Name: Isolement et caractérisation des ligaments utéro-sacrés murins et des organes du plancher pelvien (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T13:25:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Découvrez un protocole de dissection des ligaments utéro-sacrés chez la souris pour étudier les troubles du plancher pelvien. Cette méthode préserve les attaches anatomiques et permet d'analyser l'influence de la grossesse sur les propriétés mécaniques des tissus.

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Ce travail a été soutenu par la subvention CU Boulder Summer Underground Research Opportunities Program (UROP) (C.B.), la bourse de recherche d’études supérieures de la NSF (L.S.), la bourse scientifique Schmidt (C.L.), le programme de subventions de démarrage pour la recherche et l’innovation de l’Université du Colorado (prix 2020 à V.F., S.C. et K.C.) et la subvention Anschutz Boulder Nexus Seed à l’Université du Colorado (à V.F. et K.C.). Nous remercions tout particulièrement le Dr Tyler Tuttle pour son aide dans la conception de la chambre de chargement, ainsi que les membres du laboratoire Calve pour leurs discussions utiles.

Toutes les expériences et procédures sur les animaux ont été effectuées conformément au protocole #2705, approuvé par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Colorado à Boulder. Des souris C57BL/6J femelles âgées de six semaines ont été utilisées pour la présente étude. Les animaux ont été obtenus d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux).
1. Préparation des animaux
<ol><li>Euthanasier l’animal selon la méthode approuvée par l’établissement. REMARQUE : La présente étude a utilisé l’inhalation de CO 2 conformément aux lignes directrices de l’American Veterinary Medical Association (un taux de déplacement de 30 % à 70 % du volume de la chambre avec du CO2 par minute), suivie d’une luxation cervicale, pour assurer une euthanasie réussie.<ol><li>Travaillez sous une cagoule, si possible, pour minimiser la propagation des allergènes de souris. Une fois que la souris cesse de bouger et de respirer, attendez 2 minutes ou plus pour vérifier l’absence de réponse. REMARQUE: Si la souris est enceinte ou post-partum, les chiots doivent être euthanasiés individuellement. Les chiots E15.5 et plus âgés doivent être décapités pendant la dissection.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparez la configuration de dissection à l’aide d’un tampon de dissection, d’un scalpel à 11 lames, de ciseaux pointus minces et incurvés, de deux paires de pinces, de pinces incurvées, d’une suture polyglactine 5-0, d’un microscope à dissection et de six broches (figure 1, voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Placez la souris sur le pad et épinglez les membres antérieurs vers le bas (Figure 2A). Faites une incision d’environ 1 à 1,5 cm dans l’abdomen avec des ciseaux (figure 2B). Utilisez doucement les ciseaux pour séparer la peau aux côtés crânien, caudal et latéral de l’incision (Figure 2C, D).</li>
	<li>Retournez la souris sur sa face dorsale et décollez doucement la peau vers les membres postérieurs pour éloigner la peau du site de dissection (figure 2E-H).</li>
	<li>Épinglez la souris aux membres (figure 2I) et faites une incision d’environ 1 cm dans l’abdomen, du thorax au bassin (figure 2J). REMARQUE: Assurez-vous de ne pas endommager les organes sous-jacents.</li>
	<li>Poussez doucement les organes vers le thorax pour dégager le champ de vision (Figure 2K). REMARQUE: Irriguer les tissus avec 1x PBS pour maintenir l’hydratation.</li>
	<li>Enlevez tout le tissu adipeux du plancher pelvien (figure 2L-N). REMARQUE: Utilisez des pinces pour retirer doucement et éliminer la graisse des organes et des tissus d’intérêt.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65074/65074fig01.jpg"> Figure 1 : Un espace de travail propre avec tous les outils nécessaires pour effectuer les dissections. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65074/65074fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65074/65074fig02.jpg"> Figure 2 : Enlèvement de la peau et ouverture des cavités pelviennes et thoraciques de la souris. (A) Épingler tous les membres. (B) Incision initiale. (C) Séparer la peau du fascia sous-jacent à l’aide de ciseaux. (D) Coupe de la peau et préparation de l’enlèvement. (E-G) Arracher la peau en faisant le tour de la souris. (H) Enlever complètement la peau de la face dorsale. (I) Enlèvement complet de la peau du torse et réépinglage des membres de la souris. (J) Ouverture de l’abdomen. K) Vue de l’abdomen ouvert. (L) Déplacement des organes hors du champ de vision. (M) Enlever la graisse. (N) Vue du plancher pelvien dégagé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65074/65074fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
2. Récolte de LSU
<ol><li>Coupez les cornes utérines des ovaires (Figure 3B), éloignez-vous du champ de vision et coupez au niveau de la connexion cervicale (Figure 3C). REMARQUE: Les cornes utérines peuvent être identifiées selon le schéma de la figure 3A. Irriguer les tissus avec 1x PBS pour maintenir l’hydratation.</li>
	<li>Coupez les uretères loin du raccord de la vessie (Figure 3D). NOTE: Ceci afin d’éviter toute confusion avec la LSU.</li>
	<li>Coupez le côlon le plus près possible du col de l’utérus (Figure 3E,F). REMARQUE: Irriguer les tissus avec 1x PBS pour maintenir l’hydratation.</li>
	<li>Placez la souris avec le tampon de dissection sous la lunette de dissection pour visualiser les LSU (Figure 3G).</li>
	<li>Utilisez doucement les pinces pour nettoyer la graisse environnante des LSU. REMARQUE: Utilisez une deuxième paire de pinces pour maintenir le col de l’utérus à un petit angle afin d’améliorer la visualisation de l’endroit où l’USL croise le col de l’utérus. Irriguer les tissus avec 1x PBS pour maintenir l’hydratation.</li>
	<li>Attachez une suture polyglactine 5-0 autour de l’extrémité cervicale des deux USL (Figure 4B, C). REMARQUE : Les LSU peuvent être identifiées à l’aide des images schématiques et d’agrandissement (Figure 4I-K)</li>
	<li>Dans cette étude, une LSU est utilisée pour les analyses morphologiques ou biochimiques (c.-à-d. microscopie Raman, immunohistochimie, histologie). Coupez l’extrémité cervicale de la LSU, en laissant un morceau du col de l’utérus attaché, et coupez un morceau de muscle du bas de la LSU (figure 4D). Placez le tissu disséqué dans un bain avec 1x PBS pour garder le tissu hydraté (Figure 4G, H).</li>
	<li>Utilisez la LSU restante pour les essais mécaniques et l’imagerie. Coupez l’extrémité cervicale de la LSU, en laissant un morceau du col de l’utérus attaché, pour faciliter la configuration mécanique (figure 4D). REMARQUE: Le tissu cervical servira d’ancrage pour fixer l’USL pendant le test mécanique.</li>
	<li>Une fois que tous les tissus d’intérêt sont prélevés (étapes 3 à 5), disloquez les fémurs du bassin (figure 4E). REMARQUE: On devrait entendre un léger cliquetis lorsque la tête fémorale est désarticulée de la coupe acétabulaire.</li>
	<li>Couper l’os pelvien des extrémités distales et proximales de l’os pelvien, en laissant environ 10 mm de tissu total (figure 4F). Placez le tissu disséqué dans 1x PBS.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65074/65074fig03.jpg"> Figure 3 : Plancher pelvien dégagé pour la dissection de la LSU. (A) Schéma de l’anatomie. (B) Couper les cornes utérines à la connexion ovarienne. (C) Couper les cornes utérines. D) Coupe des uretères. (E) Coupe du côlon. (F) Une vue claire du rectum et des LSU. (G) Placer la souris et le tampon de dissection sous la lunette de dissection. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65074/65074fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65074/65074fig04.jpg"> Figure 4 : Vue de la LSU et des tissus environnants et dissection des LSU. (A) Schéma des repères anatomiques entourant la LSU. (B) Attacher une suture autour des extrémités cervicales. (C) Trancher les extrémités cervicales de la LSU. (D) Découpage de la LSU à utiliser pour les analyses biochimiques à la connexion sacrée. E) Coupe des fémurs de l’os pelvien. (F) Couper l’extrémité proximale du bassin. (G) Dissection de l’USL dans une boîte de Petri de 35 mm. H) La LSU avec le bassin attaché dans une boîte de Pétri de 35 mm. (I) La LSU et le rectum à un grossissement de 0,75x. (J) Élimination de la graisse de la LSU. (K) Nettoyage des USL à un grossissement de 1,0x. Barre d’échelle = 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65074/65074fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
3. Prélèvement de la vessie
<ol><li>Une fois la graisse éliminée, tenez la vessie avec la pince et soulevez-la doucement à un angle d’environ 40° (figure 5A).</li>
	<li>Avec les ciseaux, trancher la vessie du côté distal, juste au-dessus du col de l’utérus (figure 5B).</li>
	<li>Placez le tissu dans un bain avec 1x PBS pour garder le tissu hydraté (Figure 5H).</li>
</ol>4. Prélèvement du rectum
<ol><li>Une fois que les LSU sont déconnectées du col de l’utérus et que la vessie est disséquée, soulevez le col de l’utérus à un angle d’environ 40° avec la pince. Il y a le fascia rectovaginal qui relie le rectum et le col de l’utérus. Avec le scalpel, coupez délicatement cette connexion (Figure 5C, D).</li>
	<li>Couper l’os pubien à la symphyse pubienne à l’aide de ciseaux. Élargissez doucement l’espace de travail pour augmenter l’accès visuel aux insertions tissulaires.</li>
	<li>Avec la pince, tirez doucement le rectum vers le thorax et utilisez les ciseaux pour suivre le rectum de sa face postérieure à l’anus. Coupez le rectum au niveau de l’anus (figure 5E).</li>
	<li>Placez le tissu dans 1x PBS pour garder le tissu hydraté (Figure 5I).</li>
</ol>5. Prélèvement du complexe col de l’utérus-vagin
<ol><li>Une fois les LSU retirées du col de l’utérus, utilisez les pinces pour maintenir le col de l’utérus. Coupez le col de l’utérus le plus près possible de la vulve à l’aide de ciseaux (Figure 5F, G). REMARQUE: Assurez-vous de couper la symphyse pubienne pour voir visuellement l’extrémité distale du vagin.</li>
	<li>Placez le tissu dans 1x PBS pour garder le tissu hydraté (Figure 5J).</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65074/65074fig05.jpg"> Figure 5 : Dissections de la vessie, du rectum et du col de l’utérus et du vagin. (A) Tenir la vessie en biais. (B) Couper la vessie. (C) Couper le tendon reliant le col de l’utérus et le rectum. (D) Le tendon à un grossissement de 1,0x. (E) Couper le rectum. (F) Tenir le col de l’utérus avec une pince. (G) Coupure à l’extrémité distale du vagin. (H) La vessie dans une boîte de Petri de 35 mm. (I) Le rectum dans une boîte de Petri de 35 mm. (J) Le complexe tissulaire col-vagin dans une boîte de Pétri de 35 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65074/65074fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
6. Préparation de l’échantillon pour la caractérisation tissulaire
<ol><li>Analyses mécaniques et visuelles de la LSU<ol><li>Placez la LSU avec l’attache pelvienne sur un mur en forme de T dans un puits de coloration personnalisé pour assurer une immersion complète dans la solution de coloration (les dessins CAO du puits se trouvent dans le fichier de codage supplémentaire 1 et le fichier de codage supplémentaire 2). REMARQUE: Utilisez la suture et les forceps pour faciliter le placement.</li>
		<li>Diluer un colorant disponible dans le commerce qui colore les groupes amines libres (5 μL, voir le tableau des matériaux) dans 2,5 mL de 1x PBS, ajouter la solution au puits de coloration personnalisé et colorer le tissu pendant 2 h sur une bascule à 4 °C. REMARQUE: Vortex la solution avant de l’ajouter au puits de coloration.</li>
		<li>Au cours des 15 dernières minutes de coloration, ajouter 2,5 μL d’une coloration de noyaux de cellules mortes disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) à la solution. REMARQUE: Vortex la solution avant de l’ajouter au puits de coloration.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse Raman des USL<ol><li>Épinglez la LSU en ligne droite sur un bloc de polydiméthylsiloxane (PDMS) contenu dans un puits personnalisé. REMARQUE: Le PDMS est utilisé comme substrat souple pour permettre l’épinglage de l’échantillon dans la configuration souhaitée. Des blocs de dimensions variables peuvent être fabriqués en mélangeant les deux composants en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux), en coulant dans une boîte de Petri et, après polymérisation, en coupant le PDMS dans la géométrie requise avec une lame de scalpel.</li>
		<li>Épingler avec des épingles d’insectes à la boucle de suture et au muscle pelvien. Hydratez le tissu avec 1x PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Tissus restants<ol><li>Congeler les tissus restants avec de l’azote liquide ou dans un composé d’enrobage approprié, selon les analyses souhaitées.</li>
		<li>Conservez les tissus à −80 °C jusqu’à des analyses ultérieures (p. ex. tests immunohistochimiques ou biochimiques).</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Smith, T. M., Luo, J., Hsu, Y., Ashton-Miller, J., DeLancey, O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+to+measure+in+vivo+uterine+suspensory+ligament+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">A novel technique to measure in vivo uterine suspensory ligament stiffness.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 209 (5), 1-7 (2013).</li>
<li>Vandamme, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+rodents+as+models+for+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Use of rodents as models for human diseases.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).</li>
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’effet des dommages structurels sur les tissus reproducteurs féminins est sous-étudié, et un modèle animal facilement accessible pour la recherche sur les POP est nécessaire. La souris est un modèle rentable qui peut imiter les études sur la reproduction humaine16. En raison de l’intérêt croissant pour l’étude du système reproducteur féminin, il existe un besoin de méthodes qui facilitent l’étude de ces tissus. Pour répondre à ce besoin, dans ce travail, une méthode est établie pour disséquer et ...

Environ 50 % des femmes sont touchées par le prolapsus des organes pelviens (POP)1,2. Environ 11 % de ces femmes répondent aux critères pour subir une réparation chirurgicale, ce qui a un faible taux de réussite (~30 %)3,4. Les POP se caractérisent par la descente de tout ou partie des organes pelviens (c.-à-d. vessie, utérus, col de l’utérus et rectum) de leur position naturelle en raison de l’incapacité de la LSU et des muscles du plancher pelvien à fournir un soutien adéquat5. Cette condition implique un dysfonctionnement anatomique et une perturbation du tissu conjonctif, ainsi que des lésions neuromusculaires, en plus des facteurs prédisposants 3,6. Les POP sont associés à de multiples facteurs tels que l’âge, le poids, la parité et le type d’accouchement (c.-à-d. les naissances vaginales ou césariennes). On pense que ces facteurs affectent l’intégrité mécanique de tous les tissus du plancher pelvien, la grossesse et la parité étant considérées comme les principaux moteurs du POP 5,7,8.
Les ligaments utéro-sacrés (LSU) sont des structures de soutien importantes pour l’utérus, le col de l’utérus et le vagin et attachent le col de l’utérus au sacrum4. Les dommages causés aux LSU exposent les femmes à un risque accru de développer des POP. On croit que la grossesse et l’accouchement imposent une pression supplémentaire sur la LSU, ce qui peut induire des blessures et augmenter les risques de POP. La LSU est un tissu complexe composé de cellules musculaires lisses, de vaisseaux sanguins et de lymphatiques répartis de manière hétérogène le long du ligament, qui peut être divisé en trois sections distinctes: cervicale, intermédiaire et sacrée9. L’intégrité mécanique de la LSU est dérivée de composants de la matrice extracellulaire (ECM) comme le collagène, l’élastine et les protéoglycanes 5,9,10. Les fibres de collagène de type I sont connues pour être un composant de traction porteur majeur des tissus ligamenteux et sont, par conséquent, probablement impliquées dans la défaillance de la LSU et du POP11.
Il y a un manque de connaissances sur les causes, la prévalence et les effets des POP chez les femmes. Le développement d’un modèle animal approprié de POP est nécessaire pour faire progresser notre compréhension du plancher pelvien féminin. Les souris et les humains ont des repères anatomiques similaires dans le bassin, tels que les uretères, le rectum, la vessie, les ovaires et les ligaments ronds9, ainsi que des points d’intersection similaires de la LSU avec l’utérus, le col de l’utérus et le sacrum. De plus, les souris offrent une facilité de manipulation génétique et ont le potentiel d’être un modèle facilement accessible et rentable pour l’étude du POP9. 
Cette étude a mis au point une méthode pour accéder à la LSU et aux différents tissus du plancher pelvien et les isoler chez des souris nullipares (c.-à-d. jamais gestantes). Les LSU extraits ont été soumis à une digestion enzymatique (c.-à-d. pour éliminer les collagènes et les glycosaminoglycanes), testés pour déterminer la réponse mécanique sous charge de traction et évalués pour la composition biochimique dans une étude de validation de concept. La capacité d’isoler des tissus intacts facilitera d’autres caractérisations mécaniques et biochimiques des composants du plancher pelvien, ce qui constitue une première étape cruciale pour améliorer notre compréhension des risques de blessures liés à l’accouchement, à la grossesse et aux POP.

<table><tbody><tr><td>11 Lame</td><td>Fisher</td><td>3120030</td><td>Lame amovible</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Fisher</td><td>BP399-1</td><td>Dilué à partir de 10x concentration</td></tr><tr><td>Chondroïtinase ABC</td><td>Sigma</td><td>C3667-10UN</td><td>Enzyme&nbsp ;</td></tr><tr><td>Collagénase de type I</td><td>Enzyme biochimique</td><td>LS004194</td><td>Worthington&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Leica</td><td>STELLARIS 5</td><td>Configuration verticale</td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Leica</td><td>S9E</td><td>Avec caméra</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pince</td><td>Fisher</td><td>NC9626652</td><td>Pointe fine</td></tr><tr><td>Femelle C57BL/6J</td> souris <td>Jackson Laboratory</td><td># : 000664</td><td></td></tr><tr><td>FemtoTools Micromanipulateur</td><td>FemtoTools</td><td>FT-RS1002</td><td>100 mN capteur de charge</td></tr><tr><td>FST Pince incurvée</td><td>Fisher</td><td>NC9639443</td><td>Pointe incurvée</td></tr><tr><td>FST Sharp 9 mm Ciseaux&nbsp ;</td><td>Fisher</td><td>NC9639443</td><td>Ciseaux de dissection</td></tr><tr><td>Ghost Dye 780&nbsp ;</td><td>Tonbo</td><td>13-0865-T500</td><td>Colorant aux amines libres</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td>Boîte de 50 lingettes</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue Tek</td><td>4583</td><td>Utilisé pour la préservation des tissus</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Thermo Fisher</td><td>044764.AK</td><td>Suivez les instructions du fabricant</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri 35 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875711A</td><td>Utilisé pour les tissus disséqués</td></tr><tr><td>Polyglactin 5-0 Suture</td><td>Veter.Sut</td><td>VS385VL</td><td>Avec aiguille</td></tr><tr><td>Renishaw InVia Microscope Raman</td><td>Renishaw</td><td>PN192(FR)-02-A</td><td>Avec objectifs confocaux</td></tr><tr><td>Plate-forme basculante</td><td>VWR</td><td>10127-876</td><td>Plate-forme à 2 niveaux</td></tr><tr><td>Gants chirurgicaux</td><td>Fisher</td><td>52818</td><td>Pour la dissection&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sytox</td><td>Thermo Fisher</td><td>S11381</td><td>Coloration nucléaire&nbsp ;</td></tr><tr><td>Goupilles en T</td><td>Fisher</td><td>S99385</td><td>Pour la dissection&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pipettes de transfert</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td>Pour la dissection&nbsp ;</td></tr><tr><td>Coussinets</td><td>Fisher</td><td>22037950</td><td>Pour couvrir le tampon de dissection</td></tr></tbody></table>

isolement et caractérisation des ligaments utéro-sacrés murins et des organes du plancher pelvien

Isolation and Characterization of the Murine Uterosacral Ligaments and Pelvic Floor Organs

Le prolapsus des organes pelviens (POP) est une affection qui affecte l’intégrité, la structure et le soutien mécanique du plancher pelvien. Les organes du plancher pelvien sont soutenus par différentes structures anatomiques, y compris les muscles, les ligaments et le fascia pelvien. Le ligament utéro-sacré (LSU) est une structure portante critique, et une lésion de la LSU entraîne un risque plus élevé de développer un POP. Le présent protocole décrit la dissection des LSU murins et des organes du plancher pelvien, ainsi que l’acquisition de données uniques sur la composition et la fonction biochimiques de la LSU à l’aide de la spectroscopie Raman et de l’évaluation du comportement mécanique. Les souris sont un modèle inestimable pour la recherche préclinique, mais disséquer la LSU murine est un processus difficile et complexe. Cette procédure présente une approche pour guider la dissection des tissus du plancher pelvien murin, y compris la LSU, afin de permettre de multiples évaluations et caractérisations. Ce travail vise à faciliter la dissection des tissus du plancher pelvien par les scientifiques fondamentaux et les ingénieurs, élargissant ainsi l’accessibilité de la recherche sur la LSU et les conditions du plancher pelvien et l’étude préclinique de la santé des femmes à l’aide de modèles murins.

Chaque étape de la dissection d’une souris de type sauvage est détaillée dans la vidéo associée et les figures liées au protocole. Pour cette étude, des souris C57BL/6J femelles âgées de 6 semaines ont été utilisées (tableau supplémentaire 1). Trois groupes d’échantillons avec des LSU traitées avec différentes enzymes ont été analysés: les groupes témoins (aucun traitement), les groupes traités à la collagénase et les groupes traités à la chondroïtinase. Le muscle lisse, les nerfs et les lymphatiques de ...

Cet article présente un protocole détaillé pour disséquer les ligaments utéro-sacrés et d’autres tissus du plancher pelvien, y compris le col de l’utérus, le rectum et la vessie chez la souris, afin d’élargir l’étude des tissus reproducteurs féminins.

Isolement et caractérisation des ligaments utéro-sacrés murins et des organes du plancher pelvien

Pelvic organ prolapse (POP) is a condition that affects the integrity, structure, and mechanical support of the pelvic floor. The organs in the pelvic ...

Ce protocole élargira l’accessibilité de la recherche sur les affections du ligament utéro-sacré et du plancher pelvien, comme le prolapsus des organes pelviens, et facilitera la dissection du tissu miroir du plancher pelvien. Cette technique permet d’isoler les deux ligaments utéro-sacrés d’une souris tout en maintenant les attaches anatomiques et en récupérant les organes du plancher pelvien environnants. Notre méthode établit un modèle préclinique qui permet cette étude de la façon dont la grossesse ou la maladie influence le comportement mécanique des tissus.Cette méthode établit un nouvel outil pour la recherche liée à la santé des femmes. La lutte principale consiste à identifier et à manipuler le ligament utéro-sacré. Mon conseil est de prendre suffisamment de temps et de soins parce que ces tissus sont petits et fragiles.Commencez par placer une souris euthanasiée sur un coussinet et épingler les quatre membres vers le bas. Faites une incision d’un à 1,5 centimètre de long sur l’abdomen avec des ciseaux. Séparez doucement la peau des côtés crânien, caudal et latéral de l’incision.Retournez la souris pour faire face à la face dorsale vers le haut et décollez doucement la peau vers les membres postérieurs. Épinglez les membres et faites une incision d’un centimètre de long dans l’abdomen du thorax au bassin. Poussez doucement les organes vers le thorax pour une vue dégagée.Après l’irrigation avec PBS à l’aide d’une paire de pinces, tirez et nettoyez le tissu adipeux pelvien. Identifiez les cornes utérines, puis coupez-les des ovaires. Maintenant, sortez-les du champ de vision et coupez la connexion cervicale.Couper les uretères de la connexion de la vessie. Coupez le côlon le plus près possible du col de l’utérus. Placez la souris avec le tampon sous une lunette de dissection pour visualiser les ligaments utéro-sacrés.Utilisez une pince pour éliminer doucement toute graisse environnante des ligaments utéro-sacrés. Attachez une suture 5-0 autour de l’extrémité cervicale des deux ligaments. Coupez l’extrémité cervicale du ligament utéro-sacré, en laissant un morceau du col de l’utérus attaché.Maintenant, coupez un morceau de muscle du bas du ligament. Placez le tissu disséqué dans un bain contenant du PBS pour maintenir l’hydratation des tissus. Coupez l’extrémité cervicale du tissu restant, en laissant un morceau de col de l’utérus attaché pour les tests mécaniques et l’imagerie.Une fois la graisse éliminée, tenez la vessie avec une pince et soulevez-la doucement à un angle d’environ 40 degrés. Utilisez des ciseaux pour couper la vessie du côté distal, juste au-dessus du col de l’utérus. Placez la vessie dans un bain avec PBS pour maintenir l’hydratation.Maintenant, utilisez la pince pour soulever le col de l’utérus à un angle approximatif de 40 degrés. Identifiez le fascia rectovaginal reliant le rectum et le col de l’utérus et coupez la connexion avec le scalpel. Utilisez des ciseaux pour couper l’os pubien à la synthèse pubienne.Élargissez doucement le plancher pelvien pour augmenter la visibilité des insertions tissulaires. Tenez le col de l’utérus avec une pince et coupez-le le plus près possible de la vulve. Placez le tissu dans PBS pour maintenir l’hydratation.Utilisez la pince pour tirer doucement le rectum vers le thorax. Identifiez le rectum et coupez-le au niveau de l’anus. Placez le rectum dans PBS pour maintenir l’hydratation.Une fois que tous les tissus d’intérêt sont récoltés, disloquez les fémurs du bassin. Coupez l’os pelvien des extrémités distales et proximales. Placez le tissu disséqué dans PBS.Le traitement enzymatique semblait réduire le pic axial moyen et les facteurs de stress détendus que le ligament utéro-sacré subit aux déplacements globaux prescrits, indiquant que le collagène et les glycosaminoglycanes contribuaient à la rigidité axiale des ligaments. Les déformations axiales moyennes pour chaque échantillon testé mécaniquement indiquent que la déformation axiale globale dans les échantillons traités par enzymes était similaire ou plus grande que l’échantillon contrôlé, ce qui suggère que la réduction du stress macroscopique était due à un traitement enzymatique plutôt qu’à des souches plus petites. La spectroscopie Raman de la section intermédiaire du ligament utéros-sacré suggère que les traitements enzymatiques ont modifié la composition biochimique des ligaments utéro-sacrés murins.Les ligaments utéros-sacrés traités au collagénase présentaient une diminution de la teneur en collagène, ainsi qu’une diminution de l’eau et de l’acide hyaluronique. Les ligaments utéros-sacrés traités par chondroïtinase avaient moins d’acide hyaluronique, ainsi qu’une teneur en eau et en collagène plus faible. L’attention aux détails est très importante, en particulier pour éliminer le fait que les dépôts autour de la LSU et des organes pelviens sont nécessaires pour éviter d’endommager la LSU et ses tissus environnants.D’autres recherches peuvent être menées sur la LSU et d’autres tissus du plancher pelvien en utilisant des souris qui ont des variations génétiques hypothétiques pour affecter les POP. Notre protocole permet déjà une série de nouvelles études, y compris l’étude de la façon dont le comportement mécanique des LSU modifie une fonction de la grossesse, qui est un facteur de risque clé pour les POP.

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Découvrez un protocole de dissection des ligaments utéro-sacrés chez la souris pour étudier les troubles du plancher pelvien. Cette méthode préserve les attaches anatomiques et permet d'analyser l'influence de la grossesse sur les propriétés mécaniques des tissus.

Isolement et caractérisation des ligaments utéro-sacrés murins et des organes du plancher pelvien

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