Production de neurones 2-inductibles de neurogénine humaine dans un bioréacteur en suspension tridimensionnel

L’utilisation de bioréacteurs pour traduire des cellules souches pluripotentes induites ou des protocoles de culture IPSC de 2D à 3D permet la génération de cellules en grand nombre pour des applications à grande échelle telles que les criblages à haut débit. Ce protocole de différenciation neuronale rapide dans un environnement physiologique 3D améliore les interactions entre les cellules de départ et donne un rendement cellulaire élevé sur une durée plus courte avec une faible variation de lot à = lot, réduisant ainsi les coûts et le temps. La Banque européenne de cellules souches pluripotentes induites applique des approches similaires pour la génération rapide et rentable de cellules différenciées dans plusieurs lignées, y compris d’autres cellules cérébrales et cardiomyocytes.

Commencer la pré-culture lorsque la cellule souche pluripotente induite par l’homme, ou culture humaine de CSPi, est confluente à 60 à 80%. Aspirer complètement le milieu des CSPi humaines et rincer doucement les cellules avec 1X DPBS deux fois. Ajouter deux millilitres de solution d’EDTA de trypsine préchauffée à la boîte de Petri de six centimètres et incuber les cellules pendant trois minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur.

Ensuite, tapotez doucement la vaisselle pour faciliter le détachement cellulaire ou incuber pendant une à deux minutes de plus si les cellules ne se détachent pas. Ensuite, remettez les cellules en suspension dans chaque boîte en ajoutant cinq millilitres de milieu de maintenance IPSC sans alimentation avec inhibiteur ROCK. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres ou 50 millilitres et mélanger délicatement par pipetage pour assurer la singularisation de la cellule.

Déterminez le nombre de cellules dans 100 microlitres de suspension cellulaire à l’aide d’un compteur de cellules automatisé et transférez le volume souhaité de suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres. Centrifuger les cellules à 300 G pendant trois minutes. Ensuite, aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans deux millilitres de milieu de maintenance IPSC sans alimentation avec inhibiteur de ROCK.

Remplissez chaque tube de 50 millilitres avec 18 millilitres du milieu. Ensuite, distribuez 20 millilitres de suspension cellulaire dans chaque tube de bioréacteur. Placez les tubes dans le système de bioréacteur et réglez les paramètres de culture pour une durée illimitée.

Démarrez le programme de pré-culture via l’affichage du bioréacteur. Pour changer le milieu le lendemain, laissez l’agrégat se déposer dans les tubes du bioréacteur pendant environ cinq minutes avant d’aspirer soigneusement le surnageant. Ajouter 15 millilitres de milieu de maintenance IPSC frais sans alimentation sans inhibiteur de ROCK par tube et poursuivre la culture dans le bioréacteur de paillasse pendant 24 heures.

Pour commencer la différenciation neuronale, laissez l’agrégat se déposer dans les tubes du bioréacteur et aspirez soigneusement le surnageant des cellules, laissant environ cinq millilitres de surnageant dans le tube. Ensuite, ajoutez 35 millilitres de milieu d’induction neuronale composé de milieu neurobasal et deux microgrammes par millilitre de doxycycline. Replacez les tubes dans le bioréacteur de paillasse et poursuivez la culture.

Effectuez des changements de média tous les jours pendant deux jours, comme démontré précédemment. Après avoir aspiré le surnageant comme indiqué précédemment, transférer les agrégats dans un tube stérile de 15 millilitres ou 50 millilitres et rincer doucement les agrégats deux fois avec DPBS. Aspirez soigneusement le surnageant autant que possible sans déranger les agrégats.

Ensuite, ajoutez deux à cinq millilitres d’enzyme de dissociation cellulaire préchauffée à la pastille, selon la taille de la pastille, et incuber les cellules pendant environ 10 minutes à 37 degrés Celsius dans un bain-marie. Remettez doucement en suspension les agrégats sédimentés toutes les deux minutes jusqu’à ce qu’ils se dissocient. Ajouter le milieu neurobasal préchauffé, trois fois le volume de l’enzyme de dissociation cellulaire précédemment ajoutée, et remettre les cellules en suspension avec précaution pour assurer la singularisation cellulaire.

Déterminer le nombre de cellules et transférer le volume correspondant de suspension cellulaire pour la cryoconservation dans un tube de 15 millilitres ou 50 millilitres. Centrifuger vers les cellules à 300 G pendant trois minutes. Aspirer le surnageant et remettre doucement en suspension la pastille cellulaire dans le volume correspondant du milieu de congélation contenant 10% de diméthylsulfoxyde.

Aliquote la suspension cellulaire dans des flacons appropriés pour la cryoconservation. Transférer immédiatement les flacons dans un récipient de congélation pré-réfrigéré à taux lent rempli de 2-propanol et placer le récipient à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit. Placez les flacons à moins 150 degrés Celsius le lendemain pour un stockage à long terme.

Après que les cultures adhérentes des CSPi humaines ont été détachées, singularisées et transférées en suspension, les agrégats se sont formés en 24 heures et ont continué à croître. Après deux jours d’induction transgénique, les premiers neurones pouvaient être cryoconservés pour une maturation ultérieure. Une prolifération persistante des CSPi humaines pendant les premiers jours en suspension a été observée, et le nombre de cultures cellulaires a culminé après deux jours d’induction.

Cependant, une culture prolongée de plus de quatre jours en suspension n’a pas amélioré le rendement cellulaire, car les agrégats sont devenus de plus en plus résistants à la singularisation enzymatique. De plus, par rapport au jour zéro, le diamètre total a augmenté de 50% le deuxième jour et a presque doublé le cinquième jour. Bien que l’augmentation du diamètre limite l’apport de nutriments aux agrégats, la viabilité des cellules n’a pas été affectée le deuxième ou le cinquième jour de différenciation.

Le profil d’expression génique temporel ainsi que la coloration immunochimique des marqueurs neuronaux bêta trois tubuline et protéine associée aux microtubules, ou MAP2, ont confirmé l’identité cellulaire neuronale des cellules cryopréservées du deuxième jour. De plus, les cultures neuronales ont été enrichies en transcrits de protéine tau associés aux microtubules, ou MAPT, et ont montré une baisse concomitante de l’expression du facteur de transcription régulateur de la pluripotence POU5F1 Un réseau neuritique dense s’est formé au cours de la première semaine après la décongélation, ce qui suggère également une maturation croissante des cultures neuronales. Ce protocole jette les bases de la traduction en bioréacteurs à grande échelle et entièrement automatisés, qui montrent une nouvelle augmentation significative de la capacité de production cellulaire pour de futures applications à grande échelle.

Une fois prouvée avec la neurogénine 2, l’utilisation de facteurs de transcription déterminants linéaires pour accélérer la différenciation a été appliquée à de nombreux types de cellules et de maladies différentes pour faciliter la modélisation des CSPi.