai (étape 5.1, étape 6.1, étape 6.2, étape 6.4 et étape 6.5).
<ol><li>Amenez le premier animal à dissection de la zone de logement à la salle de dissection. REMARQUE : Comme les facteurs de stress aigus (p. ex. un nouvel environnement, l’odeur du sang) peuvent affecter la dynamique des protéines cérébrales, les animaux doivent être gardés dans leurs cages situées loin de la zone de dissection, puis amenés individuellement dans la salle de dissection pour une décapitation immédiate.</li>
	<li>Euthanasier la souris par luxation cervicale suivie d’une décapitation. Retirez rapidement le cerveau du crâne et immergez-le dans du PBS glacé dans une boîte de Pétri pendant 10 à 15 s (Figure 2). REMARQUE: Les animaux ne sont pas anesthésiés pour les expériences BS3 car tout agent anesthésique pourrait potentiellement influencer le niveau de présentation de surface des récepteurs des neurotransmetteurs9.</li>
	<li>Placez le cerveau refroidi dans la matrice cérébrale sur de la glace, avec la face ventrale du cerveau tournée vers le haut (Figure 3).</li>
	<li>Insérez la première lame de rasoir à travers la bordure entre le bulbe olfactif et le pédoncule olfactif pour couper le cerveau coronalement (Figure 4). À l’aide de trois à quatre lames de rasoir supplémentaires, coupez en série la partie antérieure du cerveau coronalement avec des intervalles de 1 mm.</li>
	<li>Soulevez les tranches coronales de la matrice cérébrale en maintenant toutes les lames de rasoir insérées ensemble, laissant la partie postérieure du cerveau dans la matrice cérébrale. Utilisez des pinces pour séparer les lames de rasoir les unes des autres et placez-les sur la surface plane et refroidie, la tranche de cerveau tournée vers le haut (Figure 5).</li>
	<li>Identifiez les tranches contenant la région d’intérêt. Pour échantillonner le PFC, choisir les deuxième et troisième tranches postérieures à la première tranche contenant le pédoncule olfactif.</li>
	<li>Retirez la région d’intérêt à l’aide d’un poinçon tissulaire (vidéo 1), mettez-la de côté sur la lame de rasoir réfrigérée et divisez uniformément le tissu en deux (p. ex., les tissus de l’hémisphère gauche par rapport à l’hémisphère droit, une moitié devant être utilisée pour la réaction de réticulation BS3 et l’autre moitié pour le contrôle sans réticulation si la protéine cible d’intérêt est exprimée également dans les deux hémisphères).</li>
	<li>Habillez chaque tissu en morceaux sur la lame de rasoir à l’aide de la pointe fine de la pince avec de multiples mouvements verticaux contre la lame (Vidéo 2) au lieu d’écraser ou de broyer les mouchoirs. Cela maximisera la surface accessible à BS3 sans compromettre gravement l’intégrité de la membrane des cellules. Immédiatement après le hachage, transférer les tissus hachés dans les tubes appropriés (voir étape 6.3).</li>
	<li>Pour prélever le HPC, retirer la partie postérieure du cerveau de la matrice et placer le cerveau sur du papier filtre humidifié sur la surface plane refroidie, la face dorsale tournée vers le haut (Figure 6).</li>
	<li>À l’aide d’une sonde incurvée et d’une pince, et en s’approchant du côté dorsal (vidéo 3), disséquez le HPC (moitié dorsale, moitié ventrale ou les deux) des deux hémisphères (une moitié pour la réticulation BS3 et l’autre moitié pour le contrôle). Hacher chaque tissu comme à l’étape 5.8 et transférer le tissu dans les tubes appropriés (voir étape 6.3). REMARQUE : Le temps de dissection total pour chaque animal doit être maintenu à ~5 min pour que les conditions expérimentales et les résultats soient cohérents.</li>
</ol>6. Réaction de réticulation
<ol><li>Amener l’animal suivant pour la dissection de la zone de logement à la salle de dissection lorsque la dissection du cerveau de la souris précédente est sur le point de se terminer (étape 5.10).</li>
	<li>Piquez le tube prérefroidi sur de la glace (à partir de l’étape 4.1) avec 30 μL de solution BS3 (26x) ou de solution E du véhicule juste avant que les tissus hachés ne soient prêts à être transférés dans les tubes appropriés. Changez les embouts de pipette entre les tubes pour vous assurer qu’aucun BS3 n’est contaminé dans les tubes de commande sans réticulation.</li>
	<li>Transférer les tissus hachés (à partir des étapes 5.8 et 5.10) dans les tubes appropriés, puis commencer à disséquer l’animal suivant (étape 5.2)</li>
	<li>Retourner et mélanger le tube pour séparer les morceaux de tissu en morceaux plus petits (vidéo 4) et commencer à incuber les échantillons sur le rotateur tubulaire en chambre froide pendant 30 minutes à 2 h. Notez l’heure de début de l’incubation BS3 pour chaque tube. Voir la section discussion pour connaître le temps d’incubation optimal.</li>
	<li>Éteindre la réaction en ajoutant 78 μL de glycine 1 M au tube et incuber l’échantillon pendant 10 min à 4 °C à rotation constante. Notez l’heure de début et de fin de la trempe pour chaque tube. Continuez d’aider la personne qui se concentre sur la dissection animale en amenant l’animal suivant (étape 6.1) et en aidant à la réticulation (étape 6.2). REMARQUE: Traiter chaque échantillon avec exactement le même moment sur tous les échantillons. Si la salle de dissection est éloignée de la chambre froide, il est fortement recommandé de recruter une troisième personne pour participer à l’incubation et à la trempe des échantillons dans la chambre froide.</li>
</ol>7. Lyse tissulaire, préparation de protéines et transfert Western
<ol><li>Après 10 min de trempe (étape 6.5), faire tourner les échantillons à 20 000 x g à 4 °C pendant 2 min et jeter le surnageant. Si une tierce personne est disponible, passez à l’étape 7.2; Sinon, congelez les échantillons sur de la glace sèche et suspendez le test ici jusqu’à ce que la dissection cérébrale (section 5) et la réticulation (section 6) de tous les animaux soient terminées.</li>
	<li>Ajouter 400 μL de tampon de lyse glacée par tube.</li>
	<li>Soniquer les échantillons pendant 1 s cinq fois avec des intervalles de 5 s entre les deux, tout en gardant les échantillons sur la glace.</li>
	<li>Faites tourner les échantillons à 20 000 x g pendant 2 minutes pour essorer les débris tissulaires insolubles (pastille) et économiser le surnageant.</li>
	<li>Utilisez 5 μL du surnageant pour mesurer la concentration de protéines à l’aide du dosage de l’acide bicinchoninique (BCA).</li>
	<li>Diviser le reste du surnageant en deux tubes; un tube contient 100 μL de surnageant pour le transfert Western subséquent, et l’autre tube contient le reste (~300 μL) pour un stockage à long terme à −80 °C. Ajouter une quantité appropriée de 4x tampon d’échantillon SDS (complété par du β2-mercaptoéthanol) aux échantillons et incuber à 70 °C pendant 10 min.</li>
	<li>Exécutez 10 à 20 μg de protéines par puits sur un gel d’acrylamide pour l’électrophorèse (SDS-PAGE), puis transférez les protéines dans la membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) pour l’analyse par transfert Western.</li>
	<li>Bloquer la membrane PVDF dans du lait écrémé à 5 % (p/v) dissous dans une solution saline tamponnée Tris contenant 0,1 % de Tween-20 (TBS-T) pendant 1 h à TA.</li>
	<li>Lavez brièvement la membrane deux fois avec TBS-T et incuber avec l’anticorps primaire dilué dans TBS-T pendant une nuit à 4 °C.</li>
	<li>Laver l’anticorps primaire trois fois pendant 10 minutes chacun dans TBS-T à RT.</li>
	<li>Incuber la membrane avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort dilué dans TBS-T pendant 1 h à TA.</li>
	<li>Laver l’anticorps secondaire trois fois pendant 10 minutes chacun dans TBS-T à RT.</li>
	<li>Incuber la membrane dans un réactif de chimiluminescence amélioré et détecter le signal à l’aide de l’appareil de documentation du gel.</li>
</ol>

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<li>Boudreau, A. C., Wolf, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+sensitization+to+cocaine+is+associated+with+increased+AMPA+receptor+surface+expression+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Behavioral sensitization to cocaine is associated with increased AMPA receptor surface expression in the nucleus accumbens.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (40), 9144-9151 (2005).</li>
<li>Conrad, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+accumbens+GluR2-lacking+AMPA+receptors+mediates+incubation+of+cocaine+craving%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving.</a> Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).</li>
<li>Tomoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF+controls+GABAAR+trafficking+and+related+cognitive+processes+via+autophagic+regulation+of+p62%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">BDNF controls GABAAR trafficking and related cognitive processes via autophagic regulation of p62.</a> Neuropsychopharmacology. 47 (2), 553-563 (2022).</li>
<li>Hernandez-Rabaza, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sildenafil+reduces+neuroinflammation+and+restores+spatial+learning+in+rats+with+hepatic+encephalopathy%3A+Underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Sildenafil reduces neuroinflammation and restores spatial learning in rats with hepatic encephalopathy: Underlying mechanisms.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 195(2015).</li>
</ol>

Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts.

Bien que l’impact du stress psychosocial chronique sur les comportements (c.-à-d. l’émotivité et les déficits cognitifs) et les changements moléculaires (c.-à-d. l’expression réduite des gènes GABAergiques et les déficits qui l’accompagnent dans la neurotransmission GABAergique) soient bien documentés10, les mécanismes sous-jacents à ces déficits doivent être étudiés plus avant. En particulier, compte tenu de l’étude récente montrant que le stress chronique affecte de manière significative le prot...

Les récepteurs des neurotransmetteurs sont localisés soit à la surface de la membrane plasmique neuronale, soit intracellulaire sur les endomembranes (p. ex. l’endosome, le réticulum endoplasmique [ER] ou l’appareil trans-Golgi) et font la navette dynamique entre ces deux compartiments en fonction des états physiologiques intrinsèques des neurones ou en réponse aux activités extrinsèques du réseau neuronal 1,2. Étant donné que les neurotransmetteurs nouvellement sécrétés suscitent leurs fonctions physiologiques principalement par le biais du pool localisé de récepteurs localisés en surface, les niveaux de récepteurs de surface pour un neurotransmetteur donné sont l’un des déterminants critiques de sa capacité de signalisation dans le circuit neuronal3.
Plusieurs méthodes sont disponibles pour surveiller les niveaux de récepteurs de surface dans les neurones en culture, y compris le test de biotinylationde surface 4, le test d’immunofluorescence avec un anticorps spécifique dans des conditions non perméabilisées5, ou l’utilisation d’un transgène récepteur génétiquement fusionné avec un indicateur optique fluorescent sensible au pH (par exemple, pHluorin)6. En revanche, ces approches sont limitées ou peu pratiques lors de l’évaluation des niveaux de récepteurs de surface in vivo. Par exemple, la procédure de biotinylation de surface peut ne pas être pratique pour traiter de grandes quantités et un grand nombre d’échantillons de tissus cérébraux in vivo en raison de son prix relativement élevé et des étapes ultérieures nécessaires pour purifier les protéines biotinylées sur des billes conjuguées à l’avidine. Pour les neurones intégrés dans une architecture cérébrale tridimensionnelle, la faible accessibilité des anticorps ou les difficultés de quantification au microscope peuvent constituer une limitation importante pour l’évaluation des niveaux de récepteurs de surface in vivo. Pour visualiser la distribution des récepteurs des neurotransmetteurs dans les cerveaux intacts, des méthodes non invasives, telles que la tomographie par émission de positrons, pourraient être utilisées pour mesurer l’occupation des récepteurs et estimer les niveaux de récepteursde surface 7. Cependant, cette approche repose essentiellement sur la disponibilité de ligands radio spécifiques, d’équipements coûteux et d’une expertise spéciale, ce qui la rend moins accessible pour une utilisation régulière par la plupart des chercheurs.
Ici, nous décrivons une méthode simple et polyvalente pour mesurer les niveaux de récepteurs de surface dans des cerveaux d’animaux expérimentaux ex vivo à l’aide d’un agent de réticulation chimique soluble dans l’eau et imperméable à la membrane, le bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3)8,9. BS3 cible les amines primaires dans la chaîne latérale des résidus de lysine et peut réticuler de manière covalente les protéines à proximité les unes des autres. Lorsque les tranches de cerveau sont fraîchement préparées à partir d’une région d’intérêt et incubées dans un tampon contenant BS3, les récepteurs de surface cellulaire sont réticulés avec des protéines voisines et, par conséquent, se transforment en espèces de poids moléculaire plus élevé, tandis que les récepteurs associés à l’endomembrane intracellulaire restent inchangés. Par conséquent, les pools de récepteurs de surface et intracellulaires peuvent être séparés par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE) et quantifiés par transfert Western à l’aide d’anticorps spécifiques au récepteur à étudier.
Le stress chronique léger imprévisible (UCMS) est un paradigme expérimental bien établi pour induire un stress psychosocial chronique chez les rongeurs10. UCMS provoque des phénotypes comportementaux anxieux / dépressifs et des déficits cognitifs via la modulation d’un éventail de systèmes de neurotransmetteurs, y compris le GABA et ses récepteurs10,11. En particulier, le récepteur GABA A contenant la sous-unité α5 (α5-GABAAR) est impliqué dans la régulation de la mémoire et des fonctions cognitives12,13, suggérant l’implication possible de fonctions altérées de cette sous-unité dans les déficits cognitifs induits par UCMS. Dans ce protocole, nous avons utilisé le test de réticulation BS3 pour quantifier les niveaux d’α5-GABAAR exprimé en surface dans le cortex préfrontal des souris exposées à l’UCMS par rapport aux souris témoins non stressées.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS</td><td>Bio-Rad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>2,5 M (45 %, p/v) Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>4x Tampon d’échantillon SDS (Laemmli)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3)</td><td>Pierce</td><td>A39266</td><td>Sans pesée Format ; 10 x 2 mg</td></tr><tr><td>Matrice cérébrale</td><td>Ted Pella</td><td>15003</td><td>Pour souris, 30 g adulte, coronal, 1 mm</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium (CaCl2)</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Sonde courbe</td><td>Outils de sciences fines</td><td>10088-15</td><td>Sonde d’anatomie brute ; coudée 45</td></tr><tr><td>Eau désionisée</td><td>milli-Q</td><td>EQ 7000</td><td>Eau ultrapure [résistivité 18,2 M&Omega ; &point moyen ; cm @ 25 &deg ; C; carbone organique total (COT) & ; le ; 5 ppb]&nbsp ;</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre (3MM)</td><td>Whatman</td><td>3030-917</td><td></td></tr><tr><td>Forceps (grande)Fine</td> <td>Science Tools</td><td>11152-10</td><td>Extra Fine Graefe Forceps</td></tr><tr><td>Forceps (petite)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Forceps GABA-A R alpha 5 anticorps</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-31163</td><td>IgG polyclonales de lapin ; détecter un signal erroné lors de la réticulation chimique</td></tr><tr><td>de l’anticorps GABA-A R alpha 5 C-terminus</td><td>R& D Systems</td><td>PPS027</td><td>Polyclonal Rabbit IgG ; réagit de manière croisée avec la souris et le rat</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>W328707</td><td></td></tr><tr><td>Raifort conjuguée à la peroxydase de chèvre IgG anti-lapin (H+L)</td><td>Bio-Rad</td><td>1721019</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium (MgCl2&middot ; 6H2O)</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet-P40, substitut (NP-40)</td><td>SantaCruz</td><td>68412-54-4</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail inhibiteur de protéase</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Membrane PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux (grands)</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>14007-14</td><td>Ciseaux chirurgicaux - Ciseaux dentelés</td></tr><tr><td>(petits)</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>14060-09</td><td>Ciseaux fins - Chlorure</td></tr><tr>de<td>sodium tranchant (NaCl)</td><td>Sonicateur Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>(Qsonica Sonicator Q55)&nbsp ;</td><td>Qsonica</td><td>15338284</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée de table</td><td>Eppendorf</td><td>5425R</td><td></td></tr><tr><td>Poinçon à tissus (ID 1 mm)</td><td>Ted Pella</td><td>15110-10</td><td>Miltex Biopsie Punch avec piston, ID 1,0 mm, OD 1,27 mm</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo 5x Tampon de transfert</td><td>Bio-Rad</td><td>10026938</td><td></td></tr><tr><td>Rotateur de tubes (LabRoller)</td><td>Labnet</td><td>H5000</td><td></td></tr></tbody></table>

bs3 chemical crosslinking assay: Évaluation de l’effet du stress chronique sur la surface cellulaire présentation du récepteur gabaa dans le cerveau des rongeurs

BS3 Chemical Crosslinking Assay: Evaluating the Effect of Chronic Stress on Cell Surface GABAA Receptor Presentation in the Rodent Brain

L’anxiété est un état d’émotion qui affecte de manière variable les comportements des animaux, y compris les fonctions cognitives. Des signes comportementaux d’anxiété sont observés dans tout le règne animal et peuvent être reconnus comme des réponses adaptatives ou inadaptées à un large éventail de modalités de stress. Les rongeurs fournissent un modèle expérimental éprouvé pour les études translationnelles portant sur les mécanismes intégratifs de l’anxiété aux niveaux moléculaire, cellulaire et des circuits. En particulier, le paradigme du stress psychosocial chronique suscite des réponses inadaptées imitant des phénotypes comportementaux de type anxiété / dépression qui sont analogues entre les humains et les rongeurs. Alors que des études antérieures montrent des effets significatifs du stress chronique sur le contenu des neurotransmetteurs dans le cerveau, l’effet du stress sur les niveaux de récepteurs des neurotransmetteurs est sous-étudié. Dans cet article, nous présentons une méthode expérimentale pour quantifier les niveaux de surface neuronale des récepteurs des neurotransmetteurs chez les souris soumises à un stress chronique, en nous concentrant particulièrement sur les récepteurs de l’acide gamma-aminobutyrique (GABA), qui sont impliqués dans la régulation des émotions et de la cognition. En utilisant le réticulant chimique irréversible imperméable à la membrane, le sous-érate de bissulfosuccinimidyle (BS3), nous montrons que le stress chronique régule significativement à la baisse la disponibilité de surface des récepteurs GABAA dans le cortex préfrontal. Les niveaux de surface neuronale des récepteurs GABAA sont le processus limitant le taux de neurotransmission GABA et pourraient donc être utilisés comme marqueur moléculaire ou proxy du degré de phénotypes anxieux / dépressifs dans des modèles animaux expérimentaux. Cette approche de réticulation est applicable à une variété de systèmes récepteurs pour les neurotransmetteurs ou les neuromodulateurs exprimés dans n’importe quelle région du cerveau et devrait contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à l’émotion et à la cognition.

Pour démontrer la faisabilité du test de réticulation BS3 pour évaluer les niveaux d’α5-GABA A R de surface dans le PFC de souris, nous avons analysé 10 μg chacun des échantillons de protéines réticulées et non réticulées BS3 sur SDS-PAGE et analysé les protéines par transfert Western à l’aide d’un anticorps anti-α5-GABAAR (polyclonal de lapin) (Figure 7). Les échantillons de protéines non réticulées ont donné la quantité totale d’α5-GABA A R à ~55 kDa, tandis que les é...

Le test de réticulation chimique BS3 révèle une réduction de l’expression du récepteur GABAA de surface cellulaire dans le cerveau de souris dans des conditions de stress psychosocial chronique.

BS3 Chemical Crosslinking Assay: Évaluation de l’effet du stress chronique sur la surface cellulaire Présentation du récepteur GABAA dans le cerveau des rongeurs

Anxiety is a state of emotion that variably affects animal behaviors, including cognitive functions. Behavioral signs of anxiety are observed across the ...

Le test de réticulation chimique utilisant BS3 comme agent de réticulation aidera à déterminer le niveau de surface de la cellule du récepteur des neurotransmetteurs, qui est un déterminant critique de l’efficacité de la transmission neurologique. Ce test est particulièrement utile pour l’évaluation spécifique de la dynamique des récepteurs spécifiques à la région du cerveau en réponse à divers agents psychotropes ou modalités de stress psychogène dans des modèles animaux. Pour commencer, retirez rapidement le cerveau du crâne de la souris C57BL/6J euthanasiée.Immergez-le dans une boîte de Petri contenant du PBS glacé pendant 10 à 15 secondes. Placez le cerveau refroidi dans la matrice cérébrale sur de la glace face au côté ventral vers le haut. Pour couper le cerveau coronallement, insérez la première lame de rasoir à travers la bordure entre le bulbe olfactif et le pédoncule olfactif.À l’aide de trois à quatre lames de rasoir supplémentaires, coupez en série la partie antérieure du cerveau coronalement à des intervalles d’un millimètre. Tenez les lames de rasoir insérées ensemble pour soulever les tranches coronales de la matrice cérébrale, en laissant la partie postérieure derrière. À l’aide de pinces, séparez les lames de rasoir les unes des autres et placez-les sur la surface plane et refroidie, la tranche de cerveau tournée vers le haut.Pour échantillonner le cortex préfrontal, choisissez les deuxième et troisième tranches postérieures à la première tranche contenant le pédoncule olfactif. À l’aide d’un poinçon ou d’une pince en tissu, retirez la région souhaitée. Placez le mouchoir sur la lame de rasoir réfrigérée et divisez-le uniformément en deux morceaux.Utilisez la pointe fine de la pince pour hacher chaque tissu en morceaux sur la lame de rasoir avec de multiples mouvements verticaux. Piquez le tube étiqueté pré-réfrigéré contenant du liquide céphalorachidien artificiel avec 30 microlitres de solution BS3 ou de solution de véhicule E.Puis transférez immédiatement les tissus hachés dans le tube souhaité. Pour prélever l’hippocampe, retirez la partie postérieure du cerveau de la matrice et placez-la sur du papier filtre humidifié sur une surface plane refroidie avec la face dorsale vers le haut.Avec une sonde incurvée et une pince s’approchant du côté dorsal, disséquez l’hippocampe des deux hémisphères, puis hachez le tissu et transférez-le dans des tubes à pointes appropriés comme démontré précédemment. Pour la réaction de réticulation, inverser le tube contenant le tissu et la solution pour briser les morceaux de tissu en petits morceaux. Incuber les échantillons sur le rotateur tubulaire à 4 degrés Celsius pendant 30 minutes à 2 heures et noter l’heure de début de l’incubation BS3 pour chaque tube.Ensuite, éteignez la réaction avec 78 microlitres d’une molaire de glycine. Incuber davantage pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius avec une rotation constante et noter l’heure de début et de fin de la trempe. Dans l’analyse par transfert Western après réticulation de BS3, la protéine non réticulée a montré la quantité totale de sous-unité alpha5 du récepteur GABA-A à environ 55 kilodaltons.Cependant, la protéine réticulée BS3 a montré que la sous-unité alpha5 du récepteur GABA-A associée à l’endomembrane migrait à environ 55 kilodaltons, ainsi que des espèces de protéines de poids moléculaire plus élevé représentant des complexes protéiques réticulés par covalence à la sous-unité alpha5 du récepteur GABA-A. De plus, une réduction significative et progressive de la sous-unité alpha5 de surface des niveaux de récepteurs GABA-A a été observée dans le cortex préfrontal à trois semaines et cinq semaines d’UCMS par rapport aux souris témoins sans stress. Les récepteurs sont connus pour faire la navette entre la surface de la membrane plasmique et la membrane interne à température ambiante.Il est donc important d’effectuer une dissection tissulaire à basse température. En utilisant le test de réticulation, il a été révélé que le stress psychosocial peut moduler de manière significative les niveaux de surface des récepteurs GABA, ce qui sert en partie de base moléculaire à l’anxiété, au comportement ou aux déficits cognitifs.

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Nous décrivons un modèle de rat de trouble de stress post-traumatique (SSPT) qui révèle les altérations persistantes dans la fonction neuroendocrine et le retard à long terme, l'intervention crainte exagérée, caractéristiques des patients SSPT. Le modèle animal et les méthodes décrites ici sont utiles pour corréler des biomarqueurs dans les noyaux du cerveau, qui sont mécaniste, mais ne peut pas être mesurée chez les patients avec des biomarqueurs en globules blancs périphériques, ce qui peut.

Biomarqueurs dans un modèle animal pour Révéler Corrélats neuronaux, hématologiques et du comportement de stress post-traumatique

Cette vidéo démontre la réticulation des protéines de surface neuronales à l’aide du subérât de bis-sulfosuccinimidyle ou BS3. Le cerveau de souris isolé et refroidi est sectionné coronalement. La région souhaitée est extraite des sections, hachée et traitée avec BS3. BS3 réticule les protéines de surface comme les récepteurs GABA, laissant les protéines internes inaltérées. La réaction est trempée avec de la glycine avant de traiter les échantillons pour une analyse plus approfondie.

Réticulation des protéines de surface neuronale dans le cerveau de la souris à l’aide d’un test de réticulation chimique

granules de stress (SG) sont des granules d'ARN cytoplasmiques contenant des particules bloquées ribonucléoprotéiques (RNP), et important dans la réponse cellulaire à différents stress. Dynamique de SG peuvent être suivies dans les cellules vivantes en visualisant la localisation d'un composant marqué de SG dans des cellules primaires transfectées après le stress.

Visualisation de G3BP stress Granules dynamique dans les cellules primaires en direct

Le protocole UCMS (Unpredictable chronic mild stress) est une méthode validée pour étudier les changements comportementaux et physiologiques associés au stress chronique et aux symptômes dépressifs. Huit semaines d’imposition du protocole UCMS induisent des changements de comportement et de mauvais résultats de santé chez les rongeurs des deux sexes.

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BS3 Chemical Crosslinking Assay: Évaluation de l’effet du stress chronique sur la surface cellulaire Présentation du récepteur GABAA dans le cerveau des rongeurs (Vidéo) | JoVE Journal

BS3 Chemical Crosslinking Assay: Évaluation de l’effet du stress chronique sur la surface cellulaire Présentation du récepteur GABA_A dans le cerveau des rongeurs

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