Name: Cartographie optique à double colorant des cœurs de souris knock-in RyR2R2474S de tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Découvrez la cartographie optique à double colorant pour étudier les propriétés électrophysiologiques des cœurs de souris CPVT. Cette méthode permet d'observer simultanément le potentiel membranaire et le calcium intracellulaire.

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Cette étude est soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81700308 à XO et 31871181 à ML, et 82270334 à XT), le Programme de soutien à la science et à la technologie (CN) de la province du Sichuan (2021YJ0206 à XO, 23ZYZYTS0433 et 2022YFS0607 à XT et 2022NSFSC1602 à TC) et le Laboratoire d’État clé pour la chimie et l’ingénierie moléculaire des ressources médicinales (Université normale du Guangxi) (CMEMR2017-B08 à XO), MRC (G10031871181 à ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE à Oxford (ML) subventions.

Des souris mâles de type sauvage âgées de 10 à 14 semaines ou des souris RyR2-R2474S/+ (fond C57BL/6) pesant 20 à 25 g sont utilisées pour les expériences. Toutes les procédures ont été approuvées par le comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université médicale du Sud-Ouest, Sichuan, Chine (approbation NO :20160930) conformément aux directives nationales en vertu desquelles l’institution fonctionne.
1. Préparation
<ol><li>Solutions de gestion des stocks<ol><li>Solution mère de blebbistatine : Ajouter 1 mL de diméthylsulfoxyde à 100 % (DMSO) dans le flacon d’origine contenant 2,924 mg de (-) poudre de blebbistatine pour atteindre une concentration de 10 mM.</li>
		<li>Indicateur de tension RH237 solution mère : Ajouter 1 mL de DMSO à 100 % dans le flacon d’origine avec 1 mg de poudre RH237 pour obtenir une concentration de 2,01 mM.</li>
		<li>Solution mère Rhod-2 AM pour indicateur de calcium : Ajouter 1 mL de DMSO à 100 % dans 1 mg de poudre Rhod-2 AM pour atteindre une concentration de 0,89 mM.</li>
		<li>Solution mère de Pluronic F127 : Ajouter 1 mL de DMSO à 100 % dans 200 mg de Pluronic F127 pour atteindre une concentration de 20 % p/v (0,66 mM).</li>
		<li>Aliquotez les solutions mères dans des tubes PCR de 200 μL dans des tubes de 21 à 51 μL (21 μL de RH237, 31 μL de Rhod-2 AM et 51 μL de blebbistatine) à usage simple ou double afin d’éviter la congélation et la décongélation répétées. Ensuite, enveloppez les solutions dans du papier d’aluminium et conservez-les à -20 °C, à l’exception de la solution mère Pluronic F127 placée dans une pièce sombre à température ambiante.</li>
	</ol></li>
	<li>Solution de perfusion<ol><li>Solution de Krebs (en mM) : Préparer 1 L de solution de Krebs (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH 2 PO 4 1,0, KCl4,7, MgCl 2 1,05, CaCl2 1,35 et glucose 10).</li>
		<li>Filtrer la solution à l’aide d’un filtre à aiguille aseptique de 0,22 μm et oxygéner avec 95 % d’O 2/5 % de CO2.</li>
		<li>Prélever 40 mL de solution de Krebs dans un tube centrifuge de 50 mL et le conserver à 4 °C pour un isolement cardiaque de suivi.</li>
	</ol></li>
	<li>Le système de perfusion Langendorff et le dispositif de cartographie optique<ol><li>Mise en place du système de perfusion Langendorff.<ol><li>Allumez le bain-marie et réglez la température à 37 °C.</li>
			<li>Lavez le système de perfusion Langendorff avec 1 L d’eau déminéralisée.</li>
			<li>Perfuser la solution à partir du conduit d’admission et ajuster le débit de sortie à 3,5-4 mL/min. Ensuite, oxygéner le perfusat avec du gaz O 2/CO2 (95%/5%) à 37 °C. REMARQUE : Une bulle n’est jamais autorisée dans le système de perfusion.</li>
		</ol></li>
		<li>Préparez le système de cartographie optique.<ol><li>Installez la caméra EMCCD (dispositif à couplage de charge multiplicateur d’électrons) (512 × 512 pixels), l’objectif (grossissement 40x), les diodes électroluminescentes (LED) séparatrices de longueur d’onde, le moniteur d’électrocardiogramme (ECG) et l’électrode de stimulation (Figure 1).</li>
			<li>Ajustez la distance de travail appropriée entre la lentille et la position du cœur.</li>
			<li>Placez deux LED en position diagonale du bain thermostatique pour un éclairage uniforme, fournissant une longueur d’onde de 530 nm pour générer une lumière d’excitation. Utilisez un filtre à revêtement pulvérisé ET525/50 pour éliminer toute lumière hors bande pour les LED.</li>
			<li>Ajustez l’interrupteur de la poignée pour obtenir un carré égal de la surface cible, ce qui permet aux images de tension et de calcium d’apparaître correctement sur l’interface d’acquisition.</li>
			<li>Tournez l’ouverture de l’objectif au diamètre maximum pour éviter toute fuite de signaux de tension ou de calcium.</li>
			<li>Ajustez l’objectif de la caméra à une hauteur appropriée, car il sert une bonne distance de travail par rapport au bain thermostatique, 10 cm sont généralement utilisés.</li>
			<li>Allumez la caméra pour une température d’échantillonnage stable à -50 °C.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Procédures
<ol><li>Prélèvement, canulation et perfusion du cœur de souris<ol><li>Injecter par voie intrapéritonéale aux animaux une solution d’avertin (1,2 %, 0,5 à 0,8 ml) et de l’héparine (200 unités) pour minimiser la souffrance et le réflexe de douleur et prévenir la formation de caillots sanguins. Au bout de 15 minutes, sacrifiez les animaux par luxation cervicale.</li>
		<li>Ouvrez le coffre avec des ciseaux, prélevez soigneusement le cœur et placez-le dans la solution froide de Krebs (4 °C, 95 % d’O 2, 5 % de CO2) pour ralentir le métabolisme et protéger le cœur.</li>
		<li>Prélevez le tissu environnant de l’aorte, canulez l’aorte à l’aide d’une aiguille de canule sur mesure (diamètre extérieur : 0,8 mm, diamètre intérieur : 0,6 mm, longueur : 27 mm) et fixez-la avec une suture en soie 4-0.</li>
		<li>Perfusez le cœur avec le système Langendorff à une vitesse constante de 3,5-4,0 mL/min et maintenez la température à 37 ± 1 °C. REMARQUE : Toutes les procédures suivantes sont effectuées dans cette condition.</li>
		<li>Insérez un petit tube en plastique (0,7 mm de diamètre, 20 mm de longueur) dans le ventricule gauche pour libérer la congestion de la solution dans la chambre afin d’éviter une surcharge.</li>
	</ol></li>
	<li>Découplage de l’excitation-contraction et de la charge à double colorant<ol><li>Insérez deux sondes dans le perfusat dans le bain, allumez les alimentations du boîtier d’amplification ECG et du contrôleur de stimulation électrique, puis démarrez le logiciel ECG référencé et surveillez l’ECG en continu.</li>
		<li>Effectuez les étapes suivantes dans l’obscurité lorsque le cœur atteint un état stable (le cœur bat rythmiquement à ~400 bpm).</li>
		<li>Mélanger 50 μL de solution mère de blébbistatine à 10 mM avec 50 mL de solution de Krebs pour atteindre une concentration de 10 μM. Perfuser constamment le mélange de solution de blebbistatine-Krebs dans le cœur pendant 10 minutes pour dissocier la contraction de l’excitation et éviter les artefacts de contraction pendant le tournage.</li>
		<li>Utilisez une lampe de poche rouge pour vérifier si la contraction cardiaque s’arrête totalement, car la contraction influencera la qualité de la charge du colorant.</li>
		<li>Après le découplage excitation-contraction, mélanger 15 μL de solution mère de Rhod-2 AM avec 15 μL de solution mère de Pluronic F127 dans 50 mL de solution de Krebs pour obtenir les concentrations finales de 0,267 μM Rhod-2 AM et 0,198 μM de Pluronic F127. Ensuite, perfusez le cœur en continu avec la solution de travail Rhod-2 AM pendant 15 minutes dans le système de perfusion Langendorff.</li>
		<li>Maintenez l’apport d’oxygène pendant la charge intracellulaire du colorant calcique. Étant donné que les bulles se forment facilement dans le Pluronic F127, insérez un piège à bulles dans le système de perfusion pour éviter l’embolisation gazeuse des coronaires.</li>
		<li>Diluer 10 μL de solution mère RH237 dans 50 mL de perfusat pour atteindre la concentration finale à 0,402 μM et effectuer le chargement pendant 10 minutes.</li>
		<li>À la fin de la charge à double colorant, prenez une séquence de photos pour vous assurer que les signaux de tension et de calcium sont adéquats pour l’analyse (pas d’interaction entre deux signaux).</li>
	</ol></li>
	<li>Cartographie optique et induction de l’arythmie REMARQUE : La cartographie optique commence après l’arrêt de la contraction et une charge de colorant appropriée, et le cœur est perfusé consécutivement comme dans les étapes décrites ci-dessus à la section 2.1 (4).<ol><li>Allumez les deux LED pour les lumières d’excitation et ajustez leur intensité à une plage appropriée (assez forte pour l’éclairage et un tournage relativement simple, mais pas trop robuste pour la surexposition).</li>
		<li>Placez le cœur sous le dispositif de détection, assurez-vous qu’il est suffisamment éclairé par deux LED et ajustez le diamètre du point lumineux à 2 cm.</li>
		<li>Réglez la distance de travail entre l’objectif et le cœur sur 10 cm, ce qui donne un taux d’échantillonnage de près de 500 Hz et une résolution spatiale de 120 x 120 μm par pixel.</li>
		<li>Ouvrez le logiciel d’échantillonnage du signal pour contrôler numériquement la caméra afin de capturer simultanément les signaux de tension et de calcium.</li>
		<li>Démarrez le stimulateur de champ myopacer et réglez le modèle de stimulation sur Transistor Transistor Logic (TTL), une durée de stimulation de 2 ms pour chaque impulsion et 0,3 V comme intensité initiale.</li>
		<li>Utilisez 30 stimuli S1 consécutifs à 10 Hz pour tester le seuil de tension diastolique du cœur piloté par le logiciel d’enregistrement ECG. Augmentez progressivement l’amplitude de la tension jusqu’à ce que la capture 1 :1 soit réalisée (vérifiez l’onde QRS du moniteur ECG, le potentiel d’action (AP) et les signaux transitoires calciques (CaT)).</li>
		<li>Après avoir déterminé le seuil de tension, stimulez le cœur à une intensité de 2 fois le seuil de tension diastolique avec une paire d’électrodes en platine fixées à l’épicarde de l’apex du ventricule gauche (VG) (ELVA).</li>
		<li>Mettre en œuvre le protocole S1S1 pour mesurer le calcium ou le potentiel d’action des alternans et les propriétés de restitution. Rythmez le cœur consécutivement à une durée de cycle de base de 100 ms, en diminuant de 10 ms de la durée du cycle chaque séquence suivante jusqu’à ce que 50 ms soient atteints. Chaque épisode comprend 30 stimuli consécutifs avec une largeur d’impulsion de 2 ms. Dans le même temps, commencez la cartographie optique avant la stimulation (le temps d’échantillonnage comprend ~10 rythmes sinusaux et la durée de stimulation).</li>
		<li>Pour mesurer la période réfractaire effective ventriculaire (PAR) à l’aide du protocole de stimulus S1S2, commencez par une durée de cycle de stimulation S1S1 de 100 ms avec un S2 couplé à 60 ms avec un décrément par pas de 2 ms jusqu’à ce que S2 ne parvienne pas à capturer le complexe QRS ectopique.</li>
		<li>Pour l’induction de l’arythmie, effectuez une stimulation en rafale perpétuelle de 50 Hz (50 stimulations électriques continues avec une largeur d’impulsion de 2 ms) et effectuez le même épisode de stimulation après un intervalle de repos de 2 s.</li>
		<li>Observez attentivement les enregistrements ECG pendant la période de stimulation continue à haute fréquence afin que les enregistrements de cartographie optique simultanés puissent commencer rapidement lorsqu’une onde ECG arythmique intéressante se génère (étant donné que la plupart des arythmies cardiaques sont induites par la stimulation électrique, les signaux optiques sont échantillonnés 2 à 3 s avant la stimulation en rafale en cas de perte d’événements cardiaques importants).</li>
		<li>Image à l’aide d’une caméra EMCCD (fréquence d’échantillonnage : 500 Hz, taille des pixels : 64 x 64).</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse des données<ol><li>Chargement d’images et traitement du signal<ol><li>Appuyez sur Select Folder et Load Images pour charger les images dans le logiciel d’acquisition d’images pour une analyse semi-automatique des données vidéo massives selon la configuration et le protocole décrits précédemment15,16.</li>
			<li>Entrez les paramètres d’échantillonnage corrects (tels que la taille des pixels et la fréquence d’images).</li>
			<li>Définissez le seuil d’image par saisie manuelle et sélectionnez la région d’intérêt (ROI).</li>
			<li>Implémentez un filtre spatial gaussien de 3 x 3 pixels, un filtre Savitzky-Goaly et une correction de ligne de base de type chapeau.</li>
			<li>Appuyez sur Process Images pour supprimer la ligne de base et calculer les paramètres électrophysiologiques, tels que APD80 et CaTD50.</li>
		</ol></li>
		<li>Analyse des paramètres électrophysiologiques<ol><li>Réglez le temps d’initiation de l’APD au pic et le point terminal à 80% de repolarisation (APD80) pour le calcul de l’APD80. De même, l’heure de début du CaTD est définie comme le pic et le point terminal est défini comme la relaxation de 80 %.</li>
			<li>La mesure de la vitesse de conduction (CV) dépend de la taille des pixels et du temps de conduction du potentiel d’action entre deux pixels ou plus. Calculez la vitesse moyenne de tous les pixels choisis, c’est-à-dire la vitesse de conduction moyenne de la région sélectionnée. Générez simultanément des cartes isochrones correspondantes pour une vue claire de la direction de la conduction. NOTE : O’Shea et al.15 ont rapporté la mesure CV en détail.</li>
			<li>Pour l’analyse des alternanes et de l’arythmie, les alternanes calciques sont définis comme une amplitude de crête continue de grande et de petite taille apparaissant alternativement. Utilisez le rapport d’amplitude de crête pour évaluer la gravité des alternants dépendants de la fréquence (1-A2/A1). Appliquez des cartes de phase pour analyser les arythmies complexes comme la tachycardie ventriculaire (TV). Recherchez les rotors apparaissant distinctement dans une région spécifique lorsque les rotors se déplacent.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Priori, S. G., Chen, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+dysfunction+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+handling+and+arrhythmogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis.</a> Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).</li>
<li>Goddard, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+consequences+of+the+P2328S+mutation+in+the+ryanodine+receptor+%28RyR2%29+gene+in+genetically+modified+murine+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts.</a> Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).</li>
<li>Sabir, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternans+in+genetically+modified+langendorff-perfused+murine+hearts+modeling+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Frontiers in Physiology. 1, 126(2010).</li>
<li>Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+Ca2%2B+homeostasis%2C+atrial+arrhythmogenesis%2C+and+sinus+node+dysfunction+in+murine+hearts+modeling+RyR2+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification.</a> Frontiers in Physiology. 4, 150(2013).</li>
<li>Leenhardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+in+children.+A+7-year+follow-up+of+21+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients.</a> Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).</li>
<li>Priori, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+cardiac+ryanodine+receptor+gene+%28hRyR2%29+underlie+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).</li>
<li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12.6+deficiency+and+defective+calcium+release+channel+%28ryanodine+receptor%29+function+linked+to+exercise-induced+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death.</a> Cell. 113 (7), 829-840 (2003).</li>
<li>Novak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+abnormalities+in+iPSC-derived+cardiomyocytes+generated+from+CPVT1+and+CPVT2+patients+carrying+ryanodine+or+calsequestrin+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).</li>
<li>Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CACNA1C-related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22GeneReviews%22%5BJournal%5D)">CACNA1C-related disorders.</a> GeneReviews. Adam, M. P. , University of Washington. Seattle. (1993).</li>
<li>Makita, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+calmodulin+mutations+associated+with+congenital+arrhythmia+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation.+Cardiovascular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility.</a> Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).</li>
<li>Gomez-Hurtado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+CPVT-associated+calmodulin+mutation+in+CALM3+%28CALM3-A103V%29+activates+arrhythmogenic+Ca+waves+and+sparks%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%2C+Arrhythmia+and+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks.</a> Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).</li>
<li>Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+tissue+mechanisms+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).</li>
<li>Neco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+effect+of+increased+diastolic+Ca2%2B+release+and+decreased+sinoatrial+node+activity+in+a+mouse+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).</li>
<li>Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinoatrial+nodal+cell+ryanodine+receptor+and+Na%28%2B%29-Ca%282%2B%29+exchanger%3A+molecular+partners+in+pacemaker+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation.</a> Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).</li>
<li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ElectroMap%3A+High-throughput+open-source+software+for+analysis+and+mapping+of+cardiac+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1389(2019).</li>
<li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663(2019).</li>
<li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts%3A+mechanisms+underlying+concordant+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).</li>
<li>Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+low-cost+cardiac+optical+mapping+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Open-source low-cost cardiac optical mapping system.</a> PLoS One. 17 (3), 0259174(2022).</li>
<li>Lucas-Lopez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+stereochemical+assignment+and+fluorescence+tuning+of+the+small+molecule+tool%2C+%28-%29-blebbistatin%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin.</a> European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).</li>
<li>Ponsaerts, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myosin+II+ATPase+inhibitor+blebbistatin+prevents+thrombin-induced+inhibition+of+intercellular+calcium+wave+propagation+in+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).</li>
<li>Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+%26+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li>
<li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li>
<li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663(2019).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dataset+of+dual+calcium+and+voltage+optical+mapping+in+healthy+and+hypertrophied+murine+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts.</a> Scientific Data. 8 (1), 314(2021).</li>
<li>Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+arrhythmogenesis%3A+a+tale+of+two+clocks%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).</li>
<li>Mal Baudot,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+genetic+ablation+of+L-type+Cav1.3+%CE%B11D+and+T-type+Cav3.1+%CE%B11G+Ca2%2B+channels+disrupts+heart+automaticity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18906(2020).</li>
<li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZO-1+regulates+intercalated+disc+composition+and+atrioventricular+node+conduction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction.</a> Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).</li>
<li>Glukhov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calsequestrin+2+deletion+causes+sinoatrial+node+dysfunction+and+atrial+arrhythmias+associated+with+altered+sarcoplasmic+reticulum+calcium+cycling+and+degenerative+fibrosis+within+the+mouse+atrial+pacemaker+complex1%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1.</a> European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).</li>
<li>Torrente, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burst+pacemaker+activity+of+the+sinoatrial+node+in+sodium-calcium+exchanger+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+SK2+upregulation+following+angiotensin+II+challenge%3A+Modulation+by+p21-activated+kinase-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).</li>
<li>Dong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+dual+calcium-voltage+optical+mapping+in+murine+sinoatrial+preparation+with+optogenetic+pacing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing.</a> Frontiers in Physiology. 10, 954(2019).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+transverse+cardiac+slicing+and+optical+mapping+in+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart.</a> Frontiers in Physiology. 10, 755(2019).</li>
<li>Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+calcium+release+in+tissue+from+the+failing+canine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).</li>
<li>Laurita, K. R., Singal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+action+potentials+and+calcium+transients+simultaneously+from+the+intact+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).</li>
<li>Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Errors+caused+by+combination+of+Di-4+ANEPPS+and+Fluo3%2F4+for+simultaneous+measurements+of+transmembrane+potentials+and+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium.</a> Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).</li>
</ol>

Aucun des auteurs n’a de conflit d’intérêts à déclarer.

Sur la base de notre expérience, les clés d’une cartographie optique à double colorant réussie d’un cœur de souris comprennent une solution et un cœur bien préparés, la charge du colorant, l’obtention du meilleur rapport signal/bruit et la réduction de l’artefact de mouvement.
Préparation de la solution La solution de Krebs est essentielle pour la réussite d’une expérience cardiaque. Les solutions mères de MgCl 2 et de CaCl2 (1 mol/L) sont préparées à l’avance en...

La tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique héréditaire (TVPC) se manifeste par des épisodes de tachycardie ventriculaire polymorphe (TVP) à la suite d’une activité physique, d’un stress ou d’une provocation aux catécholamines, qui peuvent se détériorer en fibrillation ventriculaire potentiellement mortelle 1,2,3,4 . Des preuves récentes à la suite de son premier rapport en tant que syndrome clinique en 1995 ont impliqué des mutations dans sept gènes, tous impliqués dans la libération de Ca 2+ dans le stockage réticulaire sarcoplasmique (SR) dans cette condition : le récepteur RYR2 codant pour la ryanodine 2 (RyR2) le plus fréquemment rapporté des canaux de libération de Ca2+5,6, FKBP12.67, CASQ2 codant pour la calséquestrinecardiaque 8, TRDN codant pour la protéine jonctionnelle SR triadine 9, et CALM1 9, CALM2 10 et CALM3 codant de manière identique pour la calmoduline11,12. Ces profils génotypiques attribuent les événements arythmiques à la libération pathologique non régulée de SR stock Ca2+12.
La libération spontanée de Ca 2+ par SR peut être détectée sous forme d’étincelles de Ca 2+ ou d’ondes de Ca 2+, ce qui active l’échangeur Na+/Ca 2+ (NCX). L’échangeur d’un Ca2+ pour trois Na+ génère un courant entrant, qui accélère la dépolarisation diastolique et conduit la tension membranaire jusqu’au seuil du potentiel d’action (PA). Chez les souris knock-in RyR2, l’activité accrue de RyR2R4496C dans le nœud sino-auriculaire (SAN) conduit à une diminution inattendue de l’automaticité du SAN par une diminution dépendante du Ca 2+ de l’épuisement de l’ICa,L et du SR Ca2+ pendant la diastole, identifiant des altérations physiopathologiques subcellulaires contribuant au dysfonctionnement du SAN chez les patients atteints de CPVT13,14. L’apparition des ondes cytosoliques Ca 2+ cardiomyocytaires associées est plus probable après l’augmentation du cytosolique de fond [Ca2+] à la suite de la sensibilisation RyR par la catécholamine, y compris l’isoprotérénol (ISO).
Les changements cinétiques détaillés dans la signalisation du Ca 2+ après la libération de Ca2+ médiée par RyR2 en réponse à l’activation du potentiel d’action (PA) qui pourrait être la cause des arythmies ventriculaires observées dans les modèles de CPVT cardiaque intacts restent à déterminer pour l’ensemble des génotypes RyR2 rapportés12. Cet article présente le dispositif d’instrumentation et la procédure expérimentale pour la cartographie à haut débit des signaux Ca2+ et des potentiels transmembranaires (Vm) dans les cœurs murins de type sauvage (WT) et hétérozygotes RyR2-R2474S/+, combinés à une stimulation électrique programmée avant et après le défi isoprotérénol. Ce protocole fournit une méthode pour l’étude mécanistique de la maladie CPVT dans des cœurs de souris isolés.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mu ; Filtre à seringue</td><td>Usine d’équipement médical de Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, Chine</td><td>N/A</td><td>Pour filtrer la solution</td></tr><tr><td>Tube à centrifuger de 15 mL</td><td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. Chine</td><td>CFT011150</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pipette Pasteur</td><td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd. Chine</td><td>00900026</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 mL</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>YZB/GER-5474-2014</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu ; L Tube PCR</td><td>Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. Chine</td><td>F611541-0010</td><td>Aliquote les solutions mères&nbsp ; pour éviter la congélation et la décongélation répétées</td></tr><tr><td>Tube de centrifugation de 50 mL</td><td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. Chine</td><td>CFT011500</td><td>Stocker la solution de Tyrode à 4 &deg ; C pour l’isolement cardiaque de suivi Filtre</td></tr><tr><td>585/40 nm</td><td>Technologie Chroma N</td><td>/A</td><td>Filtre pour signal calcique</td></tr><tr><td>Filtre passe-long 630 nm</td><td>Technologie Chroma</td><td>G15604AJ</td><td>Filtre pour signal de tension</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-tribromoéthanol)</td><td>Sigma-Aldrich Poole, Dorset, Royaume-Uni</td><td>T48402-100G</td><td>Pour minimiser la souffrance et le réflexe de douleur</td></tr><tr><td>Blebbistatine</td><td>Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, États-Unis</td><td>SLBV5564</td><td>Désaccouplement excitation-contraction pour éliminer l’artefact de mouvement pendant</td></tr><tr><td>la cartographie CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis</td><td>SLBK1794V</td><td>Pour la solution de Tyrode</td></tr><tr><td>Bain thermostatique sur mesure</td><td>MappingLab, Royaume-Uni</td><td>TBC-2.1</td><td>Pour maintenir la température de la solution</td></tr> <tr><td>de perfusionDimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>(RNBT7442)</td><td>Solvant pour colorants</td></tr><tr><td>Pince Dumont</td><td>Usine d’équipement médical de Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, Chine</td><td>YAF030</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel ElectroMap</td><td>Université de Birmingham</td><td>N/A</td><td>Quantification des paramètres électriques</td></tr><tr><td>Caméra EMCCD</td><td>Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, États-Unis</td><td>A18G150001</td><td>Acquérir des images pour les signaux optiques</td></tr><tr><td>ET525/36 filtre à revêtement pulvérisé</td><td>Chroma Technology</td><td>319106</td><td>Filtre d’excitation</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis</td><td>SLBT4811V</td><td>Pour la solution de Tyrode</td></tr><tr><td>Héparine Sodium</td><td>Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, Chine</td> <td>(H51021209)</td><td>Pour prévenir les caillots sanguins dans l’artère coronaire</td></tr><tr><td>&nbsp ; Pince à iris</td><td>Usine d’équipement médical de Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, Chine</td><td>YAA010</td><td></td></tr><tr><td>Isoprotérénol</td><td>MedChemExpress, Carlsbad, CA,</td><td>États-Unis HY-B0468/CS-2582</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis</td><td>SLBS5003</td><td>Pour la solution de Tyrode</td></tr><tr><td>MacroLED</td><td>Cairn Research, Faversham, Royaume-Uni</td><td>7355/7356</td><td>La lumière d’excitation des sondes de fluorescence</td></tr><tr><td>Source lumineuse MacroLED</td><td>Cairn Research, Faversham, Royaume-Uni</td><td>7352</td><td>Contrôler les LED</td></tr><tr><td>Ciseaux Mayo Usine</td><td>d’équipement médical de Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, Chine</td><td>YBC010</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>Échantillonnage des signaux optiques</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis</td><td>BCBS6841V</td><td>Pour la solution de Tyrode</td></tr><tr><td>MICRO3-1401</td><td>Cambridge Electronic Design limited, Royaume-Uni</td><td>M5337</td><td>Connecter le stimulateur électrique et le logiciel Spike2</td></tr><tr><td>Stimulateur de champ MyoPacer EP Ion</td><td>Optix Co, Milton, MA, États-Unis</td><td>S006152</td><td>Stimulateur électrique</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis</td><td>SLBS2340V</td><td>Pour la solution de Tyrode</td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp ; </td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis</td><td>BCBW9042</td><td>Pour la solution</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis</td><td>SLBX3605</td><td>Pour la solution de Tyrode</td></tr><tr><td>NeuroLog System</td><td>Digitimer</td><td>NL905-229</td><td>Pour amplificateur ECG</td></tr><tr><td>OmapScope5</td><td>MappingLab, Royaume-Uni</td><td>N/A</td><td>Alternans et analyse de l’arythmie</td></tr><tr><td>Ciseaux ophtalmiques</td><td>Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, Chine</td><td>T4-3904</td><td></td></tr><tr><td>OptoSplit</td><td>Cairn Research, Faversham, Royaume-Uni</td><td>6970</td><td>Fractionner la lumière d’émission pour détecter simultanément Ca2+ et Vm</td></tr><tr><td></td><td> </td><td>BT100-2J</td><td>Pour pomper la solution</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>BIOFIL</td><td>TCD010060</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis</td><td>1899021</td><td>Pour améliorer le chargement avec Rhod2AM</td></tr><tr><td>RH237</td><td>Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, États-Unis</td><td>1971387</td><td>Colorant sensible au voltage</td></tr><tr><td>Rhod-2 AM</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis</td><td>1890519</td><td>Indicateur de calcium</td></tr><tr><td>Tube de gel de silice</td><td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, Chine,</td> <td>96402-16 Connectez-vous</td><td>avec la pompe péristaltique</td></tr><tr><td>Suture en soie</td><td>Yuankang Medical Instrument Co., Ltd., Yangzhou, Chine</td><td>20172650032</td><td>Pour réparer l’aorte</td></tr><tr><td>Spike2</td><td>Cambridge Electronic Design limited, Royaume-Uni</td><td>N/A</td><td>Pour enregistrer et analyser les données ECG</td></tr><tr><td>Stimulation electrode</td><td>MappingLab,</td><td>Royaume-Uni SE1600-35-2020</td><td></td></tr><tr><td>T510lpxr</td><td>Chroma Technology</td><td>312461</td><td>Pour source lumineuse</td></tr><tr><td>T565lpxr</td><td>Chroma Technology</td><td>321343</td><td>Pour source lumineuse</td></tr></tbody></table>

cartographie optique à double colorant des cœurs de souris knock-in ryr2r2474s de tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

La tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique (TVPC) se manifeste par des épisodes de tachycardie ventriculaire polymorphe à la suite d’une activité physique, d’un stress ou d’un défi aux catécholamines, qui peuvent se détériorer en fibrillation ventriculaire potentiellement mortelle. Le cœur de souris est une espèce répandue pour modéliser les maladies arythmiques cardiaques héréditaires, y compris la TVPC. La cartographie optique simultanée du potentiel transmembranaire (Vm) et des transitoires calciques (CaT) à partir de cœurs de souris perfusés par Langendorff a le potentiel d’élucider les mécanismes sous-jacents à l’arythmogenèse. Par rapport à l’étude au niveau cellulaire, la technique de cartographie optique peut tester certains paramètres électrophysiologiques, tels que la détermination de l’activation, de la vitesse de conduction, de la durée du potentiel d’action et de la durée du CaT. Cet article présente le dispositif d’instrumentation et la procédure expérimentale pour la cartographie optique à haut débit du CaT et de la Vm dans des cœurs murins de type sauvage et hétérozygote RyR2-R2474S/+, combinés à une stimulation électrique programmée avant et pendant le défi isoprotérénol. Cette approche a démontré une méthode réalisable et fiable pour étudier mécanistiquement la maladie CPVT dans une préparation ex vivo de cœur de souris.

La cartographie optique a été une approche populaire dans l’étude des arythmies cardiaques complexes au cours de la dernière décennie. La configuration de cartographie optique se compose d’une caméra EMCCD, offrant un taux d’échantillonnage allant jusqu’à 1 000 Hz et une résolution spatiale de 74 x 74 μm pour chaque pixel. Il permet d’obtenir un rapport signal/bruit assez élevé lors de l’échantillonnage du signal (Figure 1). Une fois que le cœur perfusé par Langendorff atteint un état stable...

Ce protocole introduit une cartographie optique à double colorant des cœurs de souris obtenus à partir d’animaux de type sauvage et knock-in atteints de tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique, y compris des mesures électrophysiologiques de la tension transmembranaire et des transitoires intracellulaires Ca2+ avec une haute résolution temporelle et spatiale.

Cartographie optique à double colorant des cœurs de souris knock-in RyR2R2474S de tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes ...

Cette méthode nous aidera à révéler les propriétés électrophysiologiques et les mécanismes des frottis d’arrêt ventriculaire associés à des maladies telles que la tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique. En utilisant cette technique, nous pouvons obtenir simultanément le potentiel membranaire et les signaux calciques intercellulaires sous divers protocoles de stimulation électrique programmée, ce qui est particulièrement adapté à l’exploration des mécanismes et de la dynamique sous-jacents des maladies arythmiques cardiaques telles que la TVPC. Pour mener à bien cette expérience, assurez-vous d’avoir un cœur bien perfusé, une charge de colorant appropriée, un découplage excitation-contraction et des réglages minutieux de l’appareil photo.Pour commencer, configurez le système de cartographie optique et allumez la caméra pour une température d’échantillonnage stable à moins 50 degrés Celsius. Placez le cœur de souris récolté dans la solution froide de CREB pour ralentir le métabolisme et protéger le cœur. Retirez le tissu environnant de l’aorte.Utilisez une aiguille de canule sur mesure pour le canuler et fixez-le avec une suture en soie 4-0. Maintenant, perfusez le cœur avec le système Langendorff à une vitesse constante de 3,5 à 4,0 millilitres par minute. Insérez un petit tube en plastique dans le ventricule gauche pour libérer la congestion de la solution dans la chambre afin d’éviter une surcharge et fixez le tube en plastique dans l’aiguille de canulation.Placez ensuite deux fils dans le perfusat dans le bain et allumez les alimentations du boîtier d’amplification de l’électrocardiogramme et du contrôleur de stimulation électrique. Ensuite, lancez le logiciel d’électrocardiogramme ou d’ECG référencé et surveillez en permanence l’ECG. Effectuez les étapes suivantes dans l’obscurité lorsque le cœur atteint un état stable.Perfusez constamment le mélange de solution de blebbistatine CREBs dans le cœur pendant 10 minutes pour découpler la contraction de l’excitation et éviter les artefacts de contraction pendant le tournage. Ensuite, à l’aide d’une lampe de poche rouge, examinez le cœur pour confirmer l’arrêt complet des contractions. Perfuser le cœur avec la solution de travail Rhod-2 AM pendant 15 minutes dans le système de perfusion Langendorff après découplage de la contraction d’excitation.Maintenir l’apport d’oxygène pendant la charge intracellulaire de colorant calcique. Pour éviter la formation de bulles par le F-127 pluronique, insérez un piège à bulles dans le système de perfusion. Diluer 10 microlitres de solution mère RH 237 dans 50 millilitres de perfusat et charger pendant 10 minutes.Une fois le chargement du colorant double terminé, capturez une séquence de photos. Confirmez que les signaux de tension et de calcium sont adéquats pour l’analyse. Allumez les deux LED pour les lumières d’excitation et ajustez leur intensité à une plage appropriée.Placez le cœur sous le dispositif de détection, en veillant à ce qu’il soit bien éclairé par les deux LED ajustant le diamètre du point lumineux à deux centimètres. Réglez la distance de travail entre l’objectif et le cœur à 10 centimètres pour obtenir le taux d’échantillonnage et la résolution spatiale souhaités. Ouvrez le logiciel d’échantillonnage du signal pour contrôler simultanément la caméra et capturer les signaux de tension et de calcium.Démarrez le stimulateur de champ MyoPacer et réglez le modèle de stimulation sur la logique du transistor avec deux millisecondes de durée de stimulation par impulsion. Réglez l’intensité initiale sur 0,3 volt. Positionnez une paire d’électrodes en platine fixées à l’épicardie de l’apex du ventricule gauche.Appliquez 30 stimuli S1 consécutifs de 10 hertz pour tester le seuil de tension diastolique du cœur à l’aide du logiciel d’enregistrement ECG. Augmentez progressivement l’amplitude de la tension jusqu’à ce que la capture un-à-un soit atteinte. Mettre en œuvre le protocole S1-S1 pour mesurer les alternatives de calcium ou de potentiel d’action et les propriétés de restitution.Stimulez le rythme cardiaque consécutivement en commençant par une durée de cycle de base de 100 millisecondes. Diminuez la durée du cycle de 10 millisecondes dans chaque séquence suivante jusqu’à ce qu’elle atteigne 50 millisecondes. Lancez simultanément la cartographie optique avant la stimulation.Pour mesurer la période réfractaire ventriculaire effective à l’aide du protocole de stimulation S1-S2, commencez par une durée de cycle de stimulation S1-S1 de 100 millisecondes. Couplez S2 à 60 millisecondes et diminuez avec un décrément par pas de deux millisecondes jusqu’à ce que S2 ne parvienne pas à capturer le complexe QRS ectopique. Pour l’induction de l’arythmie, administrez une stimulation en rafale perpétuelle de 50 hertz et effectuez le même épisode de stimulation après avoir attendu un intervalle de repos de deux secondes.Surveillez attentivement les enregistrements de l’électrocardiogramme pendant la période de stimulation continue à haute fréquence pour commencer rapidement les enregistrements de cartographie optique simultanés lorsqu’une onde arythmique intéressante est générée. Procédez à la capture d’images à l’aide de la caméra du dispositif à couplage de charge multiplicateur d’électrons. Dans le logiciel d’acquisition d’images, appuyez sur Sélectionner un dossier et chargez les images pour commencer le processus semi-automatique d’analyse de données vidéo massives.Saisissez les paramètres d’échantillonnage corrects pour l’analyse. Définissez manuellement le seuil d’image et sélectionnez la région qui vous intéresse. Appliquez un filtre spatial gaussien de trois x trois pixels, un filtre de Savitzky-Golay et une correction de la ligne de base chapeau haut-de-forme.Appuyez ensuite sur Process Images pour supprimer la ligne de base et calculer les paramètres électrophysiologiques tels que APD-80 et CATD-50. Réglez le temps d’initiation de la durée du potentiel d’action au pic et le point terminal à 80% de repolarisation pour le calcul de l’APD-80. De même, définissez l’heure de début de la durée transitoire du calcium comme le pic avec le point terminal étant 80% de relaxation.Les traces typiques dans les cartes thermiques d’APD-80 et de CATD-80 sont indiquées. L’isoprotérénol raccourcit l’APD-80 et la tachycardie ventriculaire polymorphe de type sauvage et catécholaminergique ou CPVT, mais aucune différence n’a été trouvée après la provocation à l’isoprotérénol. Les souris CATD-80 et CPVT étaient plus longues que les souris sauvages après le test de provocation à l’isoprotérénol alors qu’il n’y avait pas de signification avant le traitement.Selon les signaux de tension, les cœurs de type sauvage et CPVT possédaient la même capacité de conduction à travers l’épicarde au départ et après l’intervention de l’isoprotérénol. Les cartes thermiques ont démontré que les souris CPVT ont la même capacité de conduction que les souris de type sauvage avant et après le défi de l’isoprotérénol. L’analyse des alternances d’amplitude calcique a montré que les signaux calciques dans les cœurs de type sauvage restaient stables au départ pendant les stimulations consécutives S1-S1 à 14,29 et 16,67 hertz, tandis que les cœurs CPVT présentaient des alternances dépendantes de la fréquence.Après le test de provocation à l’isoprotérénol, les cœurs CPVT ont présenté des alternances dépendantes de la fréquence et un signal calcique pendant la stimulation S1-S1, tandis que les cœurs de type sauvage n’ont pas été influencés. L’analyse de l’arythmie tachymatique a suggéré que les cœurs de type sauvage et CPVT présentent une conduction normale pendant la stimulation en rafale de 50 hertz au départ. Après une profusion d’isoprotérénol, les cœurs CPVT ont montré des rotors à haute fréquence après une stimulation en rafale de 50 hertz, tandis que les cœurs de type sauvage ont maintenu une conduction normale.À la suite de cette procédure, des souris de type dogen et de type sauvage sont utilisées pour illustrer les propriétés électrophysiologiques et fonctionnelles de ces modèles ou dans l’invention de produits pharmaceutiques. La cartographie optique est un outil puissant pour l’étude des arythmies cardiaques, mais elle ne peut pas être utilisée cliniquement en raison de la limitation du colorant fluorescent lors du découplage de la contraction de l’excitation. Avec le développement de la fluorescence propre pour différentes molécules cibles dans le cadre du développement de la technologie de calcul à haute révolution, la technique de cartographie optique cardiaque est vouée à ne réaliser que des applications.

dual-dye-optical-mapping-hearts-from-ryr2r2474s-knock-mice

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Cet article décrit une technique de haute résolution spatiale et temporelle optiquement l'image mouvement d'action potentielle sur la surface de coeurs de rats perfusés de Langendorff en utilisant un colorant potentiométrique (di-8-ANEPPS).

Cartographie optique des coeurs de rats perfusés de Langendorff

Ce rapport fournit une description détaillée de la méthodologie et les résultats de la cartographie simultanée optiques endocardique et épicardique de l'excitation électrique dans les oreillettes gauche intact d'un cœur de mouton Langendorff perfusé pendant l'étirement induit une fibrillation auriculaire.

High-Resolution cartographie endocardique et épicardique optique dans un modèle de moutons de Stretch-Induced fibrillation auriculaire

Cet article décrit les procédures de base pour mener des expériences de cartographie optique dans le coeur de lapin perfusé de Langendorff en utilisant le système d'imagerie panoramique, et la modalité d'imagerie double (de tension et de calcium).

Multiparamétrique cartographie optique du Cœur lapin perfusé de Langendorff

Ce document détaille la procédure de dissection, la configuration instrumentale, et des conditions expérimentales lors de la cartographie optique de potentiel transmembranaire (Vm) et de calcium intracellulaire transitoire (CAT) dans Langendorff isolés perfusés intacte cœur de la souris.

Cartographie optique de potentiels d&#39;action et les transitoires de calcium dans le cœur de la souris

Cet article décrit le protocole détaillé et l'équipement nécessaire pour une double cartographie optique du potentiel transmembranaire (V m) et d'une connexion intra-réticulum sarcoplasmique (SR) Ca 2+ dans le coeur de lapin Langendorff perfusé. Cette méthode permet l'observation directe et la quantification de V m et SR Ca 2+ dynamique dans le coeur intact.

Cartographie optique du commerce intra-réticulum sarcoplasmique Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Et potentiel transmembranaire dans le Lapin Coeur Langendorff perfusé

Ici, nous présentons un protocole de cartographie optique de l'activité électrique de l'oreillette droite de la souris et en particulier le nœud sino-auriculaire, à une résolution spatiale et temporelle.

Haute résolution de cartographie optique de la souris Noeud sino-auriculaire

Ce protocole décrit l’évaluation électrophysiologique des oreillettes murins utilisant un système de cartographie optique à haute résolution temporelle et spatiale, y compris les enregistrements doubles de la tension de la membrane et Ca2 + transitoire sous programmé stimulation au moyen d’une sonde électrode spécialisés.

Évaluation électrophysiologique des oreillettes murins avec cartographie optique à haute résolution

Nous présentons la méthodologie pour l'isolement des myocytes murines et comment obtenir des traces de tension ou de calcium simultanément avec des traces de raccourcissement sarcome à l'aide de la photométrie fluorescence avec des mesures numériques simultanées de géométrie cellulaire.

Imagerie optique des myocytes ventriculaires murines isolés

Ce protocole décrit la procédure de sectionnage et de culture de tranches cardiaques humaines pour les tests de médicaments précliniques et détaille l’utilisation de la cartographie optique pour l’enregistrement de la tension transmembrane et des signaux de calcium intracellulaire simultanément à partir de ces tranches.

Évaluation de l’électrophysiologie cardiaque préclinique par la double tension et la cartographie optique du calcium des tranches cardiaques organotypic humaines

Ce travail rapporte une méthode pour contrôler le rythme cardiaque de cœurs murins intacts de souris transgéniques channelrhodopsin-2 (ChR2) en utilisant la photostimulation locale avec un réseau micro-LED et la cartographie optique simultanée du potentiel de membrane épicardique.

Gestion avancée du rythme cardiaque par application d’une photostimulation optogénétique multisite dans les cœurs murins

Découvrez la cartographie optique à double colorant pour étudier les propriétés électrophysiologiques des cœurs de souris CPVT. Cette méthode permet d'observer simultanément le potentiel membranaire et le calcium intracellulaire.

Cartographie optique à double colorant des cœurs de souris knock-in RyR2R2474S de tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique (Vidéo) | JoVE Journal

Cartographie optique à double colorant des cœurs de souris knock-in RyR2^R2474S de tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique

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