Cartographie optique à double colorant des cœurs de souris knock-in RyR2R2474S de tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique

Cette méthode nous aidera à révéler les propriétés électrophysiologiques et les mécanismes des frottis d’arrêt ventriculaire associés à des maladies telles que la tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique. En utilisant cette technique, nous pouvons obtenir simultanément le potentiel membranaire et les signaux calciques intercellulaires sous divers protocoles de stimulation électrique programmée, ce qui est particulièrement adapté à l’exploration des mécanismes et de la dynamique sous-jacents des maladies arythmiques cardiaques telles que la TVPC. Pour mener à bien cette expérience, assurez-vous d’avoir un cœur bien perfusé, une charge de colorant appropriée, un découplage excitation-contraction et des réglages minutieux de l’appareil photo.

Pour commencer, configurez le système de cartographie optique et allumez la caméra pour une température d’échantillonnage stable à moins 50 degrés Celsius. Placez le cœur de souris récolté dans la solution froide de CREB pour ralentir le métabolisme et protéger le cœur. Retirez le tissu environnant de l’aorte.

Utilisez une aiguille de canule sur mesure pour le canuler et fixez-le avec une suture en soie 4-0. Maintenant, perfusez le cœur avec le système Langendorff à une vitesse constante de 3,5 à 4,0 millilitres par minute. Insérez un petit tube en plastique dans le ventricule gauche pour libérer la congestion de la solution dans la chambre afin d’éviter une surcharge et fixez le tube en plastique dans l’aiguille de canulation.

Placez ensuite deux fils dans le perfusat dans le bain et allumez les alimentations du boîtier d’amplification de l’électrocardiogramme et du contrôleur de stimulation électrique. Ensuite, lancez le logiciel d’électrocardiogramme ou d’ECG référencé et surveillez en permanence l’ECG. Effectuez les étapes suivantes dans l’obscurité lorsque le cœur atteint un état stable.

Perfusez constamment le mélange de solution de blebbistatine CREBs dans le cœur pendant 10 minutes pour découpler la contraction de l’excitation et éviter les artefacts de contraction pendant le tournage. Ensuite, à l’aide d’une lampe de poche rouge, examinez le cœur pour confirmer l’arrêt complet des contractions. Perfuser le cœur avec la solution de travail Rhod-2 AM pendant 15 minutes dans le système de perfusion Langendorff après découplage de la contraction d’excitation.

Maintenir l’apport d’oxygène pendant la charge intracellulaire de colorant calcique. Pour éviter la formation de bulles par le F-127 pluronique, insérez un piège à bulles dans le système de perfusion. Diluer 10 microlitres de solution mère RH 237 dans 50 millilitres de perfusat et charger pendant 10 minutes.

Une fois le chargement du colorant double terminé, capturez une séquence de photos. Confirmez que les signaux de tension et de calcium sont adéquats pour l’analyse. Allumez les deux LED pour les lumières d’excitation et ajustez leur intensité à une plage appropriée.

Placez le cœur sous le dispositif de détection, en veillant à ce qu’il soit bien éclairé par les deux LED ajustant le diamètre du point lumineux à deux centimètres. Réglez la distance de travail entre l’objectif et le cœur à 10 centimètres pour obtenir le taux d’échantillonnage et la résolution spatiale souhaités. Ouvrez le logiciel d’échantillonnage du signal pour contrôler simultanément la caméra et capturer les signaux de tension et de calcium.

Démarrez le stimulateur de champ MyoPacer et réglez le modèle de stimulation sur la logique du transistor avec deux millisecondes de durée de stimulation par impulsion. Réglez l’intensité initiale sur 0,3 volt. Positionnez une paire d’électrodes en platine fixées à l’épicardie de l’apex du ventricule gauche.

Appliquez 30 stimuli S1 consécutifs de 10 hertz pour tester le seuil de tension diastolique du cœur à l’aide du logiciel d’enregistrement ECG. Augmentez progressivement l’amplitude de la tension jusqu’à ce que la capture un-à-un soit atteinte. Mettre en œuvre le protocole S1-S1 pour mesurer les alternatives de calcium ou de potentiel d’action et les propriétés de restitution.

Stimulez le rythme cardiaque consécutivement en commençant par une durée de cycle de base de 100 millisecondes. Diminuez la durée du cycle de 10 millisecondes dans chaque séquence suivante jusqu’à ce qu’elle atteigne 50 millisecondes. Lancez simultanément la cartographie optique avant la stimulation.

Pour mesurer la période réfractaire ventriculaire effective à l’aide du protocole de stimulation S1-S2, commencez par une durée de cycle de stimulation S1-S1 de 100 millisecondes. Couplez S2 à 60 millisecondes et diminuez avec un décrément par pas de deux millisecondes jusqu’à ce que S2 ne parvienne pas à capturer le complexe QRS ectopique. Pour l’induction de l’arythmie, administrez une stimulation en rafale perpétuelle de 50 hertz et effectuez le même épisode de stimulation après avoir attendu un intervalle de repos de deux secondes.

Surveillez attentivement les enregistrements de l’électrocardiogramme pendant la période de stimulation continue à haute fréquence pour commencer rapidement les enregistrements de cartographie optique simultanés lorsqu’une onde arythmique intéressante est générée. Procédez à la capture d’images à l’aide de la caméra du dispositif à couplage de charge multiplicateur d’électrons. Dans le logiciel d’acquisition d’images, appuyez sur Sélectionner un dossier et chargez les images pour commencer le processus semi-automatique d’analyse de données vidéo massives.

Saisissez les paramètres d’échantillonnage corrects pour l’analyse. Définissez manuellement le seuil d’image et sélectionnez la région qui vous intéresse. Appliquez un filtre spatial gaussien de trois x trois pixels, un filtre de Savitzky-Golay et une correction de la ligne de base chapeau haut-de-forme.

Appuyez ensuite sur Process Images pour supprimer la ligne de base et calculer les paramètres électrophysiologiques tels que APD-80 et CATD-50. Réglez le temps d’initiation de la durée du potentiel d’action au pic et le point terminal à 80% de repolarisation pour le calcul de l’APD-80. De même, définissez l’heure de début de la durée transitoire du calcium comme le pic avec le point terminal étant 80% de relaxation.

Les traces typiques dans les cartes thermiques d’APD-80 et de CATD-80 sont indiquées. L’isoprotérénol raccourcit l’APD-80 et la tachycardie ventriculaire polymorphe de type sauvage et catécholaminergique ou CPVT, mais aucune différence n’a été trouvée après la provocation à l’isoprotérénol. Les souris CATD-80 et CPVT étaient plus longues que les souris sauvages après le test de provocation à l’isoprotérénol alors qu’il n’y avait pas de signification avant le traitement.

Selon les signaux de tension, les cœurs de type sauvage et CPVT possédaient la même capacité de conduction à travers l’épicarde au départ et après l’intervention de l’isoprotérénol. Les cartes thermiques ont démontré que les souris CPVT ont la même capacité de conduction que les souris de type sauvage avant et après le défi de l’isoprotérénol. L’analyse des alternances d’amplitude calcique a montré que les signaux calciques dans les cœurs de type sauvage restaient stables au départ pendant les stimulations consécutives S1-S1 à 14,29 et 16,67 hertz, tandis que les cœurs CPVT présentaient des alternances dépendantes de la fréquence.

Après le test de provocation à l’isoprotérénol, les cœurs CPVT ont présenté des alternances dépendantes de la fréquence et un signal calcique pendant la stimulation S1-S1, tandis que les cœurs de type sauvage n’ont pas été influencés. L’analyse de l’arythmie tachymatique a suggéré que les cœurs de type sauvage et CPVT présentent une conduction normale pendant la stimulation en rafale de 50 hertz au départ. Après une profusion d’isoprotérénol, les cœurs CPVT ont montré des rotors à haute fréquence après une stimulation en rafale de 50 hertz, tandis que les cœurs de type sauvage ont maintenu une conduction normale.

À la suite de cette procédure, des souris de type dogen et de type sauvage sont utilisées pour illustrer les propriétés électrophysiologiques et fonctionnelles de ces modèles ou dans l’invention de produits pharmaceutiques. La cartographie optique est un outil puissant pour l’étude des arythmies cardiaques, mais elle ne peut pas être utilisée cliniquement en raison de la limitation du colorant fluorescent lors du découplage de la contraction de l’excitation. Avec le développement de la fluorescence propre pour différentes molécules cibles dans le cadre du développement de la technologie de calcul à haute révolution, la technique de cartographie optique cardiaque est vouée à ne réaliser que des applications.