Name: Production de neurones 2-inductibles de neurogénine humaine dans un bioréacteur en suspension tridimensionnel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Découvrez la différenciation neuronale rapide de cellules iPS humaines dans un bioréacteur 3D en suspension. Cette méthode offre un rendement élevé avec faible variabilité inter-lots pour des applications à grande échelle.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Le projet EBiSC2 a reçu un financement de l’entreprise commune (JU) de l’initiative en matière de médicaments innovants 2 dans le cadre de la convention de subvention n° 821362. L’entreprise commune reçoit le soutien du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne et de l’EFPIA. Nous remercions Nadine J. Smandzich, Helene D. M. Hemmer, Johnn-Majd Balsters et Vanessa M. Nalewaja pour leur aide dans les analyses immunocytochimiques et d’expression génique, ainsi que Heike Arthen pour son excellent soutien technique. De plus, nous remercions Stephanie Bur pour la mise en place du programme de bioréacteurs. La figure 2A a été créée avec BioRender.com.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Il a déjà été démontré que l’expression ectopique du facteur de transcription neuronal NGN2 accélère les premiers stades de la différenciation neuronale et induit l’engagement de la lignée neuronale dans les CSPhi dans la semaine suivant la culture12,13,20. Ce travail décrit un protocole détaillé pour la différenciation des hiPSCs BIONi010-C-13 génétiquement modifiés en neurones iNGN2 à l’aide d’un bioréacteur de paillasse.
Le bioréacteur CERO 3D est un bioréacteur à faible volume avec quatre emplacements pour tubes spécialisés, chacun d’une capacité maximale de 50 mL. Les niveaux de température et de CO2 sont contrôlés en permanence et les paramètres de culture (par exemple, la vitesse et le temps de rotation) sont régulés pour chaque tube, ce qui permet aux utilisateurs d’exécuter plusieurs approches de différenciation en parallèle. Les brise-ondes intégrés sur la paroi du tube intérieur permettent une perturbation du fluide avec une faible contrainte de cisaillement et maintiennent les agrégats 3D en suspension pendant la rotation contrôlée. L’accès limité aux nutriments, ainsi que les interactions 3D cellule-cellule et cellule-matrice extracellulaire (ECM) forcées, peuvent influencer de manière significative la différenciation cellulaire et le comportement24,25,26,27.
La culture de cellules sous forme d’agrégats 3D en suspension augmente ces interactions cellulaires, imitant ainsi plus étroitement l’environnement in vivo des tissus ou des organes28. La perturbation concomitante du milieu régule la taille des agrégats due au frottement mécanique, améliore les échanges gazeux et réduit le gradient des nutriments et des déchets dans le tube, tout en préservant les gradients physiologiques pertinents à l’intérieur des agrégats 29,30,31,32,33,34 . Bien que les changements de milieu soient effectués manuellement, le bioréacteur de paillasse réduit les coûts de main-d’œuvre et d’exploitation par rapport aux flacons de culture statique. Le bioréacteur offre également plusieurs avantages par rapport aux bioréacteurs à agitation entièrement automatisés, car la conception sans roue réduit la contrainte de cisaillement hydrodynamique à la surface de l’agrégat, améliorant ainsi non seulement la survie des cellules, mais limitant également les effets de la contrainte de cisaillement sur les CSPi sensibles, la différenciation cellulaire et la fonction35,36,37,38.
Les bioréacteurs à roues verticales, dans lesquels les cellules sont agitées par une grande roue verticale, ainsi que les bioréacteurs à bascule utilisant des sacs de culture gonflés attachés à une plate-forme motorisée, représentent des plates-formes de suspension 3D alternatives. Bien que excessivement testés pour la culture de CSPhi 17,18,19,39,40, on sait peu de choses sur leur applicabilité dans les approches de différenciation neuronale, et les rapports se limitent à l’expansion réussie des cellules précurseurs neurales de mammifères et d’humains dans les bioréacteurs à fustiger 41,42,43,44, avec un nombre rare d’études axées sur maturation44,45. En général, les plates-formes de suspension 3D automatisées offrent l’avantage de changements de support entièrement automatisés et contrôlés par ordinateur, réduisant ainsi les variations de manipulation et minimisant le risque de contamination. En outre, les paramètres nutritifs tels que le lactate et la concentration de glucose peuvent être surveillés en permanence. Cependant, la mise en place de ces systèmes nécessite souvent un investissement initial important, de l’espace de laboratoire et la formation de personnel qualifié. Le bioréacteur de paillasse représente une alternative compacte et facile à utiliser pour la culture de cellules en suspension, mais ne fournit pas de surveillance simultanée des nutriments.
Comme dans la majorité des protocoles utilisés pour la culture de cellules dans des plateformes de suspension 3D, la formation initiale d’agrégats représente une étape critique. Les hiPSCs sont cultivés sous forme de monocouches adhérentes et ensuite transférés sous forme de suspensions unicellulaires dans un environnement 3D. Pour minimiser la perte cellulaire à ce stade, plusieurs aspects doivent être pris en compte. La conception des tubes avec les brise-ondes intégrés signifie qu’un volume de culture minimal de 10 mL par tube est nécessaire pour assurer une perturbation optimale du milieu. Le volume critique ne doit donc pas être sous-coté à long terme. De plus, une densité de semis initiale de 7,5 millions de cellules par 10 mL de volume de culture et une vitesse de rotation de 60 tr/min sont fortement recommandées pour former des agrégats stables à court terme, bien que des adaptations puissent être nécessaires en fonction de la lignée cellulaire.
Après le transfert des CSPhi en suspension, des agrégats doivent être formés dans les 24 heures. Le premier changement moyen est critique, car les agrégats sont petits et peuvent ne pas se déposer correctement. Le temps de sédimentation des granulats peut être prolongé mais ne doit pas dépasser plus de 10 minutes, car les agrégats peuvent commencer à s’agglutiner et à croître de manière hétérogène. Pendant l’aspiration, un volume de culture minimal de 5 mL doit être laissé dans le tube et toute perturbation du milieu doit être évitée. Néanmoins, une perte de cellules et d’agrégats est à prévoir au cours des phases initiales. Le nombre de cellules indique un rendement cellulaire constant au cours des 2 premiers jours en culture, indiquant que la capacité proliférative élevée des CSPhi compense la perte cellulaire initiale. Une fois en suspension, la culture douce et la perturbation conduisent à des agrégats de taille homogène qui commencent à croître avec le temps.
La différenciation neuronale a été réalisée selon un protocole précédemment publié basé sur la surexpression de NGN2 induite par la doxycycline13, et les étapes individuelles ont été optimisées pour une culture 3D. Le facteur de transcription neuronale NGN2 est un moteur bien décrit dans la différenciation neuronale et accélère significativement l’induction neuronale11,13,46. Alors que la structuration conventionnelle avec des facteurs de croissance définis prend plusieurs semaines à 7,8,9, l’expression de NGN2 induit le destin des cellules neuronales en quelques jours. En plus du temps de culture raccourci, le protocole ne dépend ni de facteurs de croissance coûteux ni de matrices d’enrobage pour la culture initiale en suspension, ce qui réduit les coûts de culture supplémentaires.
De plus, une comparaison directe de la génération de neurones immatures induite par NGN2 dans des cultures adhérentes et en suspension a révélé une multiplication par 1,36 du nombre de cellules après 4 jours en culture à l’aide du bioréacteur de paillasse20, tandis que le volume de milieu requis pour la génération de 1 million de cellules devrait être réduit de moitié. L’utilisation du bioréacteur de paillasse pour la génération de neurones iNGN2 peut donc être bénéfique, car un plus grand nombre de cellules peut être produit avec un temps et un coût de manipulation réduits. Conformément aux rapports précédents, l’engagement de la lignée neuronale a été observé très tôt. Après 2 jours d’induction NGN2, une expression profonde de marqueurs neuronaux classiques tels que TUBB3, MAP2 et MAPT était évidente, soutenant l’applicabilité du bioréacteur de paillasse pour l’induction neuronale. En suivant ce protocole, environ 6,2 millions de neurones iNGN2 immatures peuvent être obtenus à partir de 1 million de CSPhi dans les 4 jours suivant la culture. Toutefois, la capacité de production peut varier d’un lot à l’autre et dépendre du volume de culture en suspension au moment de l’ensemencement.
Pour augmenter encore le rendement, le temps de culture a été prolongé de 3 jours supplémentaires; Cependant, bien que les agrégats soient devenus plus gros, ils sont également devenus très compacts et ne pouvaient pas être dissociés correctement pour la cryoconservation ou le replacage. Malgré les progrès réalisés dans les approches de culture 3D, les cultures neuronales 2D adhérentes sont toujours l’étalon-or pour les analyses fonctionnelles telles que les réseaux de microélectrodes ou l’imagerie calcique. La singularisation cellulaire est donc une condition préalable importante pour une monocouche neuronale et un réseau neuritique répartis de manière homogène. Un détachement mécanique plus fort des cellules ou des réactifs de dissociation agressifs peuvent être utilisés pour assurer la singularisation, mais avec des effets potentiels sur la viabilité cellulaire, la physiologie et la capacité de rattachement47,48. En ce qui concerne la nécessité de cellules individuelles pour des analyses et une maturation ultérieures, les agrégats ont été dissociés après 4 jours en suspension, et les neurones iNGN2 (jour 2) cryoconservés. La différenciation post-décongélation et la caractérisation des neurones iNGN2 ont confirmé une maturité croissante des cultures neuronales et la formation d’un réseau neuritique dense.
Le protocole fourni produit un nombre élevé de neurones iNGN2. Cependant, plusieurs limites doivent être prises en compte. Comme pour la plupart des plates-formes de culture en suspension, le transfert des CSPh d’une culture adhérente 2D à un environnement 3D est essentiel et souvent associé à une perte cellulaire profonde. D’autres pertes importantes de cellules et d’agrégats sont attendues lors des changements de milieux. Par rapport aux plates-formes automatisées, le temps de manipulation et le risque de contamination à l’aide du bioréacteur de paillasse sont augmentés, car les changements de milieu doivent être effectués manuellement. Outre le manque d’automatisation, le bioréacteur de paillasse n’offre pas la possibilité de surveiller les nutriments, et la capacité maximale de 50 ml par tube limite le potentiel de mise à l’échelle du protocole. Enfin, il est important de noter que, bien que NGN2 accélère l’engagement de la lignée neuronale, la durée de maturation terminale n’est pas raccourcie et nécessite tout de même une culture à long terme sur plusieurs semaines. Compte tenu de l’importance du soutien astrocytaire pour la fonction neuronale, l’attachement et la survie 49,50,51, les approches de co-culture devraient être envisagées et peuvent même être essentielles pour la culture à long terme.
En résumé, un protocole de différenciation 2D a été traduit avec succès dans un environnement 3D pour la génération rapide et reproductible de neurones iNGN2 en mettant en œuvre un bioréacteur de paillasse. Le protocole décrit produit de grandes quantités de neurones dérivés de l’iPSC de bonne qualité, qui peuvent servir de point de départ pour des tests de modèles complexes, des criblages de médicaments à haut débit et des tests de toxicité à grande échelle.

Les troubles neurologiques sont la principale cause d’invalidité dans le monde1. Une personne sur six est touchée, et l’incidence continue d’augmenter. Le fardeau financier qui en découle pour les sociétés et leurs systèmes de soins de santé est énorme. Une évaluation de 30 pays européens en 2010 a estimé les coûts annuels liés aux troubles mentaux et neurologiques à 800 milliards d’euros2. Le fardeau socio-économique croissant exige des stratégies de traitement efficaces, et bien que notre compréhension de la physiopathologie de la maladie ait considérablement augmenté, la traduction dans les cliniques est souvent insuffisante. En général, seulement 12 % des produits pharmaceutiques font l’objet d’essais cliniques, dont plus de 80 % échouent aux stades ultérieurs, principalement en raison de leur inefficacité ou d’une toxicité imprévue 3,4. Les raisons sont variées, mais la transférabilité limitée de l’expérimentation animale aux essais sur l’homme est de plus en plus mise en évidence5. Les modèles de cellules et de tissus humains in vitro peuvent combler le fossé de la traduction interspécifique, et les progrès de la technologie des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC) possèdent un grand potentiel à cet égard. Les CSPh sont largement utilisées en recherche fondamentale et partagent des caractéristiques essentielles avec les cellules souches embryonnaires (CSEh), telles qu’une capacité d’auto-renouvellement presque illimitée et la capacité de se différencier en trois couches germinales6, tout en contournant les préoccupations éthiques associées à la destruction embryonnaire.
La dérivation de cellules neuronales à partir de CSEh, et plus tard de CSPh, a marqué une étape importante dans la recherche sur le cerveau. Les protocoles de différenciation initiaux étaient basés sur l’application de facteurs de croissance imitant des étapes critiques au cours de l’embryogenèse, la plupart d’entre eux impliquant une double inhibition de la SMAD en suspension ou en cultures adhérentes 7,8,9. Les neurones matures ont été générés avec succès, mais plusieurs inconvénients de ces protocoles entravent encore leur large utilisation dans le développement de médicaments, tels que le faible rendement et la grande variabilité d’un lot à l’autre des neurones générés, ainsi que la charge de travail importante liée aux longs temps de culture. Des améliorations ont été obtenues par l’expression forcée de facteurs de transcription impliqués de manière critique dans la neurogenèse, et les membres de la famille des neurogénines (NGN), en particulier NGN2, ont été identifiés comme des facteurs efficaces10. L’expression ectopique de NGN2 médiée par le lentiviral dans les CSPhi a considérablement accéléré les premiers stades de la différenciation neuronale et induit le destin des cellules neuronales en seulement 1 semaine11. La maturation terminale ultérieure dans des co-cultures avec des astrocytes a donné des neurones fonctionnels d’une grande pureté et en grande quantité avec des propriétés reproductibles. L’édition génique dirigée sur site du locus refuge du site d’intégration des virus adéno-associés 1 (AAVS1) a ensuite été appliquée pour créer des lignes hiPSC avec une cassette d’expression stable et inductible par la doxycycline pour NGN212,13, minimisant ainsi les effets secondaires indésirables de l’administration de lentiviraux.
La différenciation robuste et efficace des neurones de la neurogénine 2 inductible par la doxycycline (iNGN2) présente un grand potentiel pour les criblages phénotypiques de médicaments à haut débit et les essais de toxicité10,14,15; et des progrès substantiels dans le biotraitement ont été réalisés au cours de la dernière décennie en mettant en œuvre des bioréacteurs pour une expansion et une différenciation évolutivesdes cellules 16,17,18,19. Cependant, la majorité des protocoles de différenciation sont optimisés pour les cultures adhérentes, et la traduction dans un environnement tridimensionnel (3D) nécessite souvent des modifications essentielles. Récemment, l’utilisation réussie d’un bioréacteur 3D de paillasse avec des caractéristiques de contrainte de cisaillement réduites a été rapportée pour l’expansion des CSPhi et pour la différenciation reproductible en hépatocytes, cardiomyocytes et neurones20. Ici, un protocole détaillé pour la génération et la caractérisation des neurones iNGN2 est fourni en utilisant le bioréacteur 3D de paillasse identique.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoéthanol 50 mM</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td></td><td></td>11528926</tr><tr><td>60 mm Nunclon Delta Surface</td><td>Nunc</td><td>734-2040</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-tubuline bêta III [TU-20] (dilution 1:1 000)</td><td>Abcam&nbsp ; &nbsp ;</td><td>AB7751&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Biosystèmes appliqués&nbsp ; Kit de transcription inverse de l’ADNc haute capacité</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td><td></td>10400745</tr><tr><td>Supplément B-27 (50x)&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>11530536</td><td>supplément sans sérum (50x)</td></tr><tr><td>BIONi010-C-13 ligne hiPSC</td><td>Banque européenne pour les cellules souches pluripotentes induites (EBiSC), BIONEER en tant que déposant</td><td>SAMEA103988285</td><td>Bioneer est dépositaire dans EBiSC et propriétaire de la ligne hiPSC.</td></tr><tr><td>Biorendu&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td>Biorender.com</tr><tr><td>BSA Cell Culture grade</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td><td></td>12330023</tr><tr><td>Incubateur 3D CERO & Bioréacteur</td><td>OLS OMNI Life Science</td><td>2800000</td><td></td></tr><tr><td>CEROtubes Tubes de culture cellulaire 50 mL</td><td>OLS OMNI Life Science</td><td>2800005</td><td></td></tr><tr><td>Citavi 6</td><td>Swiss Academic Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Stemcell</td><td>7930</td><td>milieu de congélation contenant 10 % de DMSO</td></tr><tr><td>Cytofix Solution de fixation</td><td>BD Biosciences&nbsp ;</td><td>554655</td><td>solution de fixation contenant 4 % de paraformaldéhyde</td></tr><tr><td>DAPI (NUCBLUE FIXED CELL STAIN)&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td><td></td>12333553</tr><tr><td>Chlorhydrate de doxycycline (DOX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3447</td><td></td></tr><tr><td>DPBS sans calcium ni magnésium (DPBS -/-)&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DPBS avec calcium et magnésium (DPBS +/+)&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>11580456</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (-/-)</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, supplément GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL Core Cell Imaging System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-souris IgG (H+L) de chèvre hautement adsorbé croisé, Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ; &nbsp ;</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>Supplément GlutaMAX</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>35050-038</td><td>L-alanyl-L-glutamine dipeptid stabilisé</td></tr><tr><td>ImageJ 1.51v&nbsp ;</td><td>Institut national de la santé</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution d’insuline humaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278l</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Merck</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAP2 Anticorps monoclonal (dilution 1 : 300)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ; &nbsp ;</td><td>13-1500&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Facteur de croissance réduit, sans rouge de phénol</td><td>Corning Life Science&nbsp ;</td><td>356231</td><td>matrice de membrane basale</td></tr><tr><td>Solution d’acides aminés non essentiels MEM (100x)</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td></td><td></td>11140035</tr><tr><td>Kit de film adhésif optique MicroAmp</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td><td></td>10095714</tr><tr>milieu <td></td><td>de maintenance iPSC sans feeder® mTeSR1 Stemcell1&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplément (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>Supplément sans sérum à base de Bottenstein' s N-1</td></tr><tr><td>Formulation Neurobasale Moyenne</td><td>Gibco</td><td>11570556</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS2</td><td>Nikon Instruments Europe B.V.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoCounter-NC200</td><td>ChemoMetec A/S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin 2021</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de Permanente/Lavage&nbsp ;</td><td>BD Biosciences&nbsp ;</td><td></td><td></td>554723</tr><tr><td>Amorce TUBB3(Hs00801390_s1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Amorce GAPDH (Hs99999905_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Amorce GUSB (Hs99999908_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Amorce HPRT1 (Hs99999909_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Essai d’amorce MAP2 (Hs00258900_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Essai d’amorce MAPT (Hs00902194_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Essai d’amorce POU5F1 (Hs04260367_gH)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine 0,01 %</td><td>Merck</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro Kit (50)-Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td>kit d’isolement de l’ARN sur colonne</td></tr><tr><td>Tampon RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Tampon de lyse cellulaire</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvat (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>12539059</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>11599686</td> enzyme de <td>dissociation cellulaire</td></tr><tr><td>TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIX</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ; &nbsp ;</td><td>11380912</td><td>qPCR master mix</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzym</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>Solution trypsine-EDTA</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Via1-Cassette</td><td>ChemoMetec A/S</td><td>941-0012</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette filtrées à large alésage</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10088880</td><td></td></tr><tr><td>X20 OPTICAL 96WELL FAST CLEAR REACTION PLATES&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15206343</td> Dichlorhydrate d’y-27632<td></td></tr><tr><td>, inhibiteur de la rho kinase (inhibiteur de ROCK)</td><td>Abcam</td><td>ab120129</td><td></td></tr></tbody></table>

production de neurones 2-inductibles de neurogénine humaine dans un bioréacteur en suspension tridimensionnel

Production of Human Neurogenin 2-Inducible Neurons in a Three-Dimensional Suspension Bioreactor

La dérivation de cellules de lignées neuronales à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPhi) a marqué une étape importante dans la recherche sur le cerveau. Depuis leur premier avènement, les protocoles ont été continuellement optimisés et sont maintenant largement utilisés dans la recherche et le développement de médicaments. Cependant, la très longue durée de ces protocoles conventionnels de différenciation et de maturation et la demande croissante de CSPi de haute qualité et de leurs dérivés neuronaux soulèvent la nécessité d’adopter, d’optimiser et de normaliser ces protocoles pour une production à grande échelle. Ce travail présente un protocole rapide et efficace pour la différenciation des hiPSC génétiquement modifiés exprimant la neurogénine 2 inductible par la doxycycline (iNGN2) en neurones à l’aide d’un bioréacteur de suspension tridimensionnel (3D) de paillasse.
En bref, les suspensions unicellulaires de CSPhi iNGN2 ont été autorisées à former des agrégats en 24 heures, et l’engagement de la lignée neuronale a été induit par l’ajout de doxycycline. Les agrégats ont été dissociés après 2 jours d’induction et les cellules ont été cryoconservées ou replaquées pour la maturation terminale. Les neurones iNGN2 générés ont exprimé des marqueurs neuronaux classiques dès le début et ont formé des réseaux neuritiques complexes dans la semaine 1 après le replating, indiquant une maturité croissante des cultures neuronales. En résumé, un protocole détaillé étape par étape pour la génération rapide de neurones dérivés de l’hiPSC dans un environnement 3D est fourni qui présente un grand potentiel comme point de départ pour la modélisation de la maladie, les criblages phénotypiques de médicaments à haut débit et les tests de toxicité à grande échelle.

Au cours des étapes initiales, les cultures adhérentes des CSPh sont détachées, singularisées et transférées en suspension (Figure 2). Les agrégats se forment en 24 heures et grossissent continuellement. Après 2 jours d’induction transgénique, les premiers neurones peuvent être cryoconservés pour des expériences ultérieures.
La prolifération persistante pendant les premiers jours en suspension entraîne une augmentation du nombre de cellules, atteignant son apogée après 2 jours d’induction (Figure 3A,B). Avec la prolifération, les agrégats commencent à croître. Par rapport au jour 0, le diamètre montre une augmentation de 50% au jour 2, et est presque doublé au jour 5 (Figure 3D). Bien qu’un diamètre croissant limite l’apport en nutriments à l’intérieur des agrégats, la viabilité des cellules n’est pas affectée au jour 2 ou au jour 5 de la différenciation (Figure 3C). Cependant, une culture prolongée de plus de 4 jours en suspension n’améliore pas davantage le rendement cellulaire, car les agrégats deviennent de plus en plus résistants à la singularisation enzymatique (Figure 3B).
Lors de la cryoconservation, les cellules du jour 2 sont décongelées et plaquées sur des boîtes enrobées de poly-L-ornithine (PLO)-laminine pour la maturation terminale. En général, les cellules se fixent très bien après la décongélation et commencent à étendre les neurites dès le début. Le profil d’expression génique temporel, ainsi que la coloration immunocytochimique des marqueurs neuronaux TUBB3 et MAP2, confirment l’identité des cellules neuronales (Figure 4A,B). En plus de l’augmentation des niveaux de TUBB3 et MAP2, les cultures neuronales sont enrichies en transcrits tau de protéines associées aux microtubules (MAPT), codant pour une protéine neuronale impliquée dans la stabilisation axonale, et montrent une baisse concomitante de l’expression du facteur de transcription régulateur de la pluripotence POU5F1. De plus, un réseau neuritique dense se forme dans la première semaine après la décongélation (Figure 4C). Ces changements morphologiques, en conjonction avec le profil transcriptionnel, suggèrent une maturation croissante des cultures neuronales.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig02.jpg"> Figure 2 : Génération de neurones iNGN2 dérivés de l’hiPSC à l’aide d’un bioréacteur de paillasse. (A) Aperçu schématique du paradigme de différenciation, mettant en évidence les étapes clés de la culture cellulaire. (B-F) Les images en fond clair visualisent (B) les CSPhi et (C,D) la formation d’agrégats dans le bioréacteur de paillasse. (E,F) Les neurones iNGN2 étendent les neurites et subissent des changements morphologiques au cours de la différenciation. Barre d’échelle = 100 μm. Abréviations : BMM = matrice membranaire basale; iPSC-MM = support de maintenance iPSC; PLO = poly-L-ornithine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig03.jpg"> Figure 3 : Rendement cellulaire et viabilité pendant la formation et la croissance des agrégats. (A) Les images en fond clair montrent la formation d’agrégats dans les 2 jours suivant la culture dans le bioréacteur de paillasse, ainsi que l’augmentation de la taille des agrégats au fil du temps. Barre d’échelle = 500 μm. (B) Quantification du rendement cellulaire et (C) viabilité sur le cours de différenciation. Les diagrammes à barres représentent la moyenne + écart-type de quatre expériences indépendantes. (D) Le diamètre, indicatif de la taille des agrégats, a été déterminé de manière semi-automatique à l’aide du logiciel libre ImageJ (version 1.53). Tout d’abord, les images en fond clair ont été converties en images binaires, puis évaluées à l’aide de l’outil d’analyse des particules, en appliquant les paramètres suivants : taille &gt; 2 500 μm 2, circularité 0,45-1, exclure les bords et inclure les trous. Les lignes horizontales indiquent la moyenne ± écart-type de cinq différenciations indépendantes. Les points simples représentent la moyenne des expériences de différenciation individuelles avec au moins 20 agrégats par point temporel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig04.jpg"> Figure 4 : Caractérisation des neurones iNGN2 dérivés de l’hiPSC. Profil d’expression génique temporel pour les gènes neuronaux TUBB3, MAP2 et MAPT, ainsi que le gène pluripotent associé aux cellules souches POU5F1. Les niveaux d’expression relative ont été normalisés aux gènes de référence GAPDH, HPRT1 et GUSB. Les CSPh indifférenciées (jour-2) ont été choisies comme étalonneur. Les symboles géométriques indiquent la moyenne ± écart-type de quatre différenciations indépendantes. (B) Images représentatives des neurones iNGN2 au jour 7 après la décongélation (jour 2 + 7), colorées pour la bêta-III-tubuline (TUBB3, magenta) et la protéine 2 associée aux microtubules (MAP2, cyan). Les noyaux cellulaires ont été contre-colorés avec du DAPI. Barres d’échelle = 100 μm. (C) Évaluation du réseau neuritique dans des images en fond clair de cultures neuronales après décongélation. La longueur totale des neurites a été déterminée dans une zone de 930,82 × 698,11μm2 à l’aide d’ImageJ (version 1.53). Après avoir ajusté la luminosité et le contraste, les images ont été converties en images 8 bits et les couleurs ont été inversées. Les neurites ont ensuite été squelettées, puis analysées à l’aide des plugins ImageJ « Skeletonize » et « Analyze Skeleton », respectivement. La longueur totale des neurites a été divisée par le nombre de somas dans la région d’intérêt pour obtenir la longueur moyenne des neurites / cellule. Les diagrammes à barres représentent la moyenne + écart-type de trois expériences indépendantes. Abréviations : DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Cet article décrit un protocole pour la génération de neurones induits par l’homme dérivés de cellules souches pluripotentes dans un bioréacteur de suspension 3D de paillasse.

Production de neurones 2-inductibles de neurogénine humaine dans un bioréacteur en suspension tridimensionnel

The derivation of neuronal lineage cells from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) marked a milestone in brain research. Since their first ...

L’utilisation de bioréacteurs pour traduire des cellules souches pluripotentes induites ou des protocoles de culture IPSC de 2D à 3D permet la génération de cellules en grand nombre pour des applications à grande échelle telles que les criblages à haut débit. Ce protocole de différenciation neuronale rapide dans un environnement physiologique 3D améliore les interactions entre les cellules de départ et donne un rendement cellulaire élevé sur une durée plus courte avec une faible variation de lot à = lot, réduisant ainsi les coûts et le temps. La Banque européenne de cellules souches pluripotentes induites applique des approches similaires pour la génération rapide et rentable de cellules différenciées dans plusieurs lignées, y compris d’autres cellules cérébrales et cardiomyocytes.Commencer la pré-culture lorsque la cellule souche pluripotente induite par l’homme, ou culture humaine de CSPi, est confluente à 60 à 80%. Aspirer complètement le milieu des CSPi humaines et rincer doucement les cellules avec 1X DPBS deux fois. Ajouter deux millilitres de solution d’EDTA de trypsine préchauffée à la boîte de Petri de six centimètres et incuber les cellules pendant trois minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur.Ensuite, tapotez doucement la vaisselle pour faciliter le détachement cellulaire ou incuber pendant une à deux minutes de plus si les cellules ne se détachent pas. Ensuite, remettez les cellules en suspension dans chaque boîte en ajoutant cinq millilitres de milieu de maintenance IPSC sans alimentation avec inhibiteur ROCK. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres ou 50 millilitres et mélanger délicatement par pipetage pour assurer la singularisation de la cellule.Déterminez le nombre de cellules dans 100 microlitres de suspension cellulaire à l’aide d’un compteur de cellules automatisé et transférez le volume souhaité de suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres. Centrifuger les cellules à 300 G pendant trois minutes. Ensuite, aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans deux millilitres de milieu de maintenance IPSC sans alimentation avec inhibiteur de ROCK.Remplissez chaque tube de 50 millilitres avec 18 millilitres du milieu. Ensuite, distribuez 20 millilitres de suspension cellulaire dans chaque tube de bioréacteur. Placez les tubes dans le système de bioréacteur et réglez les paramètres de culture pour une durée illimitée.Démarrez le programme de pré-culture via l’affichage du bioréacteur. Pour changer le milieu le lendemain, laissez l’agrégat se déposer dans les tubes du bioréacteur pendant environ cinq minutes avant d’aspirer soigneusement le surnageant. Ajouter 15 millilitres de milieu de maintenance IPSC frais sans alimentation sans inhibiteur de ROCK par tube et poursuivre la culture dans le bioréacteur de paillasse pendant 24 heures.Pour commencer la différenciation neuronale, laissez l’agrégat se déposer dans les tubes du bioréacteur et aspirez soigneusement le surnageant des cellules, laissant environ cinq millilitres de surnageant dans le tube. Ensuite, ajoutez 35 millilitres de milieu d’induction neuronale composé de milieu neurobasal et deux microgrammes par millilitre de doxycycline. Replacez les tubes dans le bioréacteur de paillasse et poursuivez la culture.Effectuez des changements de média tous les jours pendant deux jours, comme démontré précédemment. Après avoir aspiré le surnageant comme indiqué précédemment, transférer les agrégats dans un tube stérile de 15 millilitres ou 50 millilitres et rincer doucement les agrégats deux fois avec DPBS. Aspirez soigneusement le surnageant autant que possible sans déranger les agrégats.Ensuite, ajoutez deux à cinq millilitres d’enzyme de dissociation cellulaire préchauffée à la pastille, selon la taille de la pastille, et incuber les cellules pendant environ 10 minutes à 37 degrés Celsius dans un bain-marie. Remettez doucement en suspension les agrégats sédimentés toutes les deux minutes jusqu’à ce qu’ils se dissocient. Ajouter le milieu neurobasal préchauffé, trois fois le volume de l’enzyme de dissociation cellulaire précédemment ajoutée, et remettre les cellules en suspension avec précaution pour assurer la singularisation cellulaire.Déterminer le nombre de cellules et transférer le volume correspondant de suspension cellulaire pour la cryoconservation dans un tube de 15 millilitres ou 50 millilitres. Centrifuger vers les cellules à 300 G pendant trois minutes. Aspirer le surnageant et remettre doucement en suspension la pastille cellulaire dans le volume correspondant du milieu de congélation contenant 10% de diméthylsulfoxyde.Aliquote la suspension cellulaire dans des flacons appropriés pour la cryoconservation. Transférer immédiatement les flacons dans un récipient de congélation pré-réfrigéré à taux lent rempli de 2-propanol et placer le récipient à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit. Placez les flacons à moins 150 degrés Celsius le lendemain pour un stockage à long terme.Après que les cultures adhérentes des CSPi humaines ont été détachées, singularisées et transférées en suspension, les agrégats se sont formés en 24 heures et ont continué à croître. Après deux jours d’induction transgénique, les premiers neurones pouvaient être cryoconservés pour une maturation ultérieure. Une prolifération persistante des CSPi humaines pendant les premiers jours en suspension a été observée, et le nombre de cultures cellulaires a culminé après deux jours d’induction.Cependant, une culture prolongée de plus de quatre jours en suspension n’a pas amélioré le rendement cellulaire, car les agrégats sont devenus de plus en plus résistants à la singularisation enzymatique. De plus, par rapport au jour zéro, le diamètre total a augmenté de 50% le deuxième jour et a presque doublé le cinquième jour. Bien que l’augmentation du diamètre limite l’apport de nutriments aux agrégats, la viabilité des cellules n’a pas été affectée le deuxième ou le cinquième jour de différenciation.Le profil d’expression génique temporel ainsi que la coloration immunochimique des marqueurs neuronaux bêta trois tubuline et protéine associée aux microtubules, ou MAP2, ont confirmé l’identité cellulaire neuronale des cellules cryopréservées du deuxième jour. De plus, les cultures neuronales ont été enrichies en transcrits de protéine tau associés aux microtubules, ou MAPT, et ont montré une baisse concomitante de l’expression du facteur de transcription régulateur de la pluripotence POU5F1 Un réseau neuritique dense s’est formé au cours de la première semaine après la décongélation, ce qui suggère également une maturation croissante des cultures neuronales. Ce protocole jette les bases de la traduction en bioréacteurs à grande échelle et entièrement automatisés, qui montrent une nouvelle augmentation significative de la capacité de production cellulaire pour de futures applications à grande échelle.Une fois prouvée avec la neurogénine 2, l’utilisation de facteurs de transcription déterminants linéaires pour accélérer la différenciation a été appliquée à de nombreux types de cellules et de maladies différentes pour faciliter la modélisation des CSPi.

production-human-neurogenin-2-inducible-neurons-three-dimensional

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Nous avons établi un protocole pour l'induction de neuroblastes direct pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines maintenues dans des conditions définies avec de petites molécules, qui permet la dérivation d'une offre importante de progéniteurs neuronaux humains et neuronale types de cellules dans le développement du SNC pour les neurones de réparation.

Dérivation efficace des ressources humaines progéniteurs neuronaux et des neurones à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

Nous décrivons ici l'utilisation d'un auto-assemblage en 3 dimensions d'échafaudage à la culture humaine cellules progénitrices neurales. Nous présentons un protocole visant à libérer les cellules de la échafaudages pour être analysés ultérieurement, par exemple par cytométrie en flux. Ce protocole pourrait être adapté à d'autres types cellulaires pour effectuer des études détaillées de façon mécaniste.

La culture de cellules progénitrices neurales humaines dans un hydrogel en 3 dimensions Peptide auto-assemblage

Les protocoles de différenciation neuronale des cellules souches humaines pluripotentes (hPSCs) sont souvent beaucoup de temps et nécessitera d'importantes compétences de culture cellulaire. Ici, nous avons adapté une procédure de différenciation petite molécule à base d'un format de plaque multititre, permettant la génération simple, rapide et efficace des neurones humains d'une manière contrôlée.

Génération rapide et efficace des neurones à partir de cellules souches pluripotentes humaines dans un format plaque Multititre

Cette vidéo démontre la différenciation des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) en neurones dopaminergiques, afin de fournir un modèle pour l'étude de la maladie de Parkinson. Les CSEh sont cultivées dans un milieu d’induction neuronale dans une plaque de micropuits pour former des neurosphères 3D. Ceux-ci sont ensuite cultivés dans un milieu d’induction neuronale pour favoriser la différenciation en neurones progéniteurs dopaminergiques. La maturation finale des neurones se produit...

Génération d’organoïdes neuronaux dopaminergiques à partir de cellules souches embryonnaires humaines

Épines dendritiques des neurones pyramidaux sont les sites de la plupart des synapses excitatrices de cortex cérébral de mammifère. Cette méthode décrit une analyse quantitative 3D de la morphologie de la colonne vertébrale dans les neurones pyramidaux du cortex glutamatergiques humaines dérivées de cellules souches pluripotentes induites.

Quantification tridimensionnelle d&#39;épines dendritiques de Pyramidal neurones humains induits Dérivé de cellules souches pluripotentes

Reprogrammation neuronale directe génère des neurones qui maintiennent l’âge de la cellule somatique départ. Nous décrivons ici une méthode basée sur un vecteur unique pour générer des neurones induites de fibroblastes dermiques provenant de donneurs humains adultes.

Génération simple d’une Culture de haut rendement de neurones induits des fibroblastes de la peau humaine adulte

Dans ce protocole, nous avons pour objectif de décrire une méthode reproductible pour les neurones de cellules souches dérivées pluripotentes humaines combinant dissociée et astrocytes ensemble en 3D sphère cocultures, maintenir ces sphères dans des conditions de flottement libres et par la suite mesure de l’activité synaptique circuit des sphères avec immunoanalyse et enregistrements multiélectrodes tableau.

Modélisation de Microcircuit synaptique avec 3D Cocultures d’Astrocytes et les neurones des cellules souches pluripotentes humaines

Cette étude introduit et décrit des protocoles pour dériver deux organoïdes neuronaux humains spécifiques comme modèle pertinent et précis pour étudier 1) le développement humain de glioblastoma dans les organoïdes neuronaux humains exclusivement chez l'homme et 2) dopaminergique neuronal différenciation générant un organoïde tridimensionnel.

Organoïdes neuronaux humains pour étudier le cancer du cerveau et les maladies neurodégénératives

Ce protocole fournit une procédure complète pour fabriquer l’organoïde humain de nerf moteur iPS cellule-dérivée par l’assemblage spontané d’un faisceau robuste d’axones étendus d’un sphéroïde dans une puce de culture de tissu.

Génération organoïde tridimensionnelle de nerf moteur

Les interactions neurone-gliale dans la neurodégénérescence ne sont pas bien comprises en raison d’outils et de méthodes inadéquats. Ici, nous décrivons des protocoles optimisés pour obtenir des neurones induits, des cellules précurseurs d’oligodendrocytes et des oligodendrocytes à partir de cellules souches pluripotentes humaines et fournissons des exemples des valeurs de ces méthodes dans la compréhension des contributions spécifiques au type cellulaire dans la maladie d’Alzheimer.

Génération de neurones humains et d’oligodendrocytes à partir de cellules souches pluripotentes pour la modélisation des interactions neurone-oligodendrocytes

Nous présentons ici un protocole pour produire des cocultures bio-imprimées en 3D de neurones et d’astrocytes dérivés d’iPSC. Ce modèle de coculture, généré à l’intérieur d’un échafaudage d’hydrogel dans des formats de 96 ou 384 puits, démontre une viabilité post-impression élevée et une croissance des neurites en 7 jours et montre l’expression de marqueurs de maturité pour les deux types de cellules.

Bio-impression tridimensionnelle de cocultures neurones-astrocytes humaines dérivées d’iPSC pour des applications de criblage

Découvrez la différenciation neuronale rapide de cellules iPS humaines dans un bioréacteur 3D en suspension. Cette méthode offre un rendement élevé avec faible variabilité inter-lots pour des applications à grande échelle.

Production de neurones 2-inductibles de neurogénine humaine dans un bioréacteur en suspension tridimensionnel

Explorer plus de vidéos